楊勤，李金金，周濃

（1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120）

肝臟為人體五臟之一，可維持人體新陳代謝的穩(wěn)定，具有造血、代謝營養(yǎng)物質(zhì)、排解體內(nèi)毒素、分泌和排泄膽汁等生理功能。生物性病原菌、藥物及肝毒性物質(zhì)、免疫性低下、酒精刺激及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素均會引起肝損傷。長期反復(fù)的肝損傷會破壞肝臟組織的正常結(jié)構(gòu)，肝臟的各種功能減弱從而導(dǎo)致肝再生能力降低。因而進(jìn)一步研究有效的生物活性成分并探明其對肝功能的促進(jìn)再生、修復(fù)作用機(jī)制具有重要的意義。

地參（Lycopus lucidus Turcz.）為唇形科藥材澤蘭的地下部分，形似地蠶，氣香、味甘，是良好的藥食同源植物資源[1-2]。地參藥用價值在眾多典籍皆有記載，具有化瘀止血、益氣利水、氣虛乏力之功效。近年來的研究表明，地參具有保肝[3]、抗氧化[4]、降血糖血脂[5-6]等功能，其提取物中含有的三萜類物質(zhì)有降低肝硬化、保護(hù)肝臟功能的作用。參考前期實驗[4]，地參中三萜酸生物活性已有研究，含量依次為白樺脂酸、熊果酸、齊墩果酸，三種化合物都為五環(huán)三萜化合物，其單一化合物均有改善肝臟疾病的相關(guān)文獻(xiàn)報道，徐立新[7]等研究表明白樺脂酸可通過緩解脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激改善（四氯化碳）CCl4誘導(dǎo)肝損傷；張明發(fā)[8]等研究表明熊果酸和齊墩果酸的抗氧化作用能對抗各種原因引起的氧化應(yīng)激所致的肝組織炎性損傷、脂肪變和纖維化。為探討地參中萜類對肝臟保護(hù)作用的潛在機(jī)制，本研究構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接來對地參萜類成分保肝機(jī)制進(jìn)行闡釋。

一、資料與方法

（一）地參活性成分檢索

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索地參活性化學(xué)成分，研究針對地參中主要萜類成分，結(jié)合地參有藥理作用成分的生物活性成分參考，預(yù)測地參萜類的保肝作用機(jī)制。

（二）地參三萜酸藥理成分對應(yīng)靶點的獲取

白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸三種萜類結(jié)構(gòu)通過使用Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得，將獲取的化學(xué)式結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而可得作用靶點，輸入至uniprot數(shù)據(jù)庫，再將靶點名稱矯正統(tǒng)一，經(jīng)去重后獲得所需靶點。

（三）保肝相關(guān)靶點的篩選

在數(shù)據(jù)庫檢索“l(fā)iver protection”相關(guān)的靶點基因，通過Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺分析地參萜類成分和疾病靶點信息的篩選結(jié)果，圖示可直觀得到共同靶點。

（四）藥物-疾病-共同靶點的篩選

將有效成分靶點和關(guān)鍵通路導(dǎo)入軟件進(jìn)行可視化處理，并對各藥物化學(xué)成分進(jìn)行形狀、顏色識別標(biāo)注，化學(xué)成分與靶點的關(guān)系使用Network Analyzer功能對三萜酸的主要活性成分進(jìn)行分析。

（五）構(gòu)建靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

在STRING數(shù)據(jù)庫獲得交集作用靶點，明確萜類保肝靶點之間的相互作用，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖?；谕?fù)浞治龅暮诵陌悬c篩選如下，導(dǎo)入Cystoscap 3.9.1中，拓?fù)浞治鲇蒒etwork analyzer插件分析，根據(jù)degree值選取核心的靶點。

（六）GO 富集及KEGG 富集

將地參三萜酸保肝潛在作用靶點信息導(dǎo)入David（生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫）數(shù)據(jù)庫分別勾選生物過程、分子功能、細(xì)胞組成、KEGG 信號通路，利用R語言的Clusterprofile程序包進(jìn)行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析,設(shè)定PValue ≤0.05得到相應(yīng)的生物學(xué)過程及KEGG通路相關(guān)數(shù)據(jù)，然后將所得KEGG數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進(jìn)行可視化圖形繪制。

（七）分子對接

配體處理：從Pubchem數(shù)據(jù)庫下載化合物的SDF格式，導(dǎo)入Chemdraw 3D中，利用MM2模塊進(jìn)行能量最小化，獲得能量最低的優(yōu)勢構(gòu)象并保存為mol2文件，并使用AutodockTools1.5.6對配體進(jìn)行加氫、加電荷、檢測配體的root、進(jìn)行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義，并保存為pdbqt文件。

受體處理：從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載得到蛋白的三維結(jié)構(gòu)，利用PYMOL對蛋白進(jìn)行去水分子、去小分子，再通過AutodockTools1.5.6添加氫原子、計算Gasteiger電荷，將其定義為受體并保存成pdbqt文件。

對接過程：使用Autodock vina 1.1.2將配體與受體進(jìn)行對接，選取對接結(jié)合能最低的構(gòu)象用于對接結(jié)合模式分析，并用PYMOL分析結(jié)合模式并進(jìn)行可視化。

二、結(jié)果分析

（一）三萜酸成分及靶點篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索澤蘭篩選出三萜酸活性成分，選取白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸三種三萜酸類研究其保肝作用，并使用Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得三種三萜酸的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫（取Norm Fit預(yù)測得分大于0.6的靶點）和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取作用靶點，經(jīng)uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點名稱矯正統(tǒng)一并去重后共獲得185個靶點。

（二）疾病作用靶點篩選

以“l(fā)iver protection”為關(guān)鍵詞分別在數(shù)據(jù)庫（取relevance score大于10的靶點）進(jìn)行檢索，去重后共獲得疾病靶點833個。

（三）藥物-疾病-共同靶點的篩選

將185個藥物靶點、833個疾病靶點輸入至線上軟件作圖工具平臺中，由兩者取交集后獲得藥物-疾病交集靶點58個（見圖1）。

圖1 三萜酸與肝保護(hù)靶點韋恩圖

（四）成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

三萜酸的主要活性成分進(jìn)行分析后，采用Cytoscape軟件，將三萜酸中3個潛在活性成分與58個藥物-疾病共同靶點分析，“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖繪制如圖所示 （圖2）。3種活性成分由黃色代表，藍(lán)色代表58個共同靶點，紅色代表疾病。通過圖2可以看出地參中三萜酸成分對應(yīng)靶標(biāo)來發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用。

圖2 活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

（五）PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點分析

構(gòu)建蛋白相關(guān)作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖 ：將上述藥物-疾病共同靶點輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.7，去除孤立節(jié)點，構(gòu)建蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。PPI網(wǎng)絡(luò)中，一個基因靶點由每個節(jié)點表示，兩個靶點之間的相互作用關(guān)系用線線連接。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.9.1中，通過Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取degree值大于平均分的基因作為核心靶點，在條形圖（圖4）中可得度值最高的3個靶點是HSP90AA1（度值20）、MAPK3（度值20）、MAPK1（度值19）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 核心靶點排序

（六）GO 富集及KEGG 富集

使用David數(shù)據(jù)庫對共同靶點進(jìn)行GO與KEGG富集分析，并使用R語言對富集結(jié)果進(jìn)行可視化，將58個共同靶點經(jīng)David數(shù)據(jù)庫GO富集分析得到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3部分。GO結(jié)果顯示，交集基因共富集至281條生物過程通路中；交集基因共富集至33條細(xì)胞組分表達(dá)過程中；交集基因共富集至76條分子功能相關(guān)的過程中，選取每部分Pvalue排名前10的通路繪制條形圖氣泡圖（圖5）。將58個共同靶點經(jīng)David數(shù)據(jù)庫KEGG富集分析后共得到126條KEGG通路，選取Pvalue排名前20的通路繪制KEGG富集的條形圖氣泡圖（圖6），-log10(Pvalue)代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。注：一般選擇Pvalue ＜0.05的通路進(jìn)行研究。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG富集分析

（七）分子對接

分子對接常用于藥物活性分子與靶蛋白的對接分析。將Degree值前5個重要靶點蛋白HSP90AA1、MAPK1、MAPK3、SRC、EGFR，以及3個活性成分Betulinic acid（白樺脂酸）、Oleanolic acid（齊墩果酸）、Ursolic Acid（熊果酸）進(jìn)行分子對接驗證。由表1可知，地參中三萜酸靶點的結(jié)合能均＜-7.3 kcal/mol，即結(jié)合性較好。由圖7可知，這些化合物主要與蛋白受體結(jié)合位點發(fā)生氫鍵作用。

表1 三萜酸與關(guān)鍵靶點對接能

圖7 分子對接結(jié)合能熱圖

利用Autodock vina對接，化合物和蛋白的最低結(jié)合能結(jié)合自由能（Affinity）越小表示化合物能夠強(qiáng)有力自發(fā)地結(jié)合到蛋白的活性口袋中，小分子能夠良好地進(jìn)入到蛋白的活性口袋具有良好的形狀匹配，利用PYMOL進(jìn)行相互作用分析，從三維分析發(fā)現(xiàn)，化合物與氨基酸形成的氫鍵相互作用，這些相互作用使得化合物能夠良好地結(jié)合到蛋白口袋中，進(jìn)一步發(fā)揮作用。由圖8（A）所示，化合物和蛋白的最低結(jié)合能為-9.2kcal/mol，結(jié)合能小于-7，從三維分析發(fā)現(xiàn)，化合物與氨基酸ALA165形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離為2.1埃。由圖8（B）所示，化合物和蛋白的最低結(jié)合能為-10.4kcal/mol，結(jié)合能小于-7，從三維分析發(fā)現(xiàn)，化合物與氨基酸MET108、THR110形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離分別為3.4、2.1、2.6埃。由圖8（C）所示，化合物和蛋白的最低結(jié)合能為-9.8kcal/mol，結(jié)合能小于-7，化合物與氨基酸ARG41形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離為2.5埃，由圖8（D）所示，化合物和蛋白的最低結(jié)合能為-9.9kcal/mol，結(jié)合能小于-7，化合物與氨基酸ARG156形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離為2.5埃。由圖7（E）所示，化合物和蛋白的最低結(jié)合能為-10.1kcal/mol，結(jié)合能小于-7，化合物與氨基酸LYS745形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離分別為2.4、2.2埃。

圖8 地參3 種化合物與關(guān)鍵靶點相互作用圖

三、討論

本研究以地參三種五環(huán)三萜酸活性成分構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，建立成分-疾病-靶點的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，得出潛在作用靶標(biāo)58個，根據(jù)這些靶標(biāo)進(jìn)一步收集三萜酸保肝作用過程及富集通路。

PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點排序中度值排名前三的關(guān)鍵靶點HSP90AA1、MAPK3、MAPK1與肝功能作用相關(guān)，HSP90系列是目前世界上性能最優(yōu)越的肝癌標(biāo)志物，可用于肝癌患者的病情監(jiān)測和療效評估[9]。MAPK是肝細(xì)胞內(nèi)促細(xì)胞增殖和傳遞應(yīng)激信號的關(guān)鍵激酶，肝IRI中的一個重要因子，MAPK在肝再灌注后迅速通過磷酸化被激活,參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡壞死,肝纖維化也與MAPK有關(guān)[10-11]。GO生物學(xué)富集結(jié)果表明，前3位的富集過程包括negative regulation of apoptotic process、response to ethanol、response to toxic substance。通過KEGG富集分析,得到前5的信號通路為Pathways in cancer、Prostate cancer、Proteoglycans in cancer、Chemical carcinogenesisreceptor activation、Endocrine resistance。地參萜類保肝主要通過這些重要信號通路進(jìn)行調(diào)控。用分子對接技術(shù)分析結(jié)果可得，HSP90AA1、MAPK1、MAPK3、SRC、EGFR靶點的結(jié)合能均＜-7.3 kcal/mol，說明萜類活性成分與靶點間結(jié)合力好，構(gòu)象穩(wěn)定。結(jié)合能越低，說明結(jié)合越穩(wěn)定，其中HSP90AA1結(jié)合能力最佳。由試驗結(jié)果分析，以微觀的分子角度系統(tǒng)可預(yù)測分析地參三萜酸保肝的作用機(jī)制，對分析為其預(yù)防、修復(fù)肝臟功能等提供證據(jù)支持。

四、結(jié)論

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對接技術(shù)，初步探究了地參三萜酸活性成分保肝可能的作用機(jī)制，為其對保肝臨床應(yīng)用的合理性、有效性、精準(zhǔn)性提供理論依據(jù)，為地參中潛在活性成分后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接理論性較強(qiáng)，對探究地參三萜酸成分的保肝作用機(jī)制有一定的限制性，篩選條件所限，僅對地參萜類有效成分及主要作用靶點進(jìn)行了分析，已篩出萜類的靶標(biāo)和途徑，但其作用機(jī)理還需進(jìn)一步進(jìn)行實驗驗證。