王百才,趙 耀,耿若愚,馬 沖,劉天華,胡君萍*,楊建華,2*

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830017;2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,烏魯木齊 830011

肝纖維化是誘發(fā)肝硬化甚至肝癌的主要原因,約90%的肝癌是在肝纖維化或肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)展而來,因此肝纖維化的治療尤為重要[1]。肝纖維化在臨床發(fā)病率逐年增加,嚴(yán)重危害了人們的生命安全。肝纖維化的主要原因包括慢性肝炎病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝炎[2]。肝纖維化的特征是細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚,這是由細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積增加以及細(xì)胞外基質(zhì)降解減少或不平衡引起的[3]。肝星狀細(xì)胞激活被認(rèn)為是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié),它是肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過量累積的主要原因[4,5]。

茴香根皮是傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥根皮,收錄在部頒標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊中,用于治療濕寒性或黏液質(zhì)性疾病,如濕寒性各種炎腫,兩脅寒痛,腰背酸痛,閉經(jīng)、閉尿、陳舊性腸梗阻等[6]。護(hù)肝布祖熱顆粒是民族醫(yī)藥保肝經(jīng)典方,由芹菜子、芹菜根、菊苣子、菟絲子、菊苣根、茴香根皮、小茴香組成,具有補(bǔ)肝利膽等功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)護(hù)肝布祖熱顆?？梢员Ｗo(hù)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化[7]。麥迪乃·賽福丁等發(fā)現(xiàn)民族藥茴香根皮具有一定程度的促進(jìn)肝組織修復(fù)并保護(hù)肝細(xì)胞膜的作用[8]。因此,茴香根皮可能具有抗肝纖維化作用。

藥物譜效關(guān)系研究是將化學(xué)成分與藥效研究相結(jié)合對有效化學(xué)成分進(jìn)行分析的方法,是在圖譜研究的基礎(chǔ)上,最大限度地獲取有用的化學(xué)信息,將譜圖與藥效結(jié)果聯(lián)系起來,通過線性或非線性數(shù)學(xué)處理,建立“譜-效”數(shù)學(xué)模型,從而確定出與藥效相關(guān)的化合物群[9]。通過對已知成分和未知成分的分析,能最大程度地反映中藥復(fù)雜混合體系中所含化學(xué)成分的種類和含量,進(jìn)而對中藥質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價(jià)[10]。故本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對維藥茴香根皮化學(xué)成分進(jìn)行了研究,結(jié)合茴香根皮乙醇提取部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水萃余部位對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響聯(lián)合UPLC-Orbitrap-MS/MS借助偏最小二乘法及灰色關(guān)聯(lián)分析對茴香根皮化學(xué)成分進(jìn)行篩選,并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證茴香根皮有效成分抗肝纖維化的作用及其機(jī)制,為民族醫(yī)藥的研究和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茴香根皮藥材(批號:HXGP-YP-210115)購自安薩爾維吾爾藥業(yè)有限公司,經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)胡君萍教授鑒定為傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥根皮。

DMEM高糖培養(yǎng)基(批號2116111,以色列BI公司);PBS緩沖鹽溶液(批號2141302,以色列BI公司);胎牛血清(批號2120140,以色列BI公司);FITC偶聯(lián)Annexin-Ⅴ凋亡檢測盒(批號1026022,美國BD公司);0.25%胰酶細(xì)胞消化液(批號21089531,北京Labgic Technology公司);MTT試劑(批號EZ7890B104,德國Biofroxx公司);DMSO(批號EZ6789C150,德國Biofroxx公司);Hochest33258染色液(批號20210709,武漢Proteintech公司);大鼠Ⅳ型膠原(Ⅳ-C,批號:202305)、大鼠透明質(zhì)酸(HA,批號:202305)、大鼠層粘連蛋白(LN,批號:202305)、大鼠Ⅲ型前膠原(PCⅢ,批號:202305)ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)。對照品去氫駱駝蓬堿(純度≥98%,批號H2303001)、二氫辣椒堿(純度≥98%,批號D2211001)、乙酰香蘭素(純度≥98%,批號V2211001)、芹菜素(純度≥98%,批號Z30142203)、7-羥基香豆素(純度≥98%,批號H2211001)、對香豆酸(純度≥98%,批號H2107001)、異莨菪亭(純度≥98%,批號E2209001)(四川普西標(biāo)物科技有限公司);香草醛(純度≥98%,批號20170520,天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)。

1.2 儀器

BDLSRⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司);TS2倒置顯微鏡(日本Nikon公司);MultiskanGO全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6,細(xì)胞株(批號CLL-0116)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.4 茴香根皮浸膏的制備

稱取茴香根皮1 kg,分別用95%乙醇回流提取3次(3、3、2 h),料液比為1∶10,過濾合并濾液,濃縮乙醇提取物(ET),乙醇提取物浸膏得率為11.43%。乙醇提取物用水混懸,依次使用石油醚,乙酸乙酯,正丁醇萃取,合并萃取液蒸干溶劑,分別得到石油醚部位(PP)、乙酸乙酯部位(PE)、正丁醇部位(PB)、水萃余部位(PW),各部位浸膏得率分別為12.02%、3.37%、4.33%、80.28%。

1.5 茴香根皮UPLC-Orbitrap-MS/MS圖譜的檢測

1.5.1 對照品溶液的制備

精密稱取去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿、乙酰香蘭素、芹菜素、7-羥基香豆素、對香豆酸、異莨菪亭、香草醛對照品適量,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容得到質(zhì)量濃度為500 ng/mL的對照品溶液。

1.5.2 UPLC-Orbitrap-MS/MS供試品溶液制備

分別取茴香根皮醇提物和萃取物浸膏100 mg加入500 μL甲醇,渦旋30 s,45 Hz勻漿4 min,冰水浴超聲1 h,后將樣本在4 ℃,12 000 r/min(離心力13 800×g,半徑8.6 cm)條件下離心15 min,小心地取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

1.5.3 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm),流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫0～11 min,15%A→75%A;11～12 min,75%A→98%A;12～14 min,98%A;14～14.1 min,98%A→15%A;14.1～16 min,15%A。柱溫30 ℃,流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣量:5 μL。

1.5.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI),正離子和負(fù)離子掃描模式。正離子模式下電噴霧電壓為4 000 V,負(fù)離子模式下電噴霧電壓為-3 800 V,采用Orbitrap Exploris 120 質(zhì)譜儀與Xcalibur軟件結(jié)合,基于IDA采集模式獲取MS和MS/MS數(shù)據(jù)。掃描范圍為m/z100～1 500,篩選每個(gè)采集周期的前四個(gè),進(jìn)一步獲得相應(yīng)的MS/MS數(shù)據(jù),護(hù)套氣體流速35 arb,輔助氣體流速15 arb,離子傳輸管溫度350 ℃,全MS分辨率為60 000,MS/MS分辨率為15 000,NCE模式碰撞能量:16/32/48。

1.6 體外抗肝纖維化活性的測定

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的HSC-T6細(xì)胞株復(fù)蘇,用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種于培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)條件為37 ℃,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度為5%;觀察細(xì)胞形態(tài)、生長狀態(tài),視情況進(jìn)行換液或傳代。

1.6.2 MTT法測定茴香根皮各部位抗肝纖維化活性

將濃度為2×104個(gè)/mL的細(xì)胞接種至96孔板中,過夜貼壁成長后,加入1 μg/mL的脂多糖100 μL干預(yù)24 h,之后加入含茴香根皮醇提物或不同萃取物的完全培養(yǎng)基,使其終濃度為200、400、600、800、1000 mg/mL,每孔200 μL。干預(yù)48 h后,每孔加入100 μL MTT溶液,放入培養(yǎng)箱孵育4 h,孵育完畢加入150 μL DMSO溶液,490 nm下檢測OD值,并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.7 茴香根皮抗肝纖維化譜效關(guān)系研究

1.7.1 偏最小二乘法篩選活性成分

利用偏最小二乘法分別分析正負(fù)離子模式成分峰面積與HSC-T6細(xì)胞抑制率之間的關(guān)系,細(xì)胞抑制率越高,表明體外抗肝纖維化活性越好。將MTT法抑制率數(shù)據(jù)和正負(fù)離子模式檢測到的成分峰面積數(shù)據(jù)輸入到軟件SIMCA 14.1中進(jìn)行偏最小二乘法分析得到VIP值和相關(guān)系數(shù)。VIP值越大,說明該成分對藥效的貢獻(xiàn)越大,相關(guān)系數(shù)大于零,表明化學(xué)成分與抑制率正相關(guān),反之負(fù)相關(guān)[11,12]。

1.7.2 灰色關(guān)聯(lián)分析篩選活性成分

分別將正負(fù)離子模式茴香根皮化學(xué)成分峰面積和MTT抑制率數(shù)據(jù)導(dǎo)入在線網(wǎng)站SPSSPRO(https://www.spsspro.com/)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析得到成分關(guān)聯(lián)度和排名,將成分關(guān)聯(lián)度大于0.7的成分納入篩選范圍,關(guān)聯(lián)度越大評價(jià)結(jié)果越好[13]。

1.8 茴香根皮成分體外抗肝纖維化驗(yàn)證

1.8.1 MTT法測定單體化合物的抗肝纖維化活性

實(shí)驗(yàn)分組為正常組(control,Con)、模型組(model,Mod)、陽性藥水飛薊賓組(silybin,Sil)、去氫駱駝蓬堿組(harmine,Har)、二氫辣椒堿組(dihydrocapsaicin,Dih)、異莨菪亭組(isoscopoletin,Iso)等。給藥組分別加入濃度為25、50、100、200、400、800 μmol/L的化合物干預(yù)48 h,MTT法檢測OD值。

1.8.2 劃痕實(shí)驗(yàn)

先用馬克筆在6孔板背面均勻的劃出橫線。待細(xì)胞生長至70%～80%時(shí),使用200 μL的滅菌槍頭,按照橫線垂直劃痕。使用PBS清洗3次,洗去劃下的細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。之后分別加入濃度為200 μmol/L的去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿、異莨菪亭,24 h后在倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8.3 免疫熒光法檢測α-SMA的表達(dá)

取HSC-T6細(xì)胞6×103個(gè)/mL接種于24孔板中,培養(yǎng)過夜,加入1 μg/mL脂多糖500 μL干預(yù)24 h。之后分別加入濃度為200 μmol/L的去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿、異莨菪亭,干預(yù)48 h后,無菌PBS清洗,固定液固定,使用TritonX-100室溫通透,使用5%羊血清室溫封閉,最后加入一抗工作液(1∶100),4 ℃孵育,次日用無菌PBS清洗,滴加二抗工作液,避光孵育,清洗,封片,拍照。

1.8.4 Hochest33258染色檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)

給藥方法同“1.8.3”,棄去孔板內(nèi)含藥培養(yǎng)基后,無菌PBS清洗,固定液固定15 min,無菌PBS清洗,Hochest33258染色液染色,避光孵育20 min,無菌PBS清洗,拍照。

1.8.5 JC-1檢測線粒體膜電位

給藥方法同“1.8.3”,干預(yù)48 h后,棄去舊培養(yǎng)基,無菌PBS清洗,接著用JC-1染色工作液避光孵育20 min,JC-1染色緩沖液清洗,棄去洗液加入完全培養(yǎng)基,拍照。

1.8.6 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡

將濃度為7×104個(gè)/mL的肝星狀細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)過夜,加入1 μg/mL脂多糖1 000 μL干預(yù)24 h,分別加入濃度為200 μmol/L的去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿、異莨菪亭干預(yù)48 h后,收集孔內(nèi)培養(yǎng)基,無菌PBS清洗,收集PBS洗滌液,胰酶消化,無菌PBS清洗,100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞?？瞻捉M和各給藥組分別加入Annexin V-FITC和PI染料,最后加400 μL 1×Binding Buffer,尼龍網(wǎng)過濾,上機(jī)檢測。

1.8.7 ELISA法檢測上清Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的含量

給藥方法同“1.8.3”,收集給藥干預(yù)過后的細(xì)胞上清液3 000 r/min離心10 min,用細(xì)胞上清按照試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)步驟。

1.8.8 Western blot檢測Bax、Bcl-2、Caspase3蛋白的表達(dá)

采用Western blot法研究Bax、Bcl-2、Caspase3的蛋白表達(dá)水平。按試劑盒說明書提取細(xì)胞蛋白,BCA蛋白定量,金屬浴15 min使蛋白變性。取變性蛋白適量,選用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,加入奶粉孵育2 h洗滌后,加入一抗,4 ℃孵育過夜;TBST洗滌后,加入對應(yīng)二抗,室溫孵育1 h,顯影。用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),繪圖使用Graphpad prism 8軟件。組間比較采用One-way ANOVA。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測定各樣品的抗肝纖維化活性

不同濃度(200、400、600、800、1000 mg/L)ET、PP、PE、PB、PW作用于HSC-T6細(xì)胞48 h的MTT結(jié)果顯示:細(xì)胞存活率隨藥物濃度的升高顯著降低(見圖1)。選用給藥濃度為0.8 mg/L時(shí)的抑制率進(jìn)行譜效關(guān)系研究,0.8 mg/L時(shí)ET、PP、PE、PB、PW抑制率分別為48.47%、11.38%、89.80%、51.13%和7.61%。

圖1 茴香根皮不同部位對HSC-T6增殖的影響Fig.1 Effects of different parts of F.vulgare cortex on the proliferation of

2.2 UPLC-Orbitrap-MS/MS圖譜的建立

通過UPLC-Orbitrap-MS/MS獲得的茴香根皮不同部位總離子色譜圖(total ion chromatogram,TIC)(見圖2)。根據(jù)總離子流圖中保留時(shí)間、一級質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子峰及二級質(zhì)譜提供的碎片離子信息與對照品比對,并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,共識別58個(gè)共有峰化合物[14,15],結(jié)果見表1。

表1 茴香根皮化合物不同部位峰面積

圖2 茴香根皮不同部位總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of different parts of F.vulgare cortex

2.3 偏最小二乘法和灰色關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

根據(jù)偏最小二乘回歸分析原理,自變量投影重要性值(VIP)越大表示其對抑制率的解釋能力越強(qiáng)。由分析結(jié)果(見圖3)可知,共有11個(gè)成分VIP值大于1,且回歸系數(shù)均大于0(見表2),說明11個(gè)成分與細(xì)胞抑制率呈正相關(guān)關(guān)系。這11個(gè)成分在灰色關(guān)聯(lián)度分析中關(guān)聯(lián)度系數(shù)均>0.7,分別為二氫辣椒堿、去氫駱駝蓬堿、異莨菪亭、乙酰香蘭素、3,4-二甲氧鄰苯二甲酸、對甲氧基肉桂酸乙酯、7-羥基香豆素、1′-乙酰氧丁香酚醋酸酯、4-羥基苯甲酸酯、2-羥基苯乙酮、1,3-二咖啡?？鼘幩?。

表2 茴香根皮化合物VIP值、回歸系數(shù)和關(guān)聯(lián)度

圖3 標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖、VIP值圖Fig.3 Standardized regression coefficient diagram and VIP value diagram.

2.4 MTT法篩選單體化合物體外抗肝纖維化活性驗(yàn)證結(jié)果

基于譜效關(guān)系及文獻(xiàn)報(bào)道,本研究對具有潛在活性的化合物包括二氫辣椒堿、乙酰香蘭素、異莨菪亭、7-羥基香豆素、1,3-二咖啡?？鼘幩?、去氫駱駝蓬堿等進(jìn)行了體外抗肝纖維化活性驗(yàn)證,與對照組比較,這些化合物對活化的HSC-T6細(xì)胞增殖均具有不同程度的抑制作用(P<0.05、P<0.01、P<0.001),其中二氫辣椒堿、去氫駱駝蓬堿、異莨菪抗肝纖維化活性最強(qiáng)(見圖4),故選用這三個(gè)化合物進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

圖4 化合物對HSC-T6增殖抑制的影響Fig.4 Effect of compounds on the inhibition of HSC-T6

2.5 單體化合物對HSC-T6細(xì)胞遷移的影響

與模型相比,二氫辣椒堿組細(xì)胞愈合率沒有明顯差異,異莨菪亭組和去氫駱駝蓬堿組的細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.001)(見圖5),說明異莨菪亭和去氫駱駝蓬堿顯著抑制HSC-T6細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。

圖5 化合物對HSC-T6細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig.5 Effects of compounds on the motility of HSC-T6

2.6 單體化合物對HSC-T6細(xì)胞α-SMA的影響

免疫熒光染色顯示,與正常組比較,模型組α-SMA熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.001);與模型組比較,二氫辣椒堿組、去氫駱駝蓬堿組、異莨菪亭組α-SMA熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.01、P<0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6)。

2.7 單體化合物對HSC-T6凋亡的影響

細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)細(xì)胞核會發(fā)生一系列形態(tài)變化,例如核皺縮,染色質(zhì)凝聚,產(chǎn)生凋亡小體等。利用染料對細(xì)胞核染色,如果細(xì)胞是存活狀態(tài),經(jīng)過染色后是均勻的藍(lán)色熒光,如果細(xì)胞處于凋亡狀態(tài),染色后是致密濃染的亮藍(lán)色熒光。本研究采用Hochest33258染色觀察HSC-T6細(xì)胞核的形態(tài)變化(見圖7A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組相比,給藥組均出現(xiàn)核破裂、皺縮、致密濃染細(xì)胞等。

圖7 各化合物對HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effects of compounds on the apoptosis of HSC-T6

當(dāng)細(xì)胞處于凋亡狀態(tài),細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位會下降,而且這種改變是比細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化要早,之后會不可逆地進(jìn)入凋亡過程,因此線粒體膜電位的降低用于判斷細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡早期階段。正常線粒體內(nèi),JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物,聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光;在化合物誘導(dǎo)線粒體膜電位崩潰時(shí),由于膜電位的下降或喪失,JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中,發(fā)出綠色熒光。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見圖7B),正常組細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度高,綠色熒光幾乎不可見,表明正常組細(xì)胞線粒體膜電位較高。說明異莨菪亭、二氫辣椒堿和去氫駱駝蓬堿可以導(dǎo)致HSC-T6的線粒體膜電位下降,發(fā)生凋亡。

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示二氫辣椒堿組、去氫駱駝蓬堿組、異莨菪亭組的凋亡率分別為(59.00±3.90)%、(86.87±8.80)%、(37.17±4.71)%。異莨菪亭組與正常組相比,細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),二氫辣椒堿組、去氫駱駝蓬堿組與正常組相比細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05、P<0.001),表明二氫辣椒堿、去氫駱駝蓬堿、異莨菪亭可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡(見圖7C)。

2.8 單體化合物對Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的影響

與正常組相比,模型組HSC-T6細(xì)胞上清Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的含量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,去氫駱駝蓬堿組Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的含量均顯著降低(P<0.05),二氫辣椒堿組的HA和PCⅢ含量顯著降低(P<0.05),異莨菪亭組和水飛薊賓組HA的含量顯著降低(P<0.05)(見圖8)。

圖8 化合物對HSC-T6細(xì)胞上清Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的影響Fig.8 Effects of compounds on IV-C,HA,LN and PCIII in the supernatant of HSC-T6

2.9 Western blot結(jié)果

二氫辣椒堿組和去氫駱駝蓬堿組Bax/Bcl-2相對表達(dá)量與模型組相比差異有顯著性(P<0.05)。模型組HSC-T6中Caspase3相對表達(dá)量高于正常組。二氫辣椒堿組和去氫駱駝蓬堿組Caspase3相對表達(dá)量顯著高于模型組(P<0.01、P<0.001),異莨菪亭組和水飛薊賓組Caspase3相對表達(dá)水平與模型組相比沒有顯著性(見圖9)。

圖9 化合物對HSC-T6細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase3的影響Fig.9 Effects of compounds on Bax,Bcl-2 and Caspase3 in HSC-T6

3 討論與結(jié)論

中藥多靶點(diǎn)多成分的協(xié)同作用已成為中藥研究的熱點(diǎn)。藥效成分研究是藥物研究的基礎(chǔ),其活性成分及作用方式均存在復(fù)雜性的特點(diǎn)。2002年,李戎提出譜效關(guān)系理論,為中藥藥效研究指明新的研究方向[16]。本研究在茴香根皮醇提取物和不同萃取物UPLC-Orbitrap-MS/MS圖譜共有峰與其抗肝纖維化作用數(shù)據(jù)量化的基礎(chǔ)上,采用偏最小二乘法和灰色關(guān)聯(lián)分析對茴香根皮總離子流圖譜共有峰與抗肝纖維化作用的大小進(jìn)行相關(guān)性研究,可較大程度反映成分對藥效的貢獻(xiàn)作用。

本研究以茴香根皮醇提物、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位為研究對象,開展高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜分析,構(gòu)建茴香根皮液質(zhì)圖譜,正負(fù)離子模式共標(biāo)定了58個(gè)共有峰,分析圖譜,可見各樣品的共有峰面積有差別,可用于譜效關(guān)系研究。譜效關(guān)系分析有11種成分對抗肝纖維化作用的貢獻(xiàn)較大(VIP>1和回歸系數(shù)>0)。其中,已有文獻(xiàn)報(bào)道具有抗肝纖維化作用的化合物有沒食子酸、芹菜素、山柰酚、秦皮乙素、東莨菪內(nèi)酯和大黃酸等[17-22],體現(xiàn)了茴香根皮多成分多靶點(diǎn)發(fā)揮抗肝纖維化作用的特點(diǎn)。去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿和異莨菪亭是首次在茴香根皮中發(fā)現(xiàn)含量相對較高且具有較好抗肝纖維化活性的化合物,可能為潛在質(zhì)量標(biāo)志物。其中去氫駱駝蓬堿可能通過降低肺組織中TGF-β1、Smad3和NF-кB p65的表達(dá)改善細(xì)粒棘球蚴繼發(fā)感染引起的小鼠肺組織纖維化[23]。二氫辣椒堿和異莨菪亭抗肝纖維化的研究尚未見報(bào)道。

Bcl-2屬于抗凋亡基因,是協(xié)調(diào)細(xì)胞生命和死亡的關(guān)鍵因子[24],Bax屬于促凋亡基因,是Bcl-2家族的促凋亡蛋白[25]。caspase3作為細(xì)胞凋亡的重要效應(yīng)因子,是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必由之路,其被激活預(yù)示著凋亡步入不可逆階段[26]。在凋亡中,Bax/Bcl-2的比值是衡量細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑凋亡的重要指標(biāo),Bax/Bcl-2比值升高時(shí),凋亡增加;反之,凋亡減少。當(dāng)細(xì)胞感受到凋亡信號后,可以通過調(diào)控Bcl-2、Bax等凋亡因子的表達(dá)而活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase9),進(jìn)而激活Caspase3,引發(fā)Caspase家族級聯(lián)反應(yīng),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿可以降低活化肝星狀細(xì)胞內(nèi)線粒體功能并打破線粒體膜電位平衡,使促凋亡因子(Bax)被大量釋放,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,減少肝星狀細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞外基質(zhì)和α-平滑肌激動(dòng)蛋白的表達(dá),從而減輕肝纖維化[27,28]。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,需要對篩選出的單體化合物進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在mRNA和蛋白水平上進(jìn)一步研究茴香根皮單體化合物抗肝纖維化的作用機(jī)制。

綜上所述,本研究通過采用UPLC-Orbitrap-MS/MS技術(shù)聯(lián)合偏最小二乘法和灰色關(guān)聯(lián)分析闡明了茴香根皮的抗肝纖維化的可能成分,體現(xiàn)了茴香根皮多成分多靶點(diǎn)抗肝纖維化的作用特點(diǎn),對于明確中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升具有重要意義,為進(jìn)一步了解其作用機(jī)制和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。