黃 靜,王玉旭,王 豪,陳 櫻,2,3,4,歐陽康,2,3,4,黃偉堅(jiān),2,3,4,黃穩(wěn)妃,韋祖樟,2,3,4*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530005; 2.廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心,廣西南寧 530005; 3.廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530004; 4.廣西高校動(dòng)物疫病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530005; 5.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)系,廣西南寧 530007)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是影響?zhàn)B豬業(yè)的重要疾病之一[1],該病還會(huì)產(chǎn)生免疫抑制,繼發(fā)其他細(xì)菌和病毒感染[2],對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成極大的影響。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)顆粒呈圓球形,平均大小約為60 nm,為單股正鏈RNA病毒[3],全長(zhǎng)約為15 kb,全基因組包含ORF1a、ORF1b、ORF2a及2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7等至少10個(gè)開放閱讀框(ORF)以及5′端和3′端的非編碼區(qū)[4],其中ORF1a和ORF1b編碼RNA依賴性RNA聚合酶等至少14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白,這些蛋白具有復(fù)制酶和蛋白水解酶功能,負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的復(fù)制和亞基因組mRNA以及拮抗干擾素(interferons,IFNs)的產(chǎn)生。其中由ORF2-7編碼的為結(jié)構(gòu)蛋白。PRRSV病毒感染豬體后可長(zhǎng)期存在于體內(nèi),實(shí)現(xiàn)持續(xù)性感染,并且PRRSV感染后期會(huì)引起靶細(xì)胞凋零壞死,破壞豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages,PAM)。豬體感染病毒后會(huì)抑制Ⅰ型干擾素的表達(dá)[5],引起免疫抑制,豬接種PRRSV活疫苗3～4周后才能產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和中和抗體,但中和抗體滴度不高[6],這些現(xiàn)象為PRRSV的防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

干擾素(interferon,IFN)是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能和抗病毒作用的細(xì)胞因子[7],能與細(xì)胞表面的受體結(jié)合進(jìn)而啟動(dòng)JAK-STAT信號(hào)通路,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄大量ISGs,能夠起到抗病毒作用。IFN根據(jù)細(xì)胞表面受體等差異將其分為三大類[8],其中Ⅰ型的抗病毒活性最強(qiáng),而豬的Ⅰ型IFN包含了17個(gè)IFN-α亞型,除了抗病毒作用外能夠調(diào)節(jié)宿主的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。外源性Ⅰ型IFN可增加抗病毒活性,已成功構(gòu)建在PRRSV全長(zhǎng)cDNA感染性克隆pGXAM[9],并在ORF1b和ORF2a之間插入兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)BstB Ⅰ和SbfⅠ,以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列TRS6[10]。本研究擬通過將豬Ⅰ型干擾素IFN-α插入PRRSV基因組中,以期獲得能夠表達(dá)IFN-α的重組PRRSV,為進(jìn)一步研發(fā)能有效刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的PRRSV疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞、質(zhì)粒 本研究用的PRRSV感染性克隆質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存[9],Marc-145細(xì)胞、PK-15細(xì)胞和PAM細(xì)胞由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 主要試劑 引物由北京擎科生物科技有限公司合成;prime star Max DNA polymerase、T4 DNA ligase、TaqMix、dNTP、Mixture、RNase inhibitor、M-MLV、Gel extraction kit、Cycle pure kit,美國(guó)OMEGA公司產(chǎn)品;Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒、細(xì)胞總RNA的提取試劑盒,愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品;內(nèi)切酶BstBⅠ、SbfⅠ,紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品;Trans Script?Green one-step RT-qPCR superMix、Trans5α chemically competent cell,北京全式金生物公司產(chǎn)品;新生胎牛血清、DMEM、MEM,GIBCO公司產(chǎn)品;BSA,碧云天公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀、細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱、細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱及熒光倒置顯微鏡,Thermo公司產(chǎn)品;恒溫水浴鍋,邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品;離心機(jī),Eppendorf公司產(chǎn)品;無菌操作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡,Nikon公司產(chǎn)品;羅氏96定量PCR儀,羅氏公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank上發(fā)表的豬源IFN-α基因序列和本實(shí)驗(yàn)室pGXAM序列,用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物,送南寧擎科生物有限公司合成(表1),表1中下劃線為限制性酶切位點(diǎn)。

表1 本研究使用的引物

1.2.2 目的基因擴(kuò)增 抽提PK-15細(xì)胞的RNA,以該RNA為模板克隆P-IFN-α目的基因。分別設(shè)計(jì)上游引物P-IFN-α-BstB I-F和下游引物P-IFN-α-SbfI-R,用細(xì)胞總RNA的抽提盒提取PK-15細(xì)胞的RNA,并用42℃、1 h的RT反應(yīng)程序?qū)υ撃０暹M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。用以下PCR反應(yīng)程序:94℃ 3 min;98℃ 10 s,56℃ 5 s,72℃ 6 s,共計(jì)35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min,以獲得的cDNA為模板擴(kuò)增目的基因P-IFN-α,用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物并進(jìn)行膠回收。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以pGXAM為載體,在ORF1b和ORF2a之間插入目的基因P-IFN-α。pGXAM載體以及目的基因的膠回收產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BstB I和SbfI進(jìn)行酶切,并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。用T4連接酶將酶切回收后的目的基因和載體置于16℃過夜連接,反應(yīng)體系為T4 DNA Ligase 1 μL,pGXAM 1 μL,P-IFN-α 7 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含Amp抗性的LA平板上,37℃培養(yǎng)12～16 h。從平板上挑取單個(gè)菌于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h,抽提質(zhì)粒,并用BstB I和SbfI對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,將鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 病毒的拯救和鑒定 將BHK-21細(xì)胞鋪至6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中,加入含2%血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞置體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2箱中37℃培養(yǎng),48 h后將細(xì)胞上清接至鋪好的Marc-145細(xì)胞的6孔板上,盲傳3代后對(duì)細(xì)胞上清液用引物TF11804和PR12186對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR鑒定,PCR反應(yīng)體系為:94℃ 3 min;98℃ 10 s,56℃ 5 s,72℃ 6 s,共計(jì)35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。

1.2.4 重組病毒的間接免疫熒光鑒定 Marc-145細(xì)胞接種至6孔板中,細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí)將P3代重組病毒rGXAM-P-IFN-α以及P3代的親本rGXAM感染至Marc-145細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組,觀察細(xì)胞直至出現(xiàn)明顯CPE后即可進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)。按照1 mL/孔加入冰甲醇固定細(xì)胞,4℃固定30 min后棄去冰甲醇并用PBS清洗3次,每孔加入1%牛血清蛋白(BSA)置于室溫封閉30 min。PBS清洗3次,稀釋比例為1∶2 000的PRRSV N蛋白單克隆抗體SDOW作為一抗,37℃孵育2 h。PBS清洗5次,Alexa Fluor 568標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(H+L)作為二抗,稀釋比例為1∶500,37℃避光孵育1 h。PBS清洗5次至二抗充分洗滌干凈后,每孔加入500 μL DAPI染液孵育5 min,清洗2次后置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.5 重組病毒的生長(zhǎng)曲線 將Marc-145細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞板中,細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合度時(shí),取100 μL成功拯救的P3代重組病毒rGXAM-P-IFN-α以及P3代的親本rGXAM,用含血清2%的MEM培養(yǎng)基按照10倍倍比稀釋至10-7,并在每孔加入100 μL的病毒稀釋液,用含血清2%的MEM培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)觀察細(xì)胞孔內(nèi)CPE情況,直至不再出現(xiàn)CPE后,使用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。Marc-145細(xì)胞鋪至12孔細(xì)胞板中,細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí),按照每孔細(xì)胞數(shù)和病毒的TCID50計(jì)算0.01 MOI所需的病毒量,將rGXAM-P-IFN-α-P3,rGXAM-P3感染至Marc-145細(xì)胞,每個(gè)病毒重復(fù)3個(gè)細(xì)胞孔,將細(xì)胞板放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定點(diǎn)收取12、24、36、48、60、72、96 h的病毒液,并對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)收取的病毒液進(jìn)行TCID50的測(cè)定,計(jì)算病毒滴度(lg TCID50/mL),用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的繪制。

1.2.6 重組病毒的穩(wěn)定性鑒定 將鑒定陽性的細(xì)胞培養(yǎng)物上清接種于Marc-145細(xì)胞,培養(yǎng)9代,并使用檢測(cè)ORF1b與ORF2a之間的外源基因的TF11804/PR12186引物對(duì)P3、P6、P9代的細(xì)胞上清液進(jìn)行RT-PCR鑒定。

1.2.7 抗病毒蛋白的測(cè)定 將PAM細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右匯合度時(shí),將rGXAM-P-IFN-α-P3和rGXAM-P3根據(jù)0.1 MOI病毒感染量感染PAM細(xì)胞,并設(shè)立陰性對(duì)照組。感染后12 h、24 h收取細(xì)胞,于-80℃保存。重復(fù)3次。病毒誘導(dǎo)PAM細(xì)胞表達(dá)的PKR、ISG-15、ISG-54蛋白基因由RT-qPCR檢測(cè),熒光定量PCR引物和看家基因GAPDH為引物(表2)應(yīng)用Roche LightCycler 96定量PCR儀檢測(cè)抗病毒蛋白相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本3次重復(fù),并用2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)果。

表2 本研究使用的qPCR引物

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

通過PCR擴(kuò)增出PK-15細(xì)胞的IFN-α片段,擴(kuò)增出570 bp的條帶(圖1),結(jié)果符合預(yù)期。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將克隆擴(kuò)增出的P-IFN-α片段克隆至載體pGXAM中,獲得重組質(zhì)粒pGXAM-P-IFN-α。用BstB I和SbfI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖2),除載體片段外,還切出約600 bp的片段,與預(yù)期大小相符,將重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序,結(jié)果顯示插入的片段為IFN-α。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000 ; 1.重組質(zhì)粒pGXAM-P-IFN-α的BstB I和Sbf I雙酶切

2.3 病毒的拯救與和間接免疫熒光鑒定

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞,在Marc-145細(xì)胞上盲傳3代,觀察Marc-145細(xì)胞上出現(xiàn)的CPE,收取細(xì)胞上清進(jìn)行RT-PCR鑒定,結(jié)果顯示拯救成功。P3代重組病毒感染Marc-145細(xì)胞,固定細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光鑒定(圖3),感染rGXAM-P-IFN-α和rGXAM細(xì)胞中可觀察到明顯的綠色熒光,而未感染病毒的細(xì)胞無熒光,表明rGXAM-P-IFN-α拯救成功。

A1～A2.rGXAM感染Marc-145細(xì)胞;B1～B2.rGXAM-P-IFN-α感染Marc-145細(xì)胞;C1～C2.Marc-145細(xì)胞

2.4 病毒的生長(zhǎng)曲線

對(duì)重組病毒的P3代進(jìn)行TCID50測(cè)定,按照Reed-Muench法計(jì)算出病毒滴度(表2)。將P3代病毒rGXAM和rGXAM-P-IFN-α根據(jù)0.01 MOI的感染量感染Marc-145細(xì)胞,收取12、24、36、48、60、72、84、96 h的病毒上清,根據(jù)各毒株各時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的繪制(圖4),感染36 h后,重組病毒每個(gè)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生的感染性病毒低于親本病毒,72 h時(shí)rGXAM-P-IFN-α病毒滴度最高,親本病毒rGXAM的病毒滴度84 h最高。

圖4 拯救病毒的生長(zhǎng)曲線

2.5 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性

將拯救成功的重組病毒在Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代,根據(jù)引物TF11804/PR12186對(duì)P3、P6、P9代的重組病毒針對(duì)ORF1b和ORF2a之間插入的目的基因進(jìn)行RT-PCR鑒定,并以rGXAM和pGXAM-P-IFN-α為對(duì)照(圖5),重組病毒無明顯缺失,可穩(wěn)定傳至P9代,回收重組病毒克隆至pMD18-T,對(duì)陽性菌液進(jìn)行測(cè)序,至P9代重組病毒均能穩(wěn)定遺傳。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ;1.rGXAM-P-IFN-α-P3;2.rGXAM-P-IFN-α-P6;3.rGXAM-P-IFN-α-P9;4.陰性對(duì)照;5.rGXAM;6.pGXAM-P-IFN-α

圖6 rGXAM-P-IFN-α的氨基酸比對(duì)結(jié)果

圖7 PAMs被感染12 h、24 h后PKR、ISG-15和ISG-54的轉(zhuǎn)錄水平

2.6 抗病毒蛋白的表達(dá)

拯救成功的重組病毒感染PAM細(xì)胞,病毒誘導(dǎo)PAM細(xì)胞表達(dá)PKR、ISG-15、ISG-54蛋白基因由RT-qPCR檢測(cè)。PAMs分別被rGXAM-P-IFN-α或親本株rGXAM感染,未感染的PAMs作為對(duì)照,在感染后在12 h和24 h時(shí)收取細(xì)胞總RNA。用實(shí)時(shí)RT-PCR定量檢測(cè)PKR、ISG-15、ISG-54的轉(zhuǎn)錄水平。用2-△△Ct計(jì)算結(jié)果顯示,與未感染的對(duì)照組相比,抗病毒基因mRNA水平發(fā)生了成倍的變化(*P<0.05; **P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001)。

3 討論

本研究成功構(gòu)建了以豬繁殖與呼吸綜合征病毒為載體表達(dá)豬Ⅰ型干擾素α的質(zhì)粒,并成功拯救出重組病毒rGXAM-P-IFN-α,該病毒在Marc-145細(xì)胞上能穩(wěn)定遺傳至P9代。對(duì)重組病毒的生長(zhǎng)特性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),rGXAM-P-IFN-α在36 h前與親本病毒rGXAM有著相似的生長(zhǎng)特性,36 h后rGXAM-P-IFN-α復(fù)制緩慢,病毒滴度顯著低于rGXAM,可能由于rGXAM-P-IFN-α病毒中IFN-α開始表達(dá)并刺激下游的抗病毒蛋白的產(chǎn)生,抑制PRRSV的復(fù)制。將rGXAM-P-IFN-α感染PAM細(xì)胞后的結(jié)果也證明了這一推測(cè),對(duì)感染重組病毒PAM細(xì)胞中的抗病毒蛋白進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)重組病毒rGXAM-P-IFN-α可上調(diào)IFN-α下游的PKR、ISG-15和ISG-54的轉(zhuǎn)錄水平,表明外源插入的IFN-α可以調(diào)節(jié)IFN信號(hào)通路,促進(jìn)PAM細(xì)胞的抗病毒狀態(tài),限制病毒的復(fù)制[11]。本研究成功構(gòu)建了以PRRSV為載體表達(dá)Ⅰ型α干擾素的重組病毒,為后續(xù)研制具有免疫調(diào)節(jié)作用的新型PRRSV疫苗奠定基礎(chǔ)。