范錫玲,曹彥剛,焦新棉,鄭曉珂,馮衛(wèi)生

河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心,鄭州 450046

中麻黃(EphedraintermediaSchrenk et C.A.Mey.)是2020版《中國藥典》收錄的三種藥用麻黃之一[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品,味辛,微苦,歸肺和膀胱經(jīng),具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫的功效[2,3]。中麻黃主要分布在我國新疆、內(nèi)蒙古、西藏等省區(qū),以西北地區(qū)常見,生長在海拔數(shù)百米至兩千多米的干旱荒漠、沙灘地區(qū)及干旱的山坡或草地上,對維持生態(tài)環(huán)境的平衡具有重要作用,被譽為“大漠之寶”[4]。20世紀末,中麻黃多處于野生狀態(tài),種植品少見,同時,農(nóng)牧民采取“斬草除根”式的采收方式,以及各企業(yè)對麻黃資源的爭奪導(dǎo)致中麻黃野生資源遭到了極大破壞,目前中麻黃已經(jīng)被列入第二批《國家重點保護野生藥材物種名錄》[5]。隨著種植技術(shù)的不斷發(fā)展以及對現(xiàn)有的天然資源的保護,中麻黃也逐漸在寧夏、內(nèi)蒙古和新疆等地形成了規(guī)范化的種植,資源匱乏的現(xiàn)象已得到了改善。

現(xiàn)代研究表明,麻黃所含化學(xué)成分主要有生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油、木脂素類以及多糖類物質(zhì)[1,6],具有抗炎、抗哮喘、免疫抑制、抗腫瘤等[7]藥理作用。因此,基于前期本課題組對草麻黃和木賊麻黃化學(xué)成分的研究[1,8],也為了進一步闡明和發(fā)掘中麻黃的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),現(xiàn)對中麻黃的50%丙酮提取物進行化學(xué)成分研究,并對所得單體化合物進行體外抗哮喘活性評價,以期進一步豐富中麻黃的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500型核磁共振儀(德國布魯克公司);Bruker maxis HD型飛行時間質(zhì)譜(德國布魯克公司);賽譜銳思LC52型高壓制備液相色譜儀(賽譜銳思北京科技有限公司);Thermo EVO300紫外分光光度計(Thermo Scientific,USA)型紫外檢測器;Autopol IV全自動旋光儀(美國魯?shù)婪蚬?;YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm×20 mm,5 μm,日本YMC有限公司);Multiskan MK3酶標儀(美國Thermo Fisher公司);Operetta CLS高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)(美國珀金埃爾默公司)。

柱色譜填料Sephadex LH-20(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);Toyopearl HW-40C(日本TOSOH公司);ODS(40～60 μm,日本YMC有限公司);MCI gel CHP-20、大孔樹脂Diaion HP-20(日本三菱化學(xué)公司);薄層色譜硅膠GF 254、柱色譜硅膠(100～200目、200～300目,青島海洋化工廠);大鼠嗜堿性細胞白血病細胞株(RBL-2H3)(北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司);TrintonX-100(批號:1109F0518,北京索萊寶科技有限公司);EMEM培養(yǎng)基(Gibco Invitrogen公司);氨芐青霉素(批號:3230426002)、鏈霉素(批號:5220726003)、C48/80(批號:0000220011)、4-硝基苯基-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖(批號:102547763,純度≥99%)(Sigma公司);甲醇(色譜純,天津四友精細化學(xué)品有限公司);乙腈(色譜純,美國天地有限公司);其他試劑(分析純,天津恒興化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 植物材料

中麻黃購自新疆西域漠草中藥材開發(fā)有限公司,經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠明教授鑒定為麻黃科植物中麻黃Ephedraintermedia的干燥草質(zhì)莖,植物標本(NO.20201111)保存于河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)提取分離實驗室。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取與分離

取45.0 kg中麻黃的干燥草質(zhì)莖,切段,50%含水丙酮浸泡1周,組織破碎提取2次,減壓濃縮得到總浸膏11.1 kg,加水分散后,依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取若干次后得到二氯甲烷部位(185.0 g)、乙酸乙酯部位(1.37 kg)、正丁醇部位(1.5 kg)和水部位。

二氯甲烷部位(185.0 g)上硅膠柱(100～200目),用石油醚-乙酸乙酯(50∶1、20∶1、10∶1、4∶1、1∶1)以及乙酸乙酯-甲醇(20∶1、10∶1、5∶1)梯度洗脫,得到10個組分(D1～D10)。D7(17.2 g)經(jīng)ODS反相色譜柱,以甲醇-水(10∶90→100∶0)梯度洗脫,得到7個組分(D7-1～D7-7);D7-2(2.6 g)經(jīng)硅膠柱(100～200目),以二氯甲烷-甲醇(350∶1→20∶1)梯度洗脫后得到5個組分(D7-2-1～D7-2-5),其中D7-2-3上Sephadex LH-20凝膠柱,以70%甲醇等度洗脫后得到5個組分(D7-2-3-1～D7-2-3-5),D7-2-3-3又經(jīng)硅膠柱色譜(200～300目)以及HPLC分離純化得到化合物1(乙腈-水26∶74,tR=44.2 min,12.6 mg)、2(乙腈-水30∶70,tR=40.1 min,2.65 mg)、9(甲醇-水38∶62,tR=27.9 min,13.2 mg);D7-2-3-4經(jīng)薄層制備色譜(二氯甲烷-甲醇35:1)得到化合物8(4.6 mg);D7-3(1.7 g)上MCI gel CHP-20柱,以甲醇-水(10∶90→100∶0)梯度洗脫,得到5個組分(D7-3-1～D7-3-5),其中D7-3-3和D7-3-5分別經(jīng)硅膠柱(200～300目)分離后進一步由HPLC純化得到化合物14(乙腈-水24∶76,tR=25.0 min,7.0 mg)和21(乙腈-水27∶73,tR=19.4 min,12.3 mg);D8(12.0 g)上MCI gel CHP-20柱,以甲醇-水(10∶90→100∶0)梯度洗脫,得到6個組分(D8-1～D8-6);D8-2(2.0 g)上硅膠柱(200～300目),以二氯甲烷-甲醇(270∶1→10∶1)梯度洗脫后得到5個組分(D8-2-1～D8-2-5),D8-2-1經(jīng)HPLC(甲醇-水29∶71)粗砍斷得到5個組分(D8-2-1-1～D8-2-1-5),其中D8-2-1-3和D-8-2-1-4分別經(jīng)過HPLC純化得到化合物6(乙腈-水12∶88,tR=45.2 min,13.7 mg)、16(乙腈-水25∶75,tR=23.5 min,44.6 mg);D8-2-1-5經(jīng)制備薄層色譜(二氯甲烷-甲醇35∶1)得到化合物7(4.0 mg);D8-2-2和D8-2-5分別重復(fù)上硅膠柱(200～300目)后經(jīng)HPLC純化得到化合物3(乙腈-水15∶85,tR=22.2 min,1.2 mg)、4(甲醇-水42∶58,tR=26.5 min,1.4 mg);D8-4(1.2 g)上硅膠柱(200～300目),以二氯甲烷-甲醇(200∶1→15∶1)梯度洗脫后得到8個組分(D8-4-1～D8-4-8),其中D8-4-2上Sephadex LH-20凝膠柱,以70%甲醇等度洗脫后又經(jīng)HPLC(乙腈-水71∶29)純化得到化合物12(tR=18.4 min,6.2 mg)和13(tR=22.6 min,11.5 mg);D8-4-5上Toyopearl HW-40C凝膠柱,以甲醇-水(10∶90→100∶0)梯度洗脫后得到4個組分(D8-4-5-1～D8-4-5-4),其中D8-4-5-2和D8-4-5-3分別經(jīng)HPLC純化得到化合物15(乙腈-水26∶74,tR=28.8 min,22.8 mg)和20(甲醇-水41∶59,tR=20.6 min,5.4 mg);D8-4-5-4經(jīng)硅膠柱(200～300目)后進一步通過HPLC(甲醇-水60∶40)純化得到化合物22(tR=28.4 min,17.5 mg)。

乙酸乙酯部位(1.37 kg)上硅膠柱(100～200目),用二氯甲烷-甲醇(25∶1、12∶1、8∶1)以及乙酸乙酯-甲醇(35∶1、15∶1、5∶1、2∶1、0∶1)梯度洗脫后得到11個組分(E1～E11),E-4(24.3 g)上MCI gel CHP-20柱,以甲醇-水(10∶90→100∶0)梯度洗脫,得到5個組分(E4-1～E4-5),E4-3經(jīng)硅膠柱色譜(200～300目),以二氯甲烷-甲醇(25∶1→5∶1)梯度洗脫,得到4個組分(E4-3-1～E4-3-4),其中E4-3-2上硅膠柱(200～300目),以甲醇-乙酸乙酯(100∶1→20∶1)梯度洗脫后得到4個組分(E4-3-2-1～E4-3-2-4),其中E4-3-2-2經(jīng)HPLC(乙腈-水30∶70)純化得到化合物17(tR=19.3 min,2.4 mg)和18(tR=24.1 min,9.2 mg);E4-3-2-4經(jīng)HPLC(甲醇-水10∶90)純化得到化合物19(tR=28.1 min,3.0 mg);E8(89.3 g)上MCI gel CHP-20柱,以甲醇-水(10∶90→100∶0)梯度洗脫,得到6個組分(E8-1～E8-6),E8-2(5.3 g)上Toyopearl HW-40C凝膠柱以甲醇-水(10∶90→100∶0)梯度洗脫,得到5個組分(E8-2-1～E8-2-5),E8-2-2上硅膠柱(200～300目),以乙酸乙酯-甲醇(400∶1→50∶1)梯度洗脫后得到5個組分(E8-2-2-1～E8-2-2-5),其中E8-2-2-1和E8-2-2-4分別經(jīng)HPLC純化得到化合物5(乙腈-水8∶92,tR=20.1 min,17.8 mg)、10(乙腈-水10∶90,tR=20.6 min,12 mg)、11(乙腈-水10∶90,tR=24.6 min,3.7 mg)。

1.3.2 體外抗哮喘活性評價

肥大細胞是參與哮喘的核心效應(yīng)細胞,哮喘時會發(fā)生肥大細胞脫顆粒,即β-氨基己糖苷酶(β-aminohexosidase)、組胺(histamine)等的釋放,在哮喘的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。大鼠嗜堿性細胞白血病細胞株(RBL-2H3)能夠模擬哮喘中肥大細胞活化脫顆粒。本實驗采用C48/80誘導(dǎo)RBL-2H3細胞脫顆粒,加入從中麻黃中分離純化得到的單體化合物進行干預(yù)。利用底物顯色法檢測β-Hex釋放率,從而篩選出抗哮喘活性成分。

將RBL-2H3細胞置于含有15% FBS的EMEM培養(yǎng)基中,于5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期,按照細胞密度為3×104個/mL接種于96孔板中,24 h后分為正常組、模型組(C48/80,30 μg/mL)、給藥組(10 μmol/L單體化合物+C48/80,30 μg/mL)以及總酶組(1% Trinton X-100)。藥物及C48/80溶液均用臺式液配制,另外設(shè)3～5個空白孔(不含細胞,單加臺式液)。刺激30 min后,取50 μL細胞上清,加入50 μL 1 mmol/L的β-氨基己糖苷酶底物溶液,37 ℃孵育1 h,加入150 μL Na2CO3/NaHCO3終止液終止反應(yīng),酶標儀405 nm下檢測吸光度按公式(1)計算β-Hex釋放率(R)。

R=(A1-A2)/(A3-A2)×100%

(1)

式中,A1:實驗組上清液吸光度;A2:空白孔上清液吸光度;A3:總酶孔上清液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色晶體(甲醇);ESI-MS:m/z179 [M+H]+,分子式為C10H10O3。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.66(2H,d,J=8.8 Hz,H-2,6),6.87(2H,d,J=8.8 Hz,H-3,5),6.83(1H,d,J=12.8 Hz,H-7),5.81(1H,d,J=12.8 Hz,H-8),3.80(3H,s,4-OCH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:133.1(C-1),128.9(C-2,6),114.4(C-3,5),161.9(C-4),143.3(C-7),118.4(C-8),170.3(C-9),55.7(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道一致,確定化合物為4-甲氧基肉桂酸。

化合物2白色晶體(甲醇);ESI-MS:m/z149 [M+H]+,分子式為C9H8O2。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.66(1H,d,J=16.0 Hz,H-7),7.58(2H,m,H-2,6),7.40(3H,m,H-3,4,5),6.47(1H,d,J=16.0 Hz,H-8);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:135.9(C-1),129.3(C-2,6),130.1(C-3,5),131.4(C-4),146.2(C-7),119.5(C-8),170.5(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致,確定化合物為肉桂酸。

化合物3無色油狀物;ESI-MS:m/z196 [M]+,分子式為C10H12O4。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.57(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6′),7.54(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.86(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),3.93(2H,t,J=6.2 Hz,H-2),3.90(3H,s,3′-OCH3),3.15(2H,t,J=6.2 Hz,H-1);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:58.9(C-1),130.7(C-1′),41.7(C-2),111.9(C-2′),199.7(C-3),149.1(C-3′),153.4(C-4′),115.8(C-5′),124.7(C-6′),56.4(3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道一致,確定化合物為ω-hydroxypropioguaiacone。

化合物4無色油狀物;ESI-MS:m/z281 [M+Na]+,分子式為C12H18O6。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.63(2H,s,H-2,6),4.07(1H,d,J=6.3 Hz,H-7),3.84(6H,s,3,5-OCH3),3.72(1H,td,J=6.4,3.9 Hz,H-8),3.63(1H,dd,J=11.3,3.9 Hz,H-9a),3.55(1H,dd,J=11.3,6.4 Hz,H-9b),3.21(3H,s,7-OCH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:130.6(C-1),106.2(C-2,6),149.2(C-3,5),136.4(C-4),85.9(C-7),76.2(C-8),64.3(C-9),56.7(3,5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道一致,確定化合物為threo-8S-7-methoxysyringylglycerol。

化合物5白色無定型粉末;ESI-MS:m/z243 [M+H]+,分子式為C11H14O6。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.33(2H,s,H-2′,6′),5.13(2H,td,J=3.9 Hz,H-2),3.90(6H,s,3′,5′-OCH3),3.87(1H,s,H-3a),3.74(1H,dd,J=11.6,4.9 Hz,H-3b);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:199.7(C-1),75.6(C-2),66.2(C-3),126.7(C-1′),107.7(C-2′,6′),149.1(C-3′,5′),143.0(C-4′),56.9(3′,5′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道一致,確定化合物為3-(2,4′-dihydroxy-3′,5′-dimethoxyphenyl)propanoic acid。

化合物6無色結(jié)晶(甲醇);ESI-MS:m/z227 [M+H]+,分子式為C11H14O5。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.32(2H,overlap,H-2,6),5.19(1H,q,J=6.9 Hz,H-8),3.90(6H,s,3,5-OCH3),1.41(3H,d,J=6.9 Hz,H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:126.2(C-1),107.7(C-2,6),149.1(C-3,5),142.9(C-4),202.0(C-7),70.0(C-8),22.1(C-9),56.9(3,5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道一致,確定化合物為8-hydroxy-9-methyl-7-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-7-propanone。

化合物7白色針狀結(jié)晶(甲醇);ESI-MS:m/z249 [M+Na]+,分子式為C11H14O5。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.31(2H,br s,H-3,5),3.94(2H,t,J= 6.2 Hz,H-9),3.89(6H,s,2,6-OCH3),3.17(2H,t,J= 6.2 Hz,H-8);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:129.0(C-1),149.1(C-2,6),107.3(C-3,5),143.1(C-4),199.6(C-7),41.7(C-8),59.0(C-9),56.9(2,6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道一致,確定化合物為3-羥基-1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙酮。

化合物8白色固體;ESI-MS:m/z197 [M+H]+,分子式為C10H12O4。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.55(1H,br s,H-2),7.53(1H,br s,H-6),6.83(1H,d,J= 8.9 Hz,H-5),5.15(1H,m,H-8),3.89(3H,s,3-OCH3),1.39(1H,d,J= 6.9 Hz,H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:126.7(C-1),112.3(C-2),155.2(C-3),149.6(C-4),116.2(C-5),125.3(C-6),201.8(C-7),69.8(C-8),22.2(C-9),56.3(3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致,確定化合物為2-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基)苯基-1-丙酮。

化合物9淡黃色粉末;ESI-MS:m/z231 [M+Na]+,分子式為C11H12O4。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.58(1H,d,J= 16.0 Hz,H-7),7.16(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2),7.05(1H,dd,J=8.0,1.8 Hz,H-6),6.80(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),6.30(1H,d,J= 16.0 Hz,H-8),3.88(3H,s,9-OCH3);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:127.8(C-1),116.0(C-2),150.5(C-3),149.4(C-4),116.5(C-5),124.0(C-6),111.7(C-7),146.8(C-8),171.1(C-9),56.4(9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道一致,確定化合物為異咖啡酸甲酯。

化合物10白色針晶(甲醇);ESI-MS:m/z372 [M]+,分子式為C17H24O9。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.74(2H,s,H-3,5),6.54(1H,d,J=15.9 Hz,H-7),6.32(1H,dt,J=15.9,5.6 Hz,H-8),4.25(2H,d,J=5.6 Hz,H-9),4.86(1H,d,J=7.7 Hz,H-1′),3.85(6H,s,2,6-OCH3),3.20～3.77處的一系列多重峰,推測該化合物含有葡萄糖片段,并根據(jù)偶合常數(shù)J=7.7 Hz推測該葡萄糖為β構(gòu)型;13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:135.9(C-1),154.3(C-2,6),105.4(C-3,5),135.2(C-4),130.0(C-7),131.3(C-8),62.6(C-9),105.3(C-1′),75.7(C-2′),78.3(C-3′),71.3(C-4′),77.8(C-5′),63.6(C-6′),57.0(2,6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致,確定化合物為trans-syringin。

化合物11白色針晶(甲醇);ESI-MS:m/z372 [M+Na]+,分子式為C17H24O9。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.49(1H,d,J=11.7 Hz,H-7),5.82(1H,dt,J=11.7,5.3 Hz,H-8)為一個順式雙鍵氫信號;13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:135.6(C-1),154(C-2),108.0(C-3),134.7(C-4),108.0(C-5),154.0(C-6),131.5(C-7),132.5(C-8),62.6(C-9),105.3(C-1′),75.7(C-2′),78.4(C-3′),71.4(C-4′),77.8(C-5′),59.8(C-6′),57.1(2,6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致,確定該化合物為cis-syringin。

化合物12無色油狀物;ESI-MS:m/z223 [M+Na]+,分子式為C10H16O4。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.90(1H,d,J=2.2 Hz,H-2),2.48(1H,d,J=16.9 Hz,H-3a),2.35(2H,m,H-6),2.18(1H,d,J=16.9 Hz,H-3b),1.90(1H,m,H-5a),1.57(1H,m,H-5b),1.22(3H,s,H-10),1.21(3H,s,H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:130.9(C-1),138.9(C-2),33.9(C-3),74.7(C-4),27.7(C-5),22.1(C-6),171.0(C-7),75.6(C-8),24.6(C-9,10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道一致,確定化合物為(4R)-4-hydroxy-4-(2-hydroxypropan-2-yl)cyclo-hex-1-ene-1-carboxylic acid。

化合物13無色油狀物;ESI-MS:m/z193 [M+Na]+,分子式為C10H18O2。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.65(1H,s,H-2),3.92(2H,J= 13.5 Hz,H-7),2.14(1H,m,H-3b),2.11(1H,m,H-6a),2.03(1H,m,H-6b),1.97(1H,m,H-5a),1.85(1H,m,H-3a),1.51(1H,m,H-4),1.25(1H,m,H-5b),1.16(6H,s,H-9,10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:138.6(C-1),123.3(C-2),24.9(C-3),46.5(C-4),27.6(C-5),27.2(C-6),67.2(C-7),73.1(C-8),26.2(C-9),27.7(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道一致,確定化合物為7-羥基-α-松油醇。

化合物14無色油狀物;ESI-MS:m/z223 [M+H]+,分子式為C13H18O3。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.99(1H,d,J=15.8 Hz,H-7),6.42(1H,d,J=15.8 Hz,H-8),5.93(1H,s,H-4),2.60(1H,d,J=17.1 Hz,H-2a),2.27(1H,d,J=17.1 Hz,H-2b),2.30(3H,s,H-10),1.89(3H,d,J=1.3 Hz,H-11),1.05(3H,s,H-12),1.01(3H,s,H-13);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:42.0(C-1),50.5(C-2),200.7(C-3),128.4(C-4),164.7(C-5),80.0(C-6),148.4(C-7),131.7(C-8),200.4(C-9),27.6(C-10),19.2(C-11),23.5(C-12),24.7(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道一致,確定化合物為去氫吐葉醇。

化合物15白色粉末;ESI-MS:m/z265 [M+H]+,分子式為C15H20O4。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.77(1H,d,J=16.1 Hz,H-4),6.24(1H,d,J=16.1 Hz,H-5),5.91(1H,s,H-8),5.74(1H,s,H-2),2.52(1H,d,J= 17.0 Hz,H-10a),2.18(1H,d,J= 17.0 Hz,H-10b),2.03(3H,s,H-15),1.92(3H,s,H-14),1.06(3H,s,H-12),1.02(3H,s,H-13);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:169.4(C-1),119.5(C-2),166.5(C-3),129.4(C-4),138.0(C-5),80.6(C-6),151.1(C-7),127.6(C-8),201.0(C-9),50.6(C-10),42.8(C-11),19.6(C-12),23.6(C-13),21.3(C-14),24.7(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]報道一致,確定化合物為脫落酸。

化合物16黃色不定型粉末;ESI-MS:m/z197 [M+H]+,分子式為C11H16O3。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.74(1H,s,H-7),4.21(1H,m,H-3),2.43(1H,d,J=13.6 Hz,H-4a),1.98(1H,d,J=14.4 Hz,H-2b),1.75(3H,s,H-11),1.72(1H,d,J=13.6,3.9 Hz,H-4b),1.52(1H,dd,J=14.4,3.5 Hz,H-2a),1.45(3H,s,H-9),1.26(3H,s,H-10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:37.2(C-1),47.9(C-2),67.2(C-3),46.4(C-4),88.9(C-5),174.4(C-6),113.5(C-7),185.6(C-8),27.0(C-9),31.0(C-10),(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[24]報道一致,確定化合物為黑麥草素內(nèi)脂。

化合物17無色油狀物;ESI-MS:m/z207 [M+H]+,分子式為C13H18O2。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.98(1H,d,J=9.9 Hz,H-2),6.34(1H,d,J=16.2 Hz,H-7),6.17(1H,d,J=9.9 Hz,H-3),5.84(1H,d,J=16.2 Hz,H-8),4.42(1H,m,H-9),1.93(3H,s,H-13),1.32(3H,d,J=6.5 Hz,H-10),1.26(3H,s,H-12),1.25(3H,s,H-11);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:41.0(C-1),160.0(C-2),126.2(C-3),188.9(C-4),125.0(C-5),161.3(C-6),143.8(C-7),131.5(C-8),69.0(C-9),23.6(C-10),26.9(C-11,12),13.2(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[25]報道一致,確定化合物為(E)-3-(3-hydroxybut-1-enyl)-2,4,4-trimethylcyclohexa-2,5-dienone。

化合物18無色晶體(甲醇);ESI-MS:m/z207 [M-H]-,分子式為C13H20O2。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.93(1H,d,J=9.9 Hz,H-5),6.14(1H,d,J=9.9 Hz,H-6),3.81(1H,m,H-3′),2.59(1H,m,H-1′a),2.37(1H,m,H-1′b),1.88(3H,s,H-7),1.58(1H,m,H-2′),1.28(3H,s,H-8),1.27(3H,s,H-9),1.21(3H,d,J=6.3 Hz,H-4′);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:188.5(C-1),132.4(C-2),165.5(C-3),42.2(C-4),160.2(C-5),126.1(C-6),26.0(C-7),25.9(C-8),11.5(C-9),27.9(C-1′),38.7(C-2′),68.8(C-3′),23.3(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[26]報道一致,確定化合物為3-(3′-hydroxybutyl)-2,4,4-trimethylcyclohexa-2,5-dienone。

化合物19無色晶體(甲醇);ESI-MS:m/z187 [M+Na]+,分子式為C10H12O2。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.93(1H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),7.32(1H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),2.98(1H,m,H-1′),1.26(6H,d,J=6.4 Hz,H-2′,3′);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:155.7(C-1),131.0(C-2,6),127.5(C-3,5),129.6(C-4),35.5(C-1′),24.1(C-2′,3′),170.1(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[27]報道一致,確定化合物為對異丙基苯甲酸。

化合物20無色油狀物;ESI-MS:m/z335 [M+Na]+,分子式為C16H24O6。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.33(2H,d,J=8.0 Hz,H-2,6),7.20(2H,d,J=8.0 Hz,H-3,5),4.63(1H,d,J=11.6 Hz,H-10),4.63(1H,d,J=11.6 Hz,H-4′),4.33(1H,d,J=7.8 Hz,H-1′),3.98(1H,dd,J=11.9,2.1 Hz,H-6′a),3.69(1H,dd,J=11.9,5.6 Hz,H-6′b),3.26～3.32(3H,m,H-2′,3′,5′),2.87(1H,m,H-7),1.24(3H,s),1.22(3H,s);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:136.3(C-1),129.5(C-2,6),127.3(C-3,5),150.0(C-4),35.1(C-7),24.5(C-8,9),71.6(C-10),103.1(C-1′),72.1(C-2′),78.0(C-3′),71.7(C-4′),78.1(C-5′),62.8(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道一致,可以確定化合物為p-cymen-7-ylβ-D-glucopyranoside。

化合物21黃色油狀物;ESI-MS:m/z209 [M+Na]+,分子式為C10H18O3。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.66(1H,br s,H-2),2.16(1H,d,J=7.4 Hz,H-5),2.13～3H,d,J=1.1 Hz,H-4),1.56(2H,m,H-6),1.43(2H,m,H-7),1.17(6H,s,H-9,10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:170.3(C-1),116.9(C-2),161.5(C-3),18.7(C-4),44.1(C-5),42.3(C-6),29.2(C-7),71.2(C-8),23.2(C-9,10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[28]報道一致,確定化合物為acyclic 7-hydroxygeranic acid。

化合物22黃色油狀物;ESI-MS:m/z189 [M+Na]+,分子式為C10H14O2。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.82(1H,m,H-2),2.73(1H,m,H-3),2.49(1H,m,H-5),2.44(2H,m,H-6),2.12(1H,m,H-4a),1.34(3H,s,H-8),1.10(1H,d,J=9.0 Hz,H-4b),0.79(3H,s,H-9);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:137.8(C-1),141.7(C-2),42.5(C-3),33.1(C-4),41.7(C-5),32.1(C-6),38.6(C-7),26.4(C-8),21.3(C-9),169.7(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[29]報道一致,確定化合物為7,7-dimethylbicyclo[3.1.1]hept-2-ene-1-carboxylic acid。

化合物1～22的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～22的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-22

2.2 體外抗哮喘活性評價

通過建立C48/80誘導(dǎo)RBL-2H3細胞脫顆粒體外模型,對中麻黃中22個單體化合物進行活性篩選,給藥劑量均為10 μmol/L,結(jié)果顯示,中麻黃中單體化合物11、14能夠顯著抑制β-氨基己糖苷酶的釋放(P<0.05)(見表1),改善RBL-2H3細胞脫顆粒現(xiàn)象,提示其可能通過抑制肥大細胞脫顆粒發(fā)揮抗哮喘作用。

表1 化合物對C48/80誘導(dǎo)RBL-2H3細胞中β-Hex釋放的影響

3 討論與結(jié)論

麻黃作為我國歷史悠久的藥用植物,得到了許多專家學(xué)者的青睞,對其成分和藥理作用也進行了系統(tǒng)研究,然而查閱相關(guān)文獻我們發(fā)現(xiàn),有關(guān)研究多集中于草麻黃和木賊麻黃,關(guān)于中麻黃的研究相對來說較少。因此,本研究采用多種色譜學(xué)方法對中麻黃50%丙酮提取物進行化學(xué)成分研究,從中分離得到了22個化合物,化合物1～11為苯丙素類化合物,化合物12～22個萜類化合物。同時對所得化合物進行了體外抗哮喘活性篩選,結(jié)果顯示化合物11和14能夠顯著抑制β-氨基己糖苷酶的釋放,改善肥大細胞脫顆粒現(xiàn)象,表明化合物11和14具有潛在的抗哮喘活性。

從體外活性測試結(jié)果來看,活性物質(zhì)的化合物類型不集中且數(shù)量相對較少,因此對其構(gòu)效關(guān)系的總結(jié)難度相對較大,后續(xù)考慮可進一步導(dǎo)向性分離相關(guān)化合物并對其活性進行評價,總結(jié)其構(gòu)效關(guān)系,以期進一步豐富中麻黃的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為中麻黃資源的利用和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。