陳文倩 杜瑋 于文貞

北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科 北京大學(xué)人民醫(yī)院眼視光中心 北京大學(xué)人民醫(yī)院眼病與視光醫(yī)學(xué)研究所 視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病診治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部眼視光學(xué)院,北京 100044

角膜是重要的屈光介質(zhì)之一,無(wú)血管是其維持光學(xué)透明的主要原因之一[1-2]。但在缺氧、炎癥、創(chuàng)傷等情況下,角膜緣血管網(wǎng)的新生血管容易生長(zhǎng)到角膜內(nèi),對(duì)角膜的透光性造成損害,從而導(dǎo)致視力下降,稱為角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)[3-4]?，F(xiàn)有的CNV治療方法存在一定缺陷和局限性,如糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的青光眼、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth cell,VEGF)藥物對(duì)于成熟CNV效果較差、光動(dòng)力療法對(duì)周?chē)悄ず徒悄ぞ壐杉?xì)胞造成損害等[2,5]。CNV治療方法的部分有效性和相關(guān)不良反應(yīng)提示我們,需要探索新的CNV治療方法。Kringle結(jié)構(gòu)域廣泛存在于纖溶酶原和載脂蛋白中,在抑制血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用,尤其是Kringle V(KV)[6-10]。KV可抑制胃癌、肝細(xì)胞癌和CNV等的形成[11-13],KV來(lái)源的十一肽KV11(YTMNPRKLFDY)對(duì)視網(wǎng)膜新生血管具有明顯抑制作用[14-15]。然而,短肽存在不穩(wěn)定、生物膜滲透性較差等缺點(diǎn)[16-18]。因此,需要一種藥物載體協(xié)助KV11在體內(nèi)穩(wěn)定發(fā)揮抑制血管生成的作用。外泌體(exosome,EXO)是各種細(xì)胞分泌的直徑為30～150 nm的胞外囊泡[19-20],可以作為藥物的微載體直接將藥物遞送入細(xì)胞,增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性,延長(zhǎng)藥物半衰期[21-22]。Gao等[23]研究發(fā)現(xiàn)了一種名為CP05的錨定肽,可以靶向EXO膜標(biāo)記蛋白CD63,從而負(fù)載藥物。Dong等[24]利用CP05將KV11負(fù)載到EXO上,發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)可以通過(guò)侵襲性較低的方式較好地治療視網(wǎng)膜新生血管。然而,EXO-KV11對(duì)CNV的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究擬探討EXO負(fù)載抗新生血管短肽KV11在CNV中的作用和相關(guān)機(jī)制,以期為EXO-KV11可能的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞及動(dòng)物來(lái)源 原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購(gòu)自浙江美森科技有限公司。8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠100只,體質(zhì)量180～220 g,購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào):SCXK(京)2019-0008]。其中10只大鼠不做任何處理,為正常對(duì)照組;其余大鼠均經(jīng)角膜堿燒傷構(gòu)建CNV模型。本研究經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào):20210019),所有動(dòng)物操作均符合視覺(jué)與眼科學(xué)協(xié)會(huì)及北京大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)的規(guī)定。

1.1.2主要試劑及儀器 短肽KV11(YTMNPRKLFDY)、KV11(CP05)(YTMNPRKLFDYCRHSQMTVSRL)、FITC標(biāo)記的KV11(CP05)(蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司);ECM培養(yǎng)基(美國(guó)Sciencell公司);總EXO提取試劑(細(xì)胞培養(yǎng)基)、Bis-Tris預(yù)制膠、MOPS SDS電泳緩沖液、MES SDS電泳緩沖液、RIPA溶液(美國(guó)Thermo公司);0.22 μm、0.45 μm NC膜(德國(guó)Merck Millipore公司);蛋白酶抑制劑混合物(蘇州新賽美生物科技有限公司);電轉(zhuǎn)緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒(北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司);TBS封閉液(美國(guó)LI-COR公司);兔抗四跨膜蛋白30(tetraspanin 30,CD63)多克隆抗體(25682)、兔抗電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)多克隆抗體(55259)、兔抗半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)多克隆抗體(19677)、鼠抗β-actin單克隆抗體(66009)(武漢Proteintech公司);兔抗蛋白質(zhì)激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)單克隆抗體(C33E10)、兔抗自噬接頭蛋白1(sequestosome-1,SQSTM1/p62)單克隆抗體(D10E10)(美國(guó)Cell Signaling Technology公司);兔抗血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)多克隆抗體(ab281583)、兔抗自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3B)單克隆抗體(ab192890)(美國(guó)Abcam公司);CruzFluorTM790標(biāo)記小鼠抗兔IgG(sc-516253)、CruzFluorTM790標(biāo)記小鼠IgG κ結(jié)合蛋白(sc-516181)(美國(guó)Santa Cruz公司);異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖酐(FITC-dextran,相對(duì)分子質(zhì)量2 000 000)(德國(guó)Sigma公司);異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)。Olympus BX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司);Apogee A-50微流式細(xì)胞儀(美國(guó)Apogee公司);石蠟切片機(jī)、透射電子顯微鏡JEM-1400(德國(guó)Leica公司);Nanosight NS300納米跟蹤分析儀(英國(guó)Malvern公司);裂隙燈顯微鏡(日本拓普康公司);Odyssey Clx顯影儀(美國(guó)LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs用ECM完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí),將細(xì)胞消化常規(guī)傳代或低溫保存。取第3～6代HUVECs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞 取細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定30 min,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗3次,每次5 min;滴加5%Triton X-100,室溫下孵育15 min,甩干載玻片上的液滴,滴加封閉液,室溫下孵育1 h;甩干載玻片上的封閉液,加CD31抗體50 μl,4 ℃孵育過(guò)夜;PBS洗3次,每次5 min;加入熒光二抗50 μl,室溫下避光孵育1 h;PBS洗3次,每次5 min;加入50 μl DAPI染核10 min,PBS洗3次,每次5 min;抗熒光猝滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3HUVECs源EXO的提取和鑒定 實(shí)驗(yàn)前將胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)以100 000×g超速離心16 h以耗竭FBS源EXO。通過(guò)總EXO分離試劑盒(細(xì)胞培養(yǎng)基)分離HUVECs來(lái)源的EXO。將HUVECs在T75中培養(yǎng)48～72 h,收集培養(yǎng)液,2 000×g離心30 min,棄去細(xì)胞和碎片。將上清液與1/2體積的總EXO分離試劑在4 ℃下孵育過(guò)夜。將混合物在4 ℃下10 000×g離心1 h。每毫升上清生成的EXO沉淀用10 μl生理鹽水重懸,并采用納米粒子跟蹤分析、透射電子顯微鏡觀察EXO的濃度和大小形態(tài),采用Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行EXO標(biāo)志物鑒定。BCA檢測(cè)EXO蛋白質(zhì)量濃度約為2 μg/μl。

1.2.4EXO-KV11的合成和鑒定 FITC標(biāo)記的KV11(CP05)與EXO在4 ℃下避光孵育過(guò)夜。通過(guò)配備488 nm激發(fā)光的Apogee A-50微流式細(xì)胞儀檢測(cè)EXO負(fù)載KV11的效率。Apogee參考混合珠由折射率為1.42且直徑為180、240、300、590、880、1 300 nm非熒光二氧化硅微球和折射率為1.59且直徑為110 nm和500 nm的綠色熒光乳膠球組成。使用Apogee參考混合珠進(jìn)行校正,樣品上樣進(jìn)行檢測(cè),采樣速度為0.75 μl/min,樣品體積不小于150 μl,采樣時(shí)間為180 s。EXO濃度和熒光陽(yáng)性事件數(shù)(n)根據(jù)樣品體積、細(xì)胞儀流速自動(dòng)測(cè)量。采用中角光散射和488 nm熒光觸發(fā)通道,并定義帶有FITC熒光、直徑為30～180 nm的顆粒為EXO-KV11(FITC)陽(yáng)性事件。

1.2.5大鼠角膜堿燒傷誘導(dǎo)CNV模型的建立 采用2.5%異氟醚麻醉大鼠。直徑為3 mm的圓形濾紙片浸于1 mol/L NaOH溶液中30 s,吸水紙吸去多余液體,燒灼大鼠角膜中心30 s(第0天),用15 ml生理鹽水充分清洗結(jié)膜囊以去除殘余的NaOH溶液。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將堿燒傷角膜大鼠分為EXO-KV11組30只、KV11組30只和生理鹽水組30只(本課題組體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單純EXO組與生理鹽水組指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)排除了單純EXO這一對(duì)照組)。從堿燒傷后第1天開(kāi)始,各組分別每隔1 d給予結(jié)膜下注射100 μl EXO-KV11(25 μg)、KV11(25 μg)或生理鹽水。在第1、4、7、14天,裂隙燈顯微鏡下觀察CNV生長(zhǎng)情況并拍照。

1.2.6大鼠CNV相對(duì)熒光面積定量分析 參照文獻(xiàn)[25]中的方法對(duì)裂隙燈顯微鏡下的角膜照片進(jìn)行CNV定量分析。測(cè)量角膜緣血管長(zhǎng)度(L)和角膜鐘時(shí)數(shù)(C),CNV面積=C/12×3.141 6[r2-(r-L)2],其中r=3 mm,為大鼠角膜半徑。為了進(jìn)一步精確計(jì)算CNV面積,通過(guò)FITC-dextran心室灌注、角膜血管造影計(jì)算角膜熒光面積與角膜總面積的比值來(lái)定量分析CNV相對(duì)熒光面積[26]。采用氯胺酮(80 mg/kg)/噻拉嗪(10 mg/kg)麻醉大鼠,左心室灌注25 mg/ml FITC-dextran 1 ml;1 min后,摘取眼球并在4%多聚甲醛溶液中固定30 min。眼球后節(jié)組織分離后將大鼠角膜平均剪成4瓣平鋪在玻片上,熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用Image Pro Plus 6軟件檢測(cè)CNV熒光面積與角膜總面積的比值,定量分析CNV相對(duì)熒光面積。

1.2.7蘇木精-伊紅染色觀察各組CNV管腔數(shù)量 每組選取6只大鼠,于14 d過(guò)量麻醉處死后摘取眼球,4%多聚甲醛固定24 h,置于55%乙醇中過(guò)夜,梯度乙醇(60%、70%、80%、90%、100%)脫水,二甲苯透明5 min,浸蠟1 h,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片,37 ℃烤片過(guò)夜。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蘇木精-伊紅染色,觀察各組角膜形態(tài)和基質(zhì)CNV數(shù)量。

1.2.8免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠角膜組織中CD31的表達(dá)分布 每組取8只大鼠,將組織石蠟切片置于60 ℃烤箱中烤片2 h,PBS浸洗后放入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液,100 ℃水浴30 min修復(fù)抗原;自然冷卻后于3%H2O2溶液中室溫孵育10 min,10%山羊血清溶液中室溫封閉30 min;滴加兔抗CD31一抗(1∶500),4 ℃孵育過(guò)夜;PBS浸洗3次,滴加山羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗(1∶100),室溫孵育30 min;PBS浸洗3次,滴加適當(dāng)比例的HRP標(biāo)記鏈霉卵白素,室溫孵育30 min,滴加DAB顯色液顯色15 s～3 min,顯微鏡下觀察組織呈褐色,立即放入水中中止反應(yīng),采用蘇木素染液復(fù)染核。切片用中性樹(shù)脂封片后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9Western blot法檢測(cè)VDAC1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量 每組取5只大鼠,HUVECs和角膜組織的蛋白通過(guò)RIPA裂解液提取。制備好的蛋白樣品通過(guò)SDS凝膠電泳后電轉(zhuǎn)到0.22或0.45 μm的NC膜上,封閉液封閉1.5 h,分別加入CD63、VDAC1、PERK、p62、LC3B、caspase 3或β-actin(均1∶1 000稀釋)抗體,4 ℃下孵育過(guò)夜;TBST洗3次后分別用相應(yīng)二抗常溫下避光孵育1 h,在Odyssey Clx顯影儀上顯影。采用ImageJ軟件定量分析條帶,以β-actin為內(nèi)參,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值;LC3B蛋白表達(dá)量=LC3BⅡ灰度值/LC3BⅠ灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HUVECs形態(tài)觀察及表型鑒定

原代HUVECs傳代培養(yǎng)至第3～6代,細(xì)胞形態(tài)均勻一致,呈鋪路石樣。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,第3代HUVECs高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31(圖1)。

圖1 HUVECs形態(tài)及CD31表達(dá) A:第3～6代HUVECs呈鋪石路樣形態(tài)(×100,標(biāo)尺=200 μm) B:HUVECs CD31染色陽(yáng)性(×400,標(biāo)尺=100 μm) C:DAPI染色見(jiàn)細(xì)胞核居于細(xì)胞中央(×400,標(biāo)尺=100 μm) D:圖B和C的融合圖(×400,標(biāo)尺=100 μm)Figure 1 Morphological observation of HUVECs and expression of CD31 A:The paving-stone pattern of primary HUVECs at passage 3-6 under a microscope (×100,scale bar=200 μm) B:HUVECs positive for CD31 staining (×400,scale bar=100 μm ) C:DAPI staining showed that the nuclei were in the center of cells (×400,scale bar=100 μm) D:Emerged images B and C (×400,scale bar=100 μm)

2.2 EXO的鑒定及其與KV11(CP05)的結(jié)合效率

通過(guò)透射電子顯微鏡、納米粒徑分析儀和Western blot法鑒定EXO,結(jié)果顯示提取的EXO為雙面凹的杯狀囊泡(圖2A);平均直徑為127 nm,濃度為(2.15×109±6.55×107)particles/ml(圖2B);EXO標(biāo)志蛋白CD63陽(yáng)性(圖2C)。Apogee流式檢測(cè)不同濃度比(EXO∶KV11=2∶1、1∶1、1∶2、1∶4)下EXO負(fù)載KV11的效率,結(jié)果表明當(dāng)EXO∶KV11=1∶4(6.25 μg/ml∶25 μg/ml)時(shí),結(jié)合效率最佳,為87.5%,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用此濃度(圖2D)。

圖2 外泌體的形態(tài)及其與KV11(CP05)的結(jié)合效率 A:HUVECs來(lái)源的外泌體透射電子顯微鏡圖像(×100 000,標(biāo)尺=200 nm) B:納米粒徑分析HUVECs來(lái)源的外泌體大小分布 C:Western blot分析HUVECs來(lái)源外泌體中CD63蛋白表達(dá) D:Apogee流式檢測(cè)外泌體與FITC標(biāo)記的KV11(CP05)不同濃度比下結(jié)合形成EXO-KV11(FITC)的效率[橙色方框圈出EXO-KV11(FITC)陽(yáng)性事件] EXO:外泌體Figure 2 Morphology of exosomes and its binding efficacy with KV11 (CP05) A:Transmission electron microscopy image of HUVECs-derived exosomes (×100 000,scale bar=200 nm) B:Nano-particle size analysis of the size distribution of HUVECs-derived exosomes C:Expression of CD63 protein in HUVECs-derived exosomes by Western blot D:Apogee flow system analysis for the efficiency of exosomes binding to FITC-labeled KV11 (CP05) at different concentration ratios (orange box indicated EXO-KV11 (FITC) positive events) EXO:exosome;KV:kringle V

2.3 各組CNV不同指標(biāo)及CD31表達(dá)情況比較

2.3.1各組大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)裂隙燈顯微鏡下CNV形成比較 堿燒傷1 d,各組角膜中央基質(zhì)混濁,球結(jié)膜充血,角膜組織幾乎無(wú)新生血管長(zhǎng)入;堿燒傷4 d,可見(jiàn)各組新生血管芽從角膜緣長(zhǎng)入角膜;堿燒傷7 d,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組和生理鹽水組;堿燒傷14 d,EXO-KV11組和KV11組CNV面積均小于生理鹽水組,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組(圖3)。堿燒傷后7 d和14 d,各組CNV面積總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.613、15.590,均P<0.05),其中堿燒傷后7 d,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組和生理鹽水組;堿燒傷14 d,EXO-KV11組和KV11組CNV面積均小于生理鹽水組,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠角膜堿燒傷后7 d 和14 d CNV面積比較 (,mm2)Table 1 Comparison of CNV area after corneal alkali-burn injury in rats on days 7 and 14 among various groups (,mm2)

圖3 各組大鼠堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)裂隙燈顯微鏡下圖像(×16) 堿燒傷1 d,各組大鼠角膜中央基質(zhì)混濁,球結(jié)膜充血,角膜組織幾乎無(wú)新生血管長(zhǎng)入;堿燒傷4 d,各組新生血管芽從角膜緣長(zhǎng)入角膜;堿燒傷7 d,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組和生理鹽水組;堿燒傷14 d,EXO-KV11組和KV11組CNV面積均小于生理鹽水組,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組 箭頭示CNV EXO:外泌體Figure 3 Slit-lamp images of rat eyeballs at different time points after corneal alkali burns in each group (×16) On day 1 after alkali burn,cloudy central corneal matrix and congested bulbar conjunctiva were seen,and almost no new blood vessels grew in corneal tissue.On day 4 after alkali burn,neovascularization buds grew from the corneal limbus into the cornea could be seen in each group.On day 7 after alkali burn,the CNV area was smaller in EXO-KV11 group than in KV11 and normal saline groups.On day 14 after alkali burn,the CNV area was smaller in EXO-KV11 and KV11 groups than in normal saline group,and was smaller in EXO-KV11 group than in KV11 group The arrows showed CNV EXO:exosome;KV:kringle V

2.3.2各組大鼠CNV相對(duì)熒光面積比較 角膜堿燒傷后14 d,生理鹽水組新生血管已長(zhǎng)入角膜中央,CNV熒光面積最大,新生血管密集,迂曲擴(kuò)張;KV11組CNV相對(duì)熒光面積較生理鹽水組小,新生血管密度較稀疏,迂曲擴(kuò)張程度較輕;EXO-KV11組CNV面積最小,新生血管密度稀疏,迂曲擴(kuò)張程度最輕。角膜熒光鋪片定量分析結(jié)果顯示,生理鹽水組、KV11組和EXO-KV11組CNV相對(duì)熒光面積分別為(8.3±1.7)%、(5.2±1.6)%和(3.4±0.7)%,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.735,P<0.01),其中KV11組和生理鹽水組CNV相對(duì)熒光面積均大于EXO-KV11組,生理鹽水組CNV相對(duì)熒光面積大于KV11組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖4)。

圖4 各組CNV相對(duì)熒光面積比較 A:各組堿燒傷后14 d角膜熒光鋪片(FITC-dextran ×40,標(biāo)尺=1 mm)(A1:EXO-KV11組;A2:KV11組;A3:生理鹽水組) B:CNV熒光面積與角膜總面積之比的定量分析 F=11.735,P<0.01.與EXO-KV11組比較,aP<0.05;與KV11組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn),n=8) 1:EXO-KV11組;2:KV11組;3:生理鹽水組 CNV:角膜新生血管Figure 4 Comparison of CNV fluorescence area among various groups A:Corneal fluorescence flat mounts on day 14 after alkali burn in different groups (FITC-dextran ×40,scale bar=1 mm) (A1:EXO-KV11 group;A2:KV11 group;A3:normal saline group) B:Quantitative analysis of the ratio of the CNV area to the total cornea area F=11.735,P<0.01.Compared with EXO-KV11 group,aP<0.05;compared with KV11 group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=8) 1:EXO-KV11 group;2:KV11 group;3:normal saline group CNV:corneal neovascularization

2.3.3各組大鼠角膜組織形態(tài)學(xué)特征比較 堿燒傷后14 d,生理鹽水組基質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量新生血管管腔;KV11組基質(zhì)內(nèi)新生血管管腔數(shù)量較生理鹽水組少;EXO-KV11組角膜結(jié)構(gòu)趨于正常,少見(jiàn)新生血管管腔(圖5)。

圖5 各組大鼠角膜組織形態(tài)學(xué)特征比較(HE ×200,標(biāo)尺=25 μm) A:角膜基質(zhì)纖維趨于正常,少見(jiàn)血管管腔 B:角膜基質(zhì)纖維紊亂,可見(jiàn)新生血管管腔 C:角膜基質(zhì)纖維嚴(yán)重紊亂,可見(jiàn)大量新生血管管腔 圖6 各組CD31表達(dá)情況比較(DAB ×200,標(biāo)尺=25 μm) A:EXO-KV11組可見(jiàn)少量CD31陽(yáng)性細(xì)胞圍成的管腔 B:KV-11組CD31陽(yáng)性細(xì)胞圍成的管腔增多 C:生理鹽水組可見(jiàn)大量CD31陽(yáng)性細(xì)胞圍成的管腔 CD31陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色Figure 5 Comparison of corneal histomorphologic characteristics of rats among various groups (HE ×200,scale bar=25 μm) A:Corneal stromal fibers seemed normal,and vascular lumen was rare B:Corneal stromal fibers were disturbed,and neovascular lumens were visible C:Corneal stromal fibers were seriously disturbed,and a large number of neovascular lumens were seen Figure 6 Comparison of CD31 expression among different groups (DAB ×200,scale bar=25 μm) A:A few lumens surrounded by CD31-positive cells were seen in the EXO-KV11 group B:More lumens surrounded by CD31-positive cells were seen in the KV-11 group C:A large number of lumens surrounded by CD31-positive cells were seen in the normal saline group Brown color for CD31-positive cells

2.3.4各組CD31表達(dá)情況比較 角膜免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,堿燒傷后14 d,生理鹽水組角膜基質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量CD31染色陽(yáng)性細(xì)胞,細(xì)胞圍成大小不一的管腔結(jié)構(gòu);KV11組角膜基質(zhì)內(nèi)CD31染色陽(yáng)性細(xì)胞圍成的管腔數(shù)量較生理鹽水組少,EXO-KV11組較KV11組少(圖6)。

2.4 各組VDAC1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,EXO-KV11組、KV11組、生理鹽水組和正常對(duì)照組大鼠角膜組織中VDAC1、PERK、p62、cleaved caspase 3相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.960、8.947、17.791、101.168,均P<0.01),其中EXO-KV11組VDAC1、PERK、p62、cleaved caspase 3相對(duì)表達(dá)量高于KV11組和生理鹽水組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。各組LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.445,P=0.727)(表2,圖7)。

表2 各組大鼠角膜組織中VDAC1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較()Table 2 Comparison of the expression levels of VDAC1,endoplasmic reticulum stress and apoptosis-associated proteins in rat cornea among various groups ()

圖7 Western blot檢測(cè)角膜堿燒傷后各組角膜組織中VDAC1、PERK、p62、LC3BⅡ/LC3BⅠ、cleaved caspase 3的表達(dá) 1:EXO-KV11組;2:KV11組;3:生理鹽水組;4:正常對(duì)照組 VDAC1:電壓依賴性陰離子通道1;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白;PERK:蛋白質(zhì)激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶;p62/SQSTM1:自噬接頭蛋白1;LC3B:自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3B;cleaved caspase 3:活化半胱氨酸蛋白酶3Figure 7 Expressions of VDAC1,PERK,p62,LC3BⅡ/LC3BⅠ,and cleaved caspase 3 in corneal tissue after corneal alkali burn in different groups by Western blot 1:EXO-KV11 group;2:KV11 group;3:normal saline group;4:normal control group VDAC1:voltage-dependent anion channel 1;PERK:protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;p62/SQSTM1:sequestosome-1;LC3B:microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B

3 討論

CNV可造成嚴(yán)重的視力損害,目前臨床上已有的CNV治療方式均存在一定不足[27],仍需進(jìn)一步研究抗CNV藥物。

近年來(lái),大量研究表明EXO作為天然發(fā)生的細(xì)胞外囊泡可以增加藥物遞送效率和穩(wěn)定性[28-29]。有研究發(fā)現(xiàn),CP05可以通過(guò)非共價(jià)鍵方式與EXO 4次跨膜蛋白CD63結(jié)合,通過(guò)多肽與CP05的融合可以使EXO負(fù)載多肽[30]。因此,本研究將CP05與KV11體外融合,并與EXO孵育形成EXO-KV11,結(jié)果顯示當(dāng)EXO∶KV11=1∶4(6.25 μg/ml∶25 μg/ml)時(shí),結(jié)合效率最佳,為87.5%,說(shuō)明KV11能夠通過(guò)CP05與EXO高效結(jié)合。本研究中裂隙燈顯微鏡下眼前節(jié)照相定量分析結(jié)果表明,EXO-KV11能夠早于KV11抑制CNV;角膜熒光鋪片、CD31免疫組織化學(xué)染色和蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示,EXO-KV11對(duì)CNV的抑制效果優(yōu)于KV11。

既往研究已證實(shí),線粒體VDAC1是纖溶酶原來(lái)源KV的受體,KV通過(guò)激活VDAC1誘導(dǎo)血管內(nèi)皮凋亡[31-32]。VDAC1定位于線粒體外膜,調(diào)節(jié)線粒體和細(xì)胞其他部分的代謝和能量交流,在線粒體介導(dǎo)的凋亡中起重要作用。其中,VDAC1參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體交流,調(diào)節(jié)自噬和炎癥[33]。目前尚不明確KV11是否是KV結(jié)構(gòu)域與VDAC1作用的有效激活片段。本研究結(jié)果顯示,EXO-KV11能顯著促進(jìn)VDAC1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感受器PERK的表達(dá),活化凋亡蛋白caspase 3,表明EXO-KV11在CNV中能夠激活VDAC1,促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn),自噬在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活下起到促生存的作用[34],LC3BⅠ轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合形式的LC3BⅡ表明自噬流的進(jìn)行,自噬中晚期標(biāo)志蛋白p62的表達(dá)水平增加表明自噬溶酶體降解過(guò)程受阻,自噬流受阻[35]。本研究結(jié)果顯示,EXO-KV11增加p62表達(dá),而EXO-KV11組LC3BⅡ/LC3BⅠ比值與生理鹽水組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明EXO-KV11阻滯自噬中晚期降解過(guò)程,自噬流受阻。因此,EXO-KV11誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白的堆積和自噬流消化錯(cuò)誤折疊蛋白這一途徑的阻滯,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)障礙,從而發(fā)生凋亡。值得注意的是,在抑制CNV中,KV11的表現(xiàn)與EXO-KV11截然不同,KV11不能改變VDAC1和PERK表達(dá),表明KV11在CNV中不能激活VDAC1,不能通過(guò)PERK激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;KV11下調(diào)了p62的表達(dá),但KV11組LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值與生理鹽水組比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明KV11可能是從與EXO-KV11不同的途徑改變了自噬流的進(jìn)程。同時(shí),KV11活化caspase 3,促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

綜上所述,本研究結(jié)果表明EXO-KV11通過(guò)激活VDAC1和阻滯自噬流等相關(guān)途徑抑制CNV,且EXO-KV11的抑制效果優(yōu)于單獨(dú)的KV11短肽。盡管關(guān)于EXO-KV11抑制視網(wǎng)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)已有開(kāi)展[24],但EXO-KV11對(duì)于新生血管的抑制機(jī)制仍不明確。鑒于VDAC1是KV的受體且VDAC1在線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交流及線粒體介導(dǎo)的凋亡中起到重要作用,以上結(jié)果提示EXO-KV11抑制CNV的作用機(jī)制可能與VDAC1的激活相關(guān),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬也參與其中,這為新生血管性眼病的治療靶點(diǎn)研究提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),VDAC1有望成為抑制新生血管的新靶點(diǎn)。本研究仍存在一定局限性,如EXO作為運(yùn)輸藥物的載體,進(jìn)入細(xì)胞后的運(yùn)輸是否會(huì)影響藥物本身的作用途徑尚不明確,正如本研究發(fā)現(xiàn)EXO-KV11和KV11在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬方面不同的分子機(jī)制,仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明陳文倩:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、統(tǒng)計(jì)分析、起草文章;杜瑋:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對(duì)文章知識(shí)性內(nèi)容進(jìn)行審閱和智力性內(nèi)容修改;于文貞:直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱及定稿