鄭超榮,胡瑩冰,2,譚雨晴,雍玉冰,巢 瑾,張 哲,陳 燕,金曉玲*

1中南林業(yè)科技大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院,長沙 410004;2浙江廣廈建設(shè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)建筑工程學(xué)院,東陽 322100;3湖南省茶業(yè)集團(tuán)股份有限公司,長沙 410126

花香是指由植物花朵中釋放出的一系列分子量低、揮發(fā)性強(qiáng)的芳香物質(zhì)而組成的復(fù)雜混合物。適宜濃度的花香對人體身心健康有積極影響。因而,花香也被譽(yù)為“花卉的靈魂”,是植物重要的觀賞性狀之一[1]?；ǘ鋼]發(fā)性成分的提取方法主要有蒸餾法、有機(jī)溶劑提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法、頂空固相微萃取法(HS-SPME)和同時蒸餾萃取法等。頂空固相微萃取法由于操作簡單、樣品用量少、成本低、應(yīng)用范圍廣、實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點而被廣泛采用[2]?；〒]發(fā)性成分的測定方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-離子遷移譜、氣相色譜-嗅聞和電子鼻技術(shù)等。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)所需樣品量少、靈敏度高、檢測速度快,其在植物揮發(fā)性成分中廣受歡迎[3]。目前,國內(nèi)外大多是采用HS-SPME-GC-MS來測定植物花揮發(fā)性成分的組成。

含笑屬(Michelia)植物是著名的芳香植物,其花、葉和枝條等部位均具有豐富的芳香化合物。目前,對含笑屬植物提取物的大量研究已證實,其具有保鮮、抑菌、抗癌和抗氧化等功能,因而被廣泛應(yīng)用在食品保鮮、香料和醫(yī)藥等領(lǐng)域[4]。值得注意的是,花作為植物的繁殖器官,其揮發(fā)性成分十分豐富[5]。已有研究對含笑屬的白蘭[6]、含笑[7]、深山含笑[8]和黃蘭[9]等樹種進(jìn)行了花朵揮發(fā)性成分分析。

闊瓣含笑(M.platypetala)是木蘭科含笑屬常綠喬木,花色純白,花香濃郁,是湖南地區(qū)的鄉(xiāng)土樹種,也是一種優(yōu)良的園林觀賞植物[10,11]。對于闊瓣含笑的研究,現(xiàn)多集中在生理特性[12]、栽培繁育[13]和雜交育種[14]等方面,對其花香成分的解析目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。‘粉蘊(yùn)’含笑(M.platypetalaFenyun)是由中南林業(yè)科技大學(xué)從闊瓣含笑中通過實生選育的方法培育的新品種(品種權(quán)號20190034),其主要特點是:花期早(1月底或2月初)、花型優(yōu)美、花香濃郁,具有很高的觀賞價值和開發(fā)利用潛力[15]。本研究以‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期(花蕾期、初開期、盛開期)下的不同花器官(花被片、雄蕊、雌蕊)為研究對象,采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)檢測其花朵揮發(fā)性成分,并通過主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA),探討‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期下不同花器官的揮發(fā)性成分釋放規(guī)律。本研究可為后續(xù)‘粉蘊(yùn)’含笑的景觀應(yīng)用和揮發(fā)性成分的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料‘粉蘊(yùn)’含笑(Micheliaplatypetala‘Fenyun’)栽植于湖南省林業(yè)科技示范園,位于長沙市南郊。其長勢良好,無病蟲害。于2023年2月20日在‘粉蘊(yùn)’含笑開花期間,晴朗的上午分別從樹冠東南西北四個方向隨機(jī)采集3個不同開花時期的花朵,即花蕾期S1(花苞片開裂,露出上表面白色,下部淡紅色的花被片)、初開期S2(花被片微展開,雄蕊無散粉)、盛開期S3(花被片展開,雄蕊大量散粉)。采摘后迅速分離花被片(T)、雄蕊(S)和雌蕊(P)(見圖1)于5 mL凍存管中,隨后立即放入-196 ℃液氮中冷凍,用液氮罐運送到湖南省茶業(yè)集團(tuán)股份有限公司進(jìn)行揮發(fā)性成分的測定。

圖1 ‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期的3個花器官(花被片、雄蕊、雌蕊)Fig.1 Three flower organs (tepal,stamen and pistil) of M.platypetala ‘Fenyun’ at different flowering stages

1.2 實驗儀器與設(shè)備

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);手動固相微萃取進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(美國Supelco公司)。

1.3 樣品前處理和進(jìn)樣處理

取3個開花時期的花被片、雄蕊和雌蕊,用液氮將其快速研磨成粉末,混勻后稱取5 g放進(jìn)20 mL頂空瓶中,同時加入10 μL 0.0802 mg/mL的內(nèi)標(biāo)4-甲基-2-戊醇,密封進(jìn)樣,每個樣品進(jìn)行三次獨立的重復(fù)。

將頂空瓶置于60 ℃下平衡10 min,SPME固相微萃取頭萃取前在氣相色譜儀的進(jìn)樣口250 ℃老化30 min,再插入加熱平衡后的頂空瓶進(jìn)行頂空萃取40 min,提取結(jié)束后,將固相微萃取頭立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口,在250 ℃解析5 min。

1.4 氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)條件

色譜條件:以氦(99.999%)為載氣,流速為1 mL/min,不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣口溫度250 ℃。初始溫度70 ℃,持續(xù)5 min,以15 ℃/min的速度升至100 ℃,接著以5 ℃/min的速度升至125 ℃,然后以2 ℃/min的速度升至150 ℃,最后以20 ℃/min的速度升至280 ℃,并在280 ℃下保持4 min。

質(zhì)譜條件:電子電離源,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度150 ℃,質(zhì)譜掃描范圍m/z30～500;傳輸線溫度280 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過AnalysisBaseFileConverter 軟件將采集的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成abf格式導(dǎo)入MS-DIAL4軟件,選擇合適的質(zhì)譜圖作為參比譜圖,進(jìn)行目標(biāo)峰的提取、匹配和對齊,以NIST 20數(shù)據(jù)庫的質(zhì)譜信息和保留指數(shù)(retention index,RI)信息,匹配度>80為標(biāo)準(zhǔn),對質(zhì)譜峰進(jìn)行定性。用內(nèi)標(biāo)4-甲基-2-戊醇的峰面積校正各代謝物峰面積?；衔锏亩坎捎梅迕娣e歸一法計算,揮發(fā)性成分的含量計算公式為:揮發(fā)性成分含量(mg/kg)=(待測化合物的峰面積×內(nèi)標(biāo)濃度×內(nèi)標(biāo)體積)/(內(nèi)標(biāo)的峰面積×樣品質(zhì)量)。使用Microsoft Excel 2021對揮發(fā)性成分的種類、相對含量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用GraphPad Prism 8繪圖,使用SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。

2 實驗結(jié)果

2.1 ‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期花器官揮發(fā)性成分的鑒定和相對含量分析

對‘粉蘊(yùn)’含笑花揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析,將其總離子流圖(見圖2)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,并查閱相關(guān)文獻(xiàn),最終鑒定出93種揮發(fā)性成分,包括萜烯類化合物43種(單萜類25種,倍半萜烯類18種)、烷烴類化合物11種、酯類化合物9種、醛類和醇類化合物各8種、烯烴類和酮類化合物各4種、醚類和芳香族化合物各2種、酚類和雜環(huán)類各1種(見表1)。其中,萜烯類數(shù)量最多,烷烴類和酯類次之。可見,‘粉蘊(yùn)’含笑花朵揮發(fā)性成分組成豐富,萜烯類和烷烴類是其最主要的種類構(gòu)成。

表1 ‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期花器官揮發(fā)性成分種類及相對含量

圖2 ‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期花器官揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of volatile constituents in flowering organs of M.platypetala ‘Fenyun’ at different flowering stages

2.1.1 花被片的揮發(fā)性成分種類和相對含量

在3個不同開花時期的花被片中共鑒定出72種揮發(fā)性物質(zhì),其中花蕾期66種、初開期67種、盛開期71種,主要成分是烷烴類,有7種,在3個開花時期的相對含量分別為66.91%、68.91%、62.59%(見表1)。由圖3可知,花被片中相對含量大于2%的揮發(fā)性成分有8種,按相對含量大小排序依次為2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、β-異可烯、γ-杜松烯、1,2-二甲氧基苯、3,9-愈創(chuàng)木二烯、δ-欖香烯和2-甲氧基苯酚。其中,烷烴類化合物2,6,10-三甲基十四烷和異十六(碳)烷均在初開期達(dá)到最大值,相對含量分別為33.34%和33.13%。萜烯類化合物γ-杜松烯、β-異可烯、3,9-愈創(chuàng)木二烯和δ-欖香烯在盛開期相對含量最高。乙酸桃金娘烯酯是花被片中的特異性成分。

圖3 ‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期花器官中揮發(fā)性成分的相對含量(>2%)Fig.3 Relative content of volatile components (>2%) in the floral organs of M.platypetala‘Fenyun’at different flowering stages

2.1.2 雄蕊的揮發(fā)性成分種類和相對含量

在3個不同開花時期的雄蕊中共鑒定出86種揮發(fā)性物質(zhì),其中花蕾期82種、初開期83種、盛開期80種,主要成分為萜烯類化合物,有42種,在3個開花時期的相對含量分別為68.81%、56.44%、59.60%(見表1)。由圖3可知,雄蕊中相對含量大于2%的揮發(fā)性成分有10種,按相對含量大小排序依次為2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、γ-杜松烯、β-異可烯、3,9-愈創(chuàng)木二烯、δ-欖香烯、1,2-二甲氧基苯、(+)-香橙烯、β-蒎烯和α-雪松烯。萜烯類化合物在花蕾期相對含量達(dá)到最大值,烷烴類化合物相對含量在初開期均高于花蕾期和盛開期。與花被片進(jìn)行對比,雄蕊中烷烴類化合物相對含量有所下降,萜烯類化合物相對含量上升。此外,傘形花酮、木薄荷衍生物和反-2-辛醛是雄蕊中的特異性成分。

2.1.3 雌蕊的揮發(fā)性成分種類和相對含量

在3個不同開花時期雌蕊中共鑒定出86種揮發(fā)性物質(zhì),其中花蕾期78種、初開期77種、盛開期81種?；ɡ倨诤褪㈤_期雌蕊中萜烯類化合物相對含量最高,相對含量分別為57.59%、62.82%。初開期雌蕊中烷烴類化合物相對含量最高,相對含量為54.52%(見表1)。由圖3可知,雌蕊中相對含量大于2%的揮發(fā)性成分有11種,按相對含量大小排序依次為2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、γ-杜松烯、1,2-二甲氧基苯、3,9-愈創(chuàng)木二烯、δ-欖香烯、(+)-香橙烯、α-雪松烯、β-異可烯、β-蒎烯和龍腦乙酸酯。2,6,10-三甲基十四烷和異十六(碳)烷在初開期相對含量達(dá)到最大值,占比為26.20%和25.90%。雌蕊中相對含量大于2%的化合物均比花被片和雄蕊中多。γ-杜松烯在萜烯類化合物中相對含量最高,在3個不同開花時期占比分別為18.38%、10.04%和18.68%。別羅勒烯、十二烷、甲酸法呢酯、己醇和3,4-二氫-2H-吡喃是雌蕊中的特異性成分。

2.2 揮發(fā)性成分的釋放量分析

由圖4可知,花被片中的揮發(fā)性成分含量最高,雄蕊次之,雌蕊最低。隨著花朵的開放,3個開花時期的花被片揮發(fā)性成分含量呈顯著下降趨勢,雄蕊在3個開花時期沒有顯著差異,而雌蕊的揮發(fā)性成分含量在花蕾期顯著高于初開期和盛開期,但初開期和盛開期沒有顯著差異。由此,‘粉蘊(yùn)’含笑在花蕾期揮發(fā)性成分釋放量最高,3種花器官中花被片的揮發(fā)性成分含量最高。

圖4 ‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期花器官中揮發(fā)性成分的釋放量Fig.4 Volatile component release from organs of M.platypetala ‘Fenyun’ at different flowering stages

2.3 揮發(fā)性成分的PCA和PLS-DA分析

為進(jìn)一步分析‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期花器官揮發(fā)性成分的差異,本研究采用PCA對‘粉蘊(yùn)’含笑各樣品揮發(fā)性成分的相對含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明,主成分1和主成分2的方差貢獻(xiàn)率分別為57.40%和21.40%,說明這兩個主成分包含了所有樣品中的大部分信息?；ɡ倨凇⒊蹰_期、盛開期花被片與主成分1呈正相關(guān),花蕾期、初開期、盛開期雄蕊與主成分1呈負(fù)相關(guān),花蕾期、初開期、盛開期雌蕊與主成分2呈正相關(guān),表明3種花器官(T、S、P)之間區(qū)分良好,不同花器官的揮發(fā)性成分有較大差異;同種花器官3個開花時期(S1、S2、S3)的樣品較為靠近,表明同種花器官不同時期的揮發(fā)性成分差異較小(見圖5A)。

圖5 ‘粉蘊(yùn)’含笑3種花器官的PCA與PLS-DA分析Fig.5 PCA and PLS-DA analysis of three flower organs of M.platypetala ‘Fenyun’

從PCA的載荷圖(見圖5B)可知,2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、十三烷、十七烷、水楊酸甲酯、十七烯、十六碳烯和2-甲氧基苯酚等與主成分1有較大的正相關(guān)。δ-欖香烯、α-雪松烯、3,9-愈創(chuàng)木二烯、古巴烯、月桂烯、γ-杜松烯和2-羥基醋酸樟香醇等與主成分1有較大的負(fù)相關(guān)。檸檬醛、香茅醇、龍腦乙酸酯、莰烯、桉油精、(+)-表雙環(huán)倍半水芹烯和(+)-香橙烯等與主成分2有較大的正相關(guān)。由此可知,2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、十三烷、香茅醇、龍腦乙酸酯和莰烯是導(dǎo)致花被片和雌蕊差異較大的物質(zhì),δ-欖香烯、α-雪松烯、3,9-愈創(chuàng)木二烯和γ-杜松烯是導(dǎo)致雄蕊有別于花被片和雌蕊的化合物。

為進(jìn)一步得出不同開花時期花器官中的差異揮發(fā)性化合物,采用PLS-DA對揮發(fā)性成分進(jìn)行判別分析,計算變量投影重要度(variable importance in projection,VIP)可以衡量揮發(fā)性成分對各樣品的影響強(qiáng)度。從PLS-DA模型VIP得分圖(見圖5C)可知,共有12種揮發(fā)性成分可以作為區(qū)分3種花器官的差異性物質(zhì)(VIP>1),包括β-異可烯、γ-杜松烯、2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、1,2-二甲氧基苯、(+)-香橙烯、3,9-愈創(chuàng)木二烯、龍腦乙酸酯、芳樟醇、β-蒎烯、δ-欖香烯和2-甲氧基苯酚。其中2,6,10-三甲基十四烷、6-甲基十五烷和2-甲氧基苯酚在3個開花時期的花被片中的相對含量較高,β-異可烯、3,9-愈創(chuàng)木二烯、芳樟醇、β-蒎烯和δ-欖香烯在3個開花時期的雄蕊中相對含量較高,γ-杜松烯、1,2-二甲氧基苯、(+)-香橙烯和龍腦乙酸酯在3個開花時期的雌蕊中相對含量較高。

3 討論與結(jié)論

花香是一種重要的次生代謝物,它由各種低分子量的化合物組成,含有特定的化學(xué)信息[16]?；ㄆ鞴偬鼗南贍畋砥ぜ?xì)胞或基本薄壁組織細(xì)胞通常是產(chǎn)生植物香味的地方[17]。在含笑屬植物中,亮葉含笑花被片的主要成分為異長葉烯-5-酮[18],紫花含笑花被片中的主要成分為α-愈創(chuàng)木烯[19],含笑花被片中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的相對含量高達(dá)83.26%[7]?！厶N(yùn)’含笑花被片中的主要成分為2.6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷?？梢娫谕瑢僦参锵嗤ㄆ鞴僦g,花被片揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分也有很大差異。揮發(fā)性成分的合成與釋放可能受植物基因型和環(huán)境條件的共同影響。在未來的研究中,可基于這兩種揮發(fā)性成分開發(fā)利用‘粉蘊(yùn)’含笑花被片。

γ-杜松烯、3,9-愈創(chuàng)木二烯、δ-欖香烯和(+)-香橙烯是‘粉蘊(yùn)’含笑雄蕊和雌蕊中萜烯類化合物的主要揮發(fā)性成分。其中γ-杜松烯可用于調(diào)制柑橘、芒果等食用香精[20]。研究表明萜類物質(zhì)是植物釋放最多的一類化合物,有良好的殺菌消毒、降低人體血壓、使人鎮(zhèn)靜放松的作用[21]。此外,‘粉蘊(yùn)’含笑鑒定出的93種揮發(fā)性成分中,萜烯類物質(zhì)的種類最為豐富有43種,與前人研究結(jié)果一致,盛花期西藏虎頭蘭花朵中共鑒定出89種揮發(fā)性成分,萜烯類化合物種類最多有26種[22]。紫玉蘭鮮花檢測出的43種成分中,有22種是萜烯類化合物[8]。作為優(yōu)良的芳香植物,‘粉蘊(yùn)’含笑可廣泛應(yīng)用在康復(fù)花園等健康景觀中,從而為人體的身心健康提供幫助。

目前關(guān)于不同花期的花器官揮發(fā)性成分含量變化特點的研究報道較少,不同花器官的揮發(fā)性成分含量與花期顯著相關(guān)。紫花含笑的花揮發(fā)性成分釋放量在盛開期最高,在不同開花時期中雌蕊的揮發(fā)性成分含量最高[3,23]‘白蘭地’海棠在4個開花時期中,雌蕊的揮發(fā)性成分總釋放量最高,花瓣最低,揮發(fā)性成分的總釋放量在盛開期達(dá)到最高[24]。岳麓連蕊茶與單體紅山茶花揮發(fā)性成分含量在盛開期達(dá)到頂峰,且雄蕊是不同花期釋放香氣的主要花器官[25]。本研究表明,‘粉蘊(yùn)’含笑的花揮發(fā)性成分釋放量在花蕾期最高,不同開花時期中花被片的揮發(fā)性成分含量最高,其次是雄蕊,雌蕊最低。因此不同的植物花香釋放有不同的規(guī)律,可能與吸引不同的傳粉昆蟲有關(guān)[26]?！厶N(yùn)’含笑在3個不同開花時期中,3種花器官的揮發(fā)性成分的相對含量并未呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化。如花被片和雌蕊中醇類化合物在盛開期達(dá)到最大值,雄蕊中其在花蕾期達(dá)到最大值?；ㄆ鞴俨煌_花時期的花揮發(fā)性成分的變化,可能受光照、溫度和激素的共同影響[27]。

本研究采用頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)從‘粉蘊(yùn)’含笑不同開花時期的不同花器官中共鑒定出93種揮發(fā)性物質(zhì)。2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、γ-杜松烯和β-異可烯是‘粉蘊(yùn)’含笑開花過程中的主要揮發(fā)性成分,不同花器官的揮發(fā)性成分存在差異,花被片是其揮發(fā)性成分釋放的主要花器官。本研究為進(jìn)一步開發(fā)利用‘粉蘊(yùn)’含笑中的揮發(fā)性成分提供了數(shù)據(jù)支持。