桑田 王億平
[摘要]?目的?通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選慢性腎臟病(chronic?kidney?disease,CKD)可能的自噬關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)基因,同時(shí)預(yù)測(cè)治療CKD的潛在中藥藥物,探討致病的潛在靶點(diǎn)及治療藥物。方法?從基因表達(dá)總表(Gene?Expression?Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取CKD患者腎組織測(cè)序數(shù)據(jù)。采用生物信息學(xué)方法提取正常對(duì)照組與CKD患者組的自噬相關(guān)差異表達(dá)基因(differentially?expressed?autophagy-related?genes,DEARGs),并進(jìn)行基因本體(gene?ontology,GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes,KEGG)通路富集分析。通過(guò)支持向量機(jī)模型(support?vector?machine,SVM)確定關(guān)鍵基因。最后,通過(guò)Connectivity?Map平臺(tái)對(duì)關(guān)鍵基因篩選可能的治療CKD的中藥。結(jié)果?共獲得67個(gè)自噬相關(guān)差異基因,GO、KEGG富集分析表明DEARGs主要與巨自噬、自噬體、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等相關(guān)。并從2個(gè)(ATF6、GNAI3)關(guān)鍵基因篩選得到姜黃、澤瀉、丹參、地黃、五味子等多味具有潛在療效的中藥。結(jié)論?通過(guò)生物信息學(xué)分析,明確了在CKD進(jìn)展中關(guān)鍵自噬基因及潛在的治療性中藥,為CKD的臨床診治提供新思路。
[關(guān)鍵詞]?慢性腎臟病;自噬相關(guān)基因;生物信息學(xué);關(guān)鍵基因;中藥預(yù)測(cè)
[中圖分類號(hào)]?R692.5??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.008
Bioinformatics-based?screening?of?key?genes?for?autophagy?in?the?progression?of?chronic?kidney?disease?and?prediction?study?of?potential?Chinese?medicine
SANG?Tian1,?WANG?Yiping2
1.The?First?Clinical?Medical?College,?Anhui?University?of?Traditional?Chinese?Medicine,?Hefei?230038,?Anhui,?China;?2.Department?of?Nephrology,?the?First?Affiliated?Hospital?of?Anhui?University?of?Chinese?Medicine,?Hefei?230031,?Anhui,?China
[Abstract]?Objective?Screening?potential?autophagy?key?risk?genes?for?chronic?kidney?disease?(CKD)?through?bioinformatics?methods,?predicting?potential?traditional?Chinese?medicine?drugs?for?treating?CKD,?and?exploring?potential?pathogenic?targets?and?therapeutic?drugs.?Methods?In?this?study,?renal?tissue?sequencing?data?of?CKD?patients?were?obtained?from?the?Gene?Expression?Omnibus?(GEO)?database.?Bioinformatics?methods?were?used?to?extract?autophagy-related?differentially?expressed?genes?(DEARGs)?from?normal?control?and?CKD?patient?groups,?and?gene?ontology?(GO)?functional?analysis?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?(KEGG)?pathway?enrichment?analysis?were?performed.?Key?genes?were?identified?by?support?vector?machine?model?(SVM).?Finally,?the?key?genes?were?screened?for?possible?therapeutic?Chinese?medicines?by?the?Connectivity?Map?platform.?Results?A?total?of?67?autophagy-related?differential?genes?were?obtained,?and?GO,?KEGG?enrichment?analysis?showed?that?DEARGs?were?mainly?associated?with?macroautophagy,?autophagosome,?and?ubiquitin-like?protein?ligase?binding.?And?from?2?(ATF6,?GNAI3)?key?genes?screening,?we?obtained?several?herbal?medicines?with?potential?therapeutic?effects,?such?as?turmeric,?zedoary,?salvia,?dioscorea?and?schisandra.?Conclusion?Through?bioinformatics?analysis,?key?autophagy?genes?and?potential?therapeutic?traditional?Chinese?medicine?have?been?identified?in?the?progression?of?CKD,?providing?new?ideas?for?the?clinical?diagnosis?and?treatment?of?CKD.
[Key?words]?Chronic?kidney?disease;?Autophagy-related?genes;?Bioinformatics;?Key?genes;?Herbal?prediction
慢性腎臟?。╟hronic?kidney?disease,CKD)是一種漸進(jìn)性疾病,其特點(diǎn)是由于各種原因造成的腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變[1]。全世界約有10%的成年人受到某種形式的CKD的影響,每年造成120萬(wàn)人死亡和2800萬(wàn)人的生命損失[2-3]。然而,CKD的致病基因和分子機(jī)制尚未完全闡明。識(shí)別與該病相關(guān)的新的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)基因?qū)τ诎l(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義,有助于深入理解CKD的病理、生理過(guò)程,且對(duì)提升CKD的早期診斷和治療具有顯著意義。自噬是一種關(guān)鍵的穩(wěn)態(tài)機(jī)制,可清除各種受損或不需要的細(xì)胞內(nèi)成分,以在應(yīng)激條件下保護(hù)腎細(xì)胞。另外,自噬缺乏會(huì)增加腎臟損傷的易感性,導(dǎo)致腎功能下降、線粒體受損蓄積、嚴(yán)重腎纖維化和早期腎衰竭[4-5]。據(jù)報(bào)道,雙酚A(bisphenol?A,BPA)可通過(guò)升高的自噬相關(guān)基因5(autophagy-?related?gene?5,Atg5)、自噬相關(guān)基因7(autophagy-?related?gene?7,Atg7)、微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3B(Map1lc3b/?Lc3b)和Beclin-1基因水平調(diào)節(jié)自噬過(guò)程,加劇慢性腎損傷[6]。因此,需進(jìn)一步研究來(lái)明確自噬相關(guān)基因在CKD進(jìn)展中的作用,挖掘潛在的治療中藥,對(duì)CKD的診斷與治療具有重要意義。
本研究旨在通過(guò)從基因表達(dá)總表(Gene?Expression?Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)下載的整合基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來(lái)探索自噬相關(guān)基因在腎纖維化中的作用。利用支持向量機(jī)(support?vector?machine,SVM)模型確定關(guān)鍵自噬關(guān)鍵基因,對(duì)關(guān)鍵基因預(yù)測(cè)可能的治療中藥。本研究為研究CKD的分子機(jī)制和探索治療性中藥提供理論依據(jù)。
1??資料與方法
1.1??數(shù)據(jù)搜集
通過(guò)人類自噬數(shù)據(jù)庫(kù)獲得參與自噬的基因。利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得包含8名健康對(duì)照者和54例CKD患者的腎組織樣本的GSE66494數(shù)據(jù)集,基于平臺(tái)注釋文件將數(shù)據(jù)集中的探針標(biāo)識(shí)轉(zhuǎn)換為基因名,進(jìn)行批次矯正后用于后續(xù)篩選差異表達(dá)基因。
1.2??差異表達(dá)分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析
使用R包“l(fā)imma”分析232個(gè)自噬相關(guān)基因在健康對(duì)照者和CKD患者之間的差異表達(dá)水平,在|log2FC|>2和校正后的P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)下,得到不同的自噬相關(guān)差異表達(dá)基因(differentially?expressed?autophagy-related?genes,DEARGs),并利用ggplot2和pheatmap包進(jìn)行可視化處理。通過(guò)使用用于檢索相互作用基因的搜索工具(STRING?11.0)研究DEARGs的功能相互作用。然后通過(guò)Cytoscape?3.9.1構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein?interaction?networks,PPI)網(wǎng)絡(luò)。
1.3??GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
為進(jìn)一步研究自噬相關(guān)基因DEG的富集途徑和功能,將基因?qū)隓AVID?6.8,并通過(guò)使用R中的“ggplot2”包進(jìn)一步可視化富集結(jié)果。
1.4??機(jī)器學(xué)習(xí)篩選關(guān)鍵基因
利用基于e1071包的支持向量機(jī)-遞歸特征消除(support?vector?machine-recursive?feature?elimination,SVM-RFE)算法從重要DEG中篩選特征基因,同時(shí)根據(jù)關(guān)鍵基因在正常樣本和CKD患者樣本中的表達(dá)情況。利用受試者操作特征曲線(receiver?operating?characteristic?curve,ROC曲線)評(píng)估關(guān)鍵基因診斷CKD的有效性,并使用pROC包繪制關(guān)鍵基因的ROC曲線。
1.5??基于Coremine?Medical數(shù)據(jù)庫(kù)的中藥篩選
利用Coremine?Medical數(shù)據(jù)庫(kù)作為分析工具,將篩選得到的關(guān)鍵基因輸入該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過(guò)設(shè)置統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性閾值P<0.05,對(duì)基因與相應(yīng)中藥之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行映射,以識(shí)別具有潛在治療效果的中藥。
2??結(jié)果
2.1??差異表達(dá)分析和蛋白質(zhì)相互作用分析
從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提取232個(gè)自噬相關(guān)基因進(jìn)行差異分析,得到67個(gè)DEARGs,見(jiàn)圖1A。然后使用STRING?11.0研究67個(gè)DEARGs的功能相互作用,通過(guò)Cytoscape?3.9.0構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),如圖1B。
2.2??GO生物功能富集分析與KEGG途徑富集化分析
為進(jìn)一步探索67個(gè)DEARGs的富集途徑和功能,將基因?qū)隓AVID?6.8,并使用R中的“ggplot2”包進(jìn)一步可視化富集結(jié)果。這些基因主要參與大自噬、位于自噬體、主要表現(xiàn)為泛素?樣蛋白連接酶結(jié)合,見(jiàn)圖2A。KEGG分析表明139個(gè)DEARGs主要參與巨自噬、自噬調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)外部刺激的反應(yīng)等,見(jiàn)圖2B。
2.3??SVM篩選關(guān)鍵基因
為進(jìn)一步縮小自噬相關(guān)基因的范圍,使用SVM-?RFE算法對(duì)67個(gè)CKD的DEARGs進(jìn)行進(jìn)一步篩選,見(jiàn)圖3A,得到2個(gè)自噬關(guān)鍵基因ATF6、GNAI3。繪制ROC曲線對(duì)關(guān)鍵基因的診斷效能進(jìn)行評(píng)估,ROC曲線顯示ATF6、GNAI3在曲線下面積(area?under?the?curve,AUC)均接近1,即篩選出的2個(gè)關(guān)鍵基因?qū)^(qū)分CKD患者與健康對(duì)照者具有較高的診斷效能,見(jiàn)圖3B、圖3D。
2.4??中藥預(yù)測(cè)結(jié)果
將2個(gè)關(guān)鍵基因定位到Coremine?Medical數(shù)據(jù)庫(kù),根據(jù)P<0.05為條件篩選治療CKD的潛在中藥,獲得姜黃、澤瀉、丹參、地黃、五味子等多味中藥,見(jiàn)表1。
3??討論
各種慢性進(jìn)展性腎病的最終表現(xiàn)均為腎纖維化,腎纖維化是導(dǎo)致CKD發(fā)展到終末期腎臟疾病(end-stage?kidney?disease,ESRD)的主要病理基礎(chǔ),而自噬在纖維化相關(guān)的CKD的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[7]。因此,探索和發(fā)現(xiàn)自噬參與腎纖維化的潛在機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)CKD的潛在治療靶點(diǎn)極為重要。
本研究獲得67個(gè)差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因,并用于GO功能和KEGG通路分析,綜合DEARGs的富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因主要與巨自噬密切相關(guān)。在應(yīng)激條件下,巨自噬作為一種生存機(jī)制發(fā)揮重要作用,主要負(fù)責(zé)大分子、細(xì)胞膜和細(xì)胞器的更新,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[8]。這一過(guò)程通過(guò)循環(huán)利用受損和有毒的細(xì)胞組分,轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的構(gòu)建模塊,從而支持細(xì)胞抵御應(yīng)激反應(yīng)并維持能量平衡[9]。此外,巨噬細(xì)胞在調(diào)控炎癥反應(yīng)和纖維化過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色[10]。因此,自噬相關(guān)基因可能在腎纖維化的進(jìn)程中起重要作用。
SVM模型的進(jìn)一步構(gòu)建鑒定出2個(gè)自噬關(guān)鍵基因ATF6和GNAI3。ATF6(激活轉(zhuǎn)錄因子6)是一種重要的傳感器,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)時(shí)被激活。研究發(fā)現(xiàn)miR-185-5p可通過(guò)下調(diào)ATF6改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)并抑制上皮去分化,進(jìn)而改善腎纖維化[11]。其亞型ATF6α下調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α促進(jìn)脂毒性誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)纖維化[12]。因此ATF6可能成為防治CKD的有效靶點(diǎn)。GNAI3(G蛋白亞基αI3)是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與GNAI3相關(guān)的疾病包括耳髁綜合征1和耳髁綜合征[13-14]。有研究表明GNAI3可作為胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子和治療非酒精性脂肪性肝病的潛在新靶點(diǎn),還被鑒定為川崎病和結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤的關(guān)鍵調(diào)控基因[15-18]。然而,GNAI3在CKD中的作用尚未報(bào)道,需要對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。同時(shí),本研究繪制數(shù)據(jù)集的ATF6、GNAI3的ROC曲線結(jié)果顯示,ATF6和GNAI3的ROC?AUC接近1,表明這2個(gè)標(biāo)志物在區(qū)分CKD患者和非患者方面顯示出高度的診斷效能。但由于樣本量的限制,關(guān)鍵基因的診斷價(jià)值可能需要進(jìn)一步檢驗(yàn)。
近年來(lái)中醫(yī)藥在CKD防治中受到了更多的關(guān)注,在CKD的發(fā)展至ESRD的過(guò)程中,中醫(yī)藥在緩解臨床表現(xiàn)、減緩疾病進(jìn)展速度及延后腎臟替代療法啟動(dòng)時(shí)間等方面展現(xiàn)出顯著的療效優(yōu)勢(shì)。本文以自噬關(guān)鍵基因篩選治療CKD的潛在中藥,得到丹參、澤瀉、地黃、姜黃和五味子等多味中藥。研究發(fā)現(xiàn)姜黃中的姜黃素具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等作用,并可通過(guò)腺苷酸激活蛋白激酶信號(hào)通路促進(jìn)自噬從而減輕大鼠糖尿病腎病的腎臟纖維化[19]。地黃的主要活性成分地黃多糖通過(guò)緩解CKD大鼠冠脈鈣化,抑制冠脈血管平滑肌細(xì)胞中TRPC1/6蛋白的表達(dá)并促進(jìn)自噬[20]。在單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的大鼠腎臟病理模型中,丹參的主要活性成分丹酚酸B通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。具體而言,丹酚酸B可通過(guò)上調(diào)LC3-Ⅱ和Beclin1的表達(dá),同時(shí)下調(diào)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian?target?of?rapamycin,mTOR)的表達(dá),從而激活自噬過(guò)程,并對(duì)抗腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展[21]。另外,澤瀉在此模型中展現(xiàn)出對(duì)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的顯著抑制作用,減輕腎間質(zhì)纖維化,并觀察到腎小管上皮細(xì)胞中C3蛋白表達(dá)的下調(diào),這表明澤瀉可能通過(guò)影響C3途徑來(lái)抑制間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的過(guò)程[22]。五味子中的有效成分五味子乙素可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白LC3對(duì)缺氧/復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞的凋亡有一定的保護(hù)作用[23]。木通中的有效成分馬兜鈴酸在低劑量引起的腎損傷過(guò)程中可能發(fā)生自噬,且自噬減輕腎臟損傷;馬兜鈴酸高劑量引起的腎損傷過(guò)程中可能發(fā)生過(guò)度自噬,且自噬加重腎臟損傷,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)p53蛋白表達(dá)相關(guān)[24]。
總之,本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法,為CKD與自噬之間聯(lián)系的進(jìn)一步研究提供新的見(jiàn)解和潛在靶點(diǎn)。篩選的關(guān)鍵基因及中藥可為后續(xù)深入理解CKD的分子機(jī)制和開(kāi)發(fā)治療藥物奠定理論基礎(chǔ)。本研究存在一定的不足,如關(guān)鍵基因ATF6、GNAI3的表達(dá)水平,可能需要進(jìn)一步的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫印跡或免疫組織化學(xué)驗(yàn)證。
利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。
[參考文獻(xiàn)]
(收稿日期:2023–04–14)
(修回日期:2024–01–31)