黃子健 盧澤芳 王立英

櫻桃又名車?yán)遄?，有“百果第一枝”的美譽(yù)，被譽(yù)為“水果中的鉆石”。櫻桃富含多酚和維生素C等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗炎、抗氧化，預(yù)防高血壓、心血管疾病以及補(bǔ)血等作用。櫻桃肉質(zhì)柔嫩、皮薄多汁，容易受到葡萄孢屬、草酸青霉的影響出現(xiàn)腐爛。本研究對(duì)櫻桃在貯藏過程中出現(xiàn)的腐爛組織塊進(jìn)行了分析，分離及純化出致病菌，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)定序列，進(jìn)行其系統(tǒng)發(fā)展樹的繪制，以期為櫻桃的相關(guān)研究提供參考。

一、材料與試劑

1.材料。櫻桃，產(chǎn)地大連。

2.試劑與儀器。70%乙醇、胰胳大豆胨培養(yǎng)基（TSB）、瓊脂粉、細(xì)菌基因組提取試劑盒、磁珠法細(xì)菌和真菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖、PCR產(chǎn)物磁珠法純化試劑盒、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、電子天平、離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、測(cè)序儀、BGI 2xSuper PCR Mix（with dye）、BGI D2000 Plus DNA Ladder

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.胰胳大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）配備。按照胰胳大豆胨培養(yǎng)基（TSB）的說明書，按比例配備胰胳大豆胨液體培養(yǎng)基，加入體積的18%配成胰胳大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）。

2.致病菌分離純化。用手術(shù)刀切除腐爛部分的櫻桃，將其浸泡在70%乙醇溶液中約30s，迅速置于無菌紙上，使其吸干乙醇溶液。隨后用無菌水清洗組織塊，然后植入預(yù)備好的TSA培養(yǎng)基中，在28℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h。通過這種培養(yǎng)方法，獲得兩種形態(tài)不同的真菌，利用接種環(huán)進(jìn)行挑離并劃線傳代，在分離純化3-4次后獲得兩株純菌株A1和A2。

3.光學(xué)顯微鏡鏡檢。觀察A1和A2兩個(gè)菌株在TSA平板上生長(zhǎng)的菌落，隨后用無菌針挑取菌落的一小部分，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢查，研究菌落的外觀特征。

4.基因組DNA提取。（1）柱式法提取。取一個(gè)2mL的離心管，加入200?L的預(yù)處理液和適量小玻璃珠，然后加入相應(yīng)量的菌樣品，將混合物放入研磨儀中進(jìn)行研磨。加入20?L蛋白酶K（Proteinase K），再加入200?L裂解液，充分顛倒混勻，在70℃環(huán)境下放置10min。加入200?L無水乙醇，進(jìn)行充分顛倒混勻，最后輕輕離心以去除管蓋內(nèi)的液滴。接著進(jìn)行吸附柱處理，用洗滌液洗滌一次，隨后進(jìn)行兩次漂洗液的洗滌。將吸附柱放置在室溫下3-5min，確保吸附材料中的殘留漂洗液充分晾干。將吸附柱內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到新的離心管中，向吸附膜的中間位置懸滴50-100?L雙重去離子水（ddH2O），在室溫下靜置3-5min，以12000r/min的速度離心2min，將溶液收集到離心管中。

（2）磁珠法提取。按照試劑盒說明書分裝樣品板、磁珠板、洗滌板、洗脫板，并放置提取儀對(duì)應(yīng)工位，運(yùn)行細(xì)菌提取程序至結(jié)束。

5.18S擴(kuò)增。對(duì)真菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用表1中列出的引物。每個(gè)PCR反應(yīng)體系的總體積為25?L，其中PCR Mix占比21?L，正向引物和反向引物各占比1?L，模板DNA占比2?L。

6.PCR產(chǎn)物分析和提純。取3?L的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，觀察DNA條帶的特征。通過凝膠成像分析系統(tǒng)檢查PCR擴(kuò)增后的DNA條帶是否明顯。為了純化PCR產(chǎn)物，采用磁珠純化標(biāo)準(zhǔn)操作流程：根據(jù)物質(zhì)的電荷特性，在高鹽和低pH條件下吸附DNA，然后在低鹽和高pH條件下釋放DNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA產(chǎn)物的分離和純化。

7.測(cè)序。通過試劑盒對(duì)PCR得到的DNA進(jìn)行切膠回收，然后進(jìn)行純化，最終進(jìn)行測(cè)序分析。

8.系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。使用NCBI中的Blast工具將已測(cè)序的DNA與GenBank數(shù)據(jù)庫中已記錄的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，尋找同源性、相似性。如果18S rDNA序列的同源性大于98%，則被判定為同一個(gè)物種。為了計(jì)算遺傳距離，選取屬內(nèi)同源性較高的序列，并使用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

三、結(jié)果與分析

1.致病菌分離生長(zhǎng)結(jié)果。對(duì)櫻桃腐爛組織進(jìn)行致病菌分離純化后，得到菌株A1和A2，形態(tài)評(píng)價(jià)見表2。

2.PCR擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果。對(duì)貯藏過程中櫻桃腐爛組織中分離純化的致病菌提取基因組DNA，對(duì)其進(jìn)行稀釋制備PCR的反應(yīng)模板。然后使用真菌的18S rRNA區(qū)域，采用ITS1和ITS4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到長(zhǎng)度約為700bp左右的序列。其瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果見圖1。在測(cè)序中，菌株A2測(cè)序套峰，無法拼接比；菌株A1正常。

3.Blast檢測(cè)結(jié)果。從櫻桃腐爛組織中鑒定分離得到菌株A1，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，最終獲得菌株A1的18S rDNA基因序列，將其與GeneBank中的序列進(jìn)行Blast，結(jié)果見表3。選取相近的典型菌株的基因序列，用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹來看，A1和Coprinopsis pseudofriesii strain SZMC-NL-2631（HQ847016.1）親緣關(guān)系較近。

本研究從櫻桃保藏過程中的腐爛組織中分離純化出菌種A1，在形態(tài)及顯微鏡鏡檢下觀察，可見其菌落特征，形態(tài)上具有真菌特點(diǎn)。通過PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)其和Coprinopsis pseudofriesii strain SZMC-NL-2631（HQ847016.1）有較近的親緣關(guān)系，可以為后續(xù)研究櫻桃的保藏提供理論基礎(chǔ)。