陳艷，祝賀，童明龍，陸冠亞，茹小桐，姜焱，周斌*，龍云鳳*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095；2. 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210019；3. 蘇州海關(guān)綜合技術(shù)中心，江蘇 蘇州 215104)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染所引發(fā)的非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是豬的一種具有高度傳播性的急性、熱性、出血性傳染病，強毒株致死率可達到100%，臨床癥狀主要表現(xiàn)為高燒、嚴重抑郁、厭食、皮膚發(fā)紺和全身組織器官的出血性病變[1]。世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)將ASF列為法定報告動物疫病，我國也將之歸入必須重點防范的一類動物疫病名錄。2018年8月，ASFV首次傳播到我國，揭開了ASF在亞洲的首次暴發(fā)和持續(xù)流行的序幕[2-3]。據(jù)WOAH統(tǒng)計，自2021年1月至2023年3月，全球仍有41個國家報告發(fā)生ASF。ASFV雖然不會危害人類健康，但病毒的高致病性、對環(huán)境的強抵抗力和跨境傳播能力給全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了破壞性影響和巨大的經(jīng)濟損失[4]。近期，ASFV疫苗的研發(fā)和臨床應(yīng)用推廣取得了一定進展[5]，但ASF的防治和凈化策略仍側(cè)重于生物安全措施，提升豬群自身免疫力，全面監(jiān)測與精準清除[6-7]。

ASFV是一種雙鏈的核質(zhì)大DNA病毒，基因組長度約為170～190 kb，編碼68種結(jié)構(gòu)蛋白和超過100種非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。其中由EP402R基因編碼的CD2v蛋白在病毒復(fù)制晚期表達，呈高度糖基化，參與ASFV感染的多個階段[9-11]。作為ASFV囊膜的主要組分和標識物，CD2v蛋白具有良好的免疫原性，可刺激產(chǎn)生ASFV特異性抗體并誘導細胞免疫應(yīng)答，是候選亞單位疫苗抗原之一[12]。CD2v也是ASFV的關(guān)鍵毒力因子，能引起患豬的血細胞吸附，常作為減毒活疫苗的基因敲除靶標[13-14]。本研究將國內(nèi)流行毒株ASFV Pig/HLJ/2018的CD2v膜內(nèi)區(qū)基因序列插入到pET-28a(+)載體，通過原核表達系統(tǒng)獲得重組CD2v蛋白，并利用雜交瘤技術(shù)制備出8株針對CD2v蛋白的單克隆抗體，為ASFV診斷方法開發(fā)及病原學基礎(chǔ)研究提供了生物學工具。

1 材料與方法

1.1 主要材料

原核表達載體pET-28a(+)、重組質(zhì)粒pET-32a-CD2v、小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)由本實驗室保存。ASFV陽性血清標準品購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。P3代CD2v重組桿狀病毒、草地貪夜蛾蛹卵巢細胞(Sf9)由南京海關(guān)動植物與食品檢測中心保存。BALB/c小鼠購自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司。

高保真PCR聚合酶Prime STAR、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DNA Ladder、T4 DNA連接酶和DNA膠回收試劑盒購自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。感受態(tài)細胞DH5α和BL21(DE3)購自北京擎科生物科技股份有限公司。HisTrap HP預(yù)裝式層析柱購自General Electric公司。250 kDa預(yù)染protein Marker、12.5% PAGE凝膠快速制備試劑盒、考馬斯亮藍染色液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。GreenTaqMix、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高敏型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自Merck公司。HRP標記山羊抗鼠IgG抗體、FITC標記山羊抗鼠IgG抗體、鼠源His單克隆抗體、小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Proteintech公司。TMB底物和終止液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT和HT培養(yǎng)基購自Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)TMHMM-2.0蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測工具的分析結(jié)果，針對ASFV Pig/HLJ/2018(GenBank：MK333180)分離株CD2v蛋白膜內(nèi)區(qū)(688～1 083 bp，230～360 aa)設(shè)計常規(guī)PCR引物，F(xiàn)：5′-TGACGGATCCTCTTTACGAAAAAGAAAAAAAC-3′(下劃線處為BamHⅠ酶切位點)，R：5′-TGACCTCGAGAATAATTCTATCTACGTGAAT-3′(下劃線處為XhoⅠ酶切位點)，擴增產(chǎn)物長度為396 bp。以攜帶CD2v全長基因序列的重組質(zhì)粒pET-32a-CD2v為PCR模板。反應(yīng)體系為：Prime STAR 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。通過膠回收方法純化PCR產(chǎn)物。

將經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ處理后的目的片段和pET-28a(+)載體用T4連接酶連接8 h。之后轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到感受態(tài)細胞DH5α中，從菌液PCR鑒定為陽性的單克隆過夜培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行限制性雙酶切，陽性質(zhì)粒由北京擎科生物科技股份有限公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒被命名為pET-28a-CD2v-intra并保存于-20 ℃。

1.3 重組CD2v蛋白的原核表達、純化及反應(yīng)原性鑒定

將重組質(zhì)粒pET-28a-CD2v-intra轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，得到CD2v重組蛋白原核表達菌株CD2v-intra-pET-28a-BL21。將CD2v-intra-pET-28a-BL21的過夜培養(yǎng)物按1∶100體積比接種到含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即菌液OD600范圍應(yīng)為0.6～0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 h后離心收集菌體。用PBS重懸菌體后在冰浴條件下進行超聲破碎，之后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管，并用PBS重懸沉淀，分別制備SDS-PAGE樣品，用以鑒定重組蛋白的表達形式。

使用His-tag鎳離子親和層析法純化重組蛋白。在預(yù)試驗中用梯度咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫，經(jīng)SDS-PAGE測定重組蛋白的最佳洗脫濃度。后續(xù)洗脫時先用低咪唑濃度的除去雜蛋白，再用最佳濃度的緩沖液洗脫下重組蛋白。用SDS-PAGE鑒定重組蛋白的純度。用透析法對純化后的重組蛋白做脫鹽和濃縮處理。用BCA法測定重組蛋白的濃度。通過Western blot鑒定重組蛋白與His單克隆抗體、ASFV陽性血清標準品的反應(yīng)性。

1.4 CD2v蛋白單克隆抗體制備

1.4.1 動物免疫

將10只6周齡BALB/c雌性小鼠平均分為免疫組和陰性對照組并編號。首次免疫時，以背部皮下多點注射方式給免疫組每只小鼠接種50 μg重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑的乳化物。首次免疫后的第3周進行第2次免疫，第4周進行第3次免疫。第2、3次免疫時將弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑。整個免疫程序中，陰性對照組用等體積滅菌PBS處理。第3次免疫后7 d，采集小鼠眼眶血，通過間接ELISA測定小鼠血清效價。細胞融合前3 d，在效價達到1∶10 000的小鼠中選擇數(shù)值最高的1只，腹腔注射100 μg重組蛋白。

1.4.2 單克隆抗體的制備

細胞融合前1 d，分離小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞，密度調(diào)整到1×105/mL，按100 μL每孔加入到96孔板中培養(yǎng)。處死經(jīng)過4次免疫的小鼠，分離脾細胞，在PEG4000作用下與對數(shù)生長期的SP2/0細胞按照5∶1的比例進行細胞融合。將融合細胞用含1×HAT和20% FBS的選擇培養(yǎng)基重懸，加入到含有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞板中培養(yǎng)。細胞融合3 d后，每日觀察細胞狀態(tài)并統(tǒng)計融合率。細胞融合第5天后，每隔3 d用HAT選擇培養(yǎng)基半換液。細胞融合第14天后，用HT補充培養(yǎng)基半換液，取出的一半細胞培養(yǎng)上清液用間接ELISA方法測抗體水平，對陽性雜交瘤細胞至少進行2～3次亞克隆至抗體陽性率達100%，確立雜交瘤細胞系并建庫凍存，之后培養(yǎng)不再添加HT補充培養(yǎng)基。將陽性雜交瘤細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存，逐代減少FBS含量至10%、5%甚至無血清，以利于抗體產(chǎn)生和后續(xù)抗體純化。測定不同代次的細胞培養(yǎng)物上清液中抗體效價，擴大培養(yǎng)能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，于液氮中長期凍存。

1.4.3 間接ELISA方法

用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH=9.6)作為包被液將重組蛋白CD2v稀釋到5 μg/mL，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。之后用PBST洗滌4次，最后1次洗滌完將酶標板在吸水紙上拍干。用5%脫脂乳作為封閉液，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。按前述方法洗滌。將樣品和對照，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。按前述方法洗滌。將HRP標記山羊抗鼠IgG抗體以1∶5 000比例稀釋后，按100 μL/孔加入到酶標板，37 ℃孵育1 h。按前述方法洗滌。按100 μL/孔加入TMB顯色液，37 ℃避光顯色15 min。按100 μL/孔加入終止液。使用酶標儀讀取OD450 nm值，待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm值(S/N)≥2.1時判定為陽性。選擇PBS處理組的小鼠血清作為陰性對照，免疫組小鼠血清作為陽性對照。

1.4.4 腹水制備

準備16只12周齡BALB/c雌性小鼠，按2只/株單克隆抗體分組。給每只小鼠腹腔注射0.5 mL經(jīng)高壓滅菌的液體石蠟。7 d后給每只小鼠腹腔接種5×105個雜交瘤細胞。5～7 d后，每日觀察小鼠狀態(tài)，對腹部明顯膨大，觸摸有波動感的小鼠用0.55 mm靜脈采血針收集腹水。采集到的腹水在4 ℃靜置過夜，次日12 000 r/min離心5 min，收集中間層，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 CD2v蛋白單克隆抗體的生物學特性鑒定

1.5.1 Western blot鑒定單克隆抗體的反應(yīng)性

貼壁培養(yǎng)Sf9細胞至對數(shù)生長期，按MOI=1的劑量接種P3代CD2v重組桿狀病毒，同時設(shè)置未感染的Sf9細胞作為空白對照，于28 ℃培養(yǎng)36 h。反復(fù)凍融3次使細胞破碎，取100 μL加入25 μL 5×蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min，進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用5%脫脂乳封閉膜，以雜交瘤細胞上清液作為一抗、HRP標記山羊抗鼠IgG抗體為二抗，浸入ECL發(fā)光液數(shù)秒后在成像系統(tǒng)中觀察特異性條帶。

1.5.2 免疫熒光試驗(IFA)鑒定單克隆抗體的反應(yīng)性

按1×106個細胞/孔的密度接種Sf9細胞至48孔板，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將P3代CD2v重組桿狀病毒按MOI=1的劑量感染細胞，同時設(shè)置未感染的Sf9細胞作為空白對照，于28 ℃培養(yǎng)36 h。用4%多聚甲醛固定細胞，加入2% BSA在37 ℃封閉2 h，以雜交瘤上清液作為一抗、FITC標記山羊抗鼠IgG抗體為二抗，在37 ℃各孵育1 h，每個步驟之后用PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 單克隆抗體的亞型鑒定

取建庫的雜交瘤細胞上清液，使用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒對單克隆抗體的亞型進行鑒定，具體操作按照說明書執(zhí)行。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

ASFV Pig/HLJ/2018(GenBank：MK333180)CD2v蛋白膜內(nèi)區(qū)基因(688～1 083 bp，230～360 aa)的PCR擴增產(chǎn)物長度與預(yù)期的396 bp相符(圖1A)。CD2v-intra-pET-28a-DH5α重組菌的菌液PCR鑒定均為陽性(圖1B)。重組質(zhì)粒pET-28a-CD2v-intra經(jīng)過雙酶切鑒定后獲得的片段與目的基因大小一致(圖1C)。基因測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒的插入序列與目的基因完全一致。

2.2 重組CD2v蛋白表達、純化及鑒定

SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組菌株CD2v-intra-pET-28a-BL21經(jīng)IPTG誘導后大量表達分子量約為23 kDa的融合蛋白，與預(yù)期大小相符，重組蛋白部分為可溶性表達，部分為包涵體形式(圖2A)。通過His-tag鎳離子親和層析法純化的CD2v重組蛋白在電泳后染色呈單一條帶，純化效果良好(圖2B)。Western blot顯示His單克隆抗體和ASFV陽性血清標準品均能特異性識別CD2v重組蛋白，充分表明CD2v重組蛋白成功表達并且具有良好的反應(yīng)原性(圖3)。

M. 蛋白Marker；1. pET-28a-BL21全菌；2. 未誘導的CD2v-intra-pET-28a-BL21；3～5. 分別為誘導CD2v-intra-pET-28a-BL21裂解后全菌、上清液、沉淀；6. 流穿液；7～10. 分別為含50、100、200、300 mmol/L咪唑的洗脫液。

M.蛋白Marker；1. pET-28a-BL21裂解物；2. CD2v-intra-pET-28a-BL21裂解物。

2.3 單克隆抗體的制備

在小鼠第3次免疫后采集眼眶血，按本研究建立的ELISA方法測定小鼠血清抗體效價，結(jié)果顯示，免疫組小鼠的抗CD2v蛋白抗體效價均達到1∶10 000，可用于細胞融合。

按本研究建立的ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，并通過有限稀釋法進行2～3次亞克隆，最終獲得8株分泌抗CD2v蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為RH1、RH3、RH4、RH5、RH6、RH8、RH9、RH10。如表1所示，在經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)和數(shù)次凍存后，雜交瘤細胞培養(yǎng)基上清液中的抗體效價仍維持在1∶12 800的較高水平，表明其分泌抗體的能力穩(wěn)定。本研究制備的腹水中CD2v抗體效價均達到1∶640 000，可為后續(xù)單克隆抗體的應(yīng)用提供充足材料。

表1 單克隆抗體效價測定

2.4 單克隆抗體的反應(yīng)性鑒定

Western blot結(jié)果如圖4所示，8株CD2v單克隆抗體均能識別昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達的重組CD2v全長蛋白，曝光后出現(xiàn)的2條特異性條帶，1條為44 kDa左右的非糖基化CD2v蛋白，另1條為85 kDa左右的糖基化CD2v蛋白。IFA試驗中(圖5)，His標簽抗體組產(chǎn)生的特異性綠色熒光表明感染重組桿狀病毒的Sf9細胞成功表達了CD2v全長蛋白，8株CD2v單克隆抗體中有6株抗體能識別真核重組CD2v蛋白，分別是RH1、RH4、RH5、RH6、RH9和RH10。單克隆抗體不與陰性對照發(fā)生反應(yīng)。

M. 蛋白Marker；1. Sf9細胞；2. 表達重組CD2v全長蛋白的Sf9細胞。

圖5 IFA鑒定CD2v蛋白單克隆抗體與真核重組CD2v蛋白的反應(yīng)性

2.5 單克隆抗體的亞型鑒定

由表2可見，8株單克隆抗體的輕鏈類型均為Kappa型；RH1、RH5、RH9這3株單克隆抗體的重鏈亞型為IgG2b，其余5株單克隆抗體的重鏈亞型為IgG1。

表2 CD2v單克隆抗體亞型鑒定

3 討論

自首次發(fā)現(xiàn)ASFV至今已有一個世紀，盡管先前的研究工作較為全面地揭示了ASFV的病原學特征、傳播機制和致病機制，但仍存在很多未知和待解決的問題[15]。未來的研究應(yīng)繼續(xù)深入探索ASFV與宿主之間的相互作用以及病毒的免疫逃避機制，為ASF的防治提供更好的科學支持。ASFV單克隆抗體的制備可以為上述研究提供有力的生物學工具。單克隆抗體是由單一B細胞克隆所產(chǎn)生，能特異性識別單一抗原表位，被廣泛地應(yīng)用于病原的基礎(chǔ)研究和臨床治療與診斷，如鑒定蛋白的表達與定位、靶向傳遞藥物、阻斷病原感染、富集和純化生物制品、檢測靶抗原等[16]。Hagoss等[17]利用其制備的7株單克隆抗體鑒定出一個新的ASFV CP312R蛋白保守性抗原表位，并通過激光共聚焦試驗證實CP312R蛋白主要定位于細胞質(zhì)中。Zhang等[18]則利用ASFV p30單克隆抗體開發(fā)了一種夾心膠體金試紙條，適用于多種臨床樣本現(xiàn)場檢測，試紙條與熒光定量PCR(qPCR)的一致性為95.42%，檢出限達2.16 ng p30蛋白。

囊膜蛋白CD2v在ASFV感染過程中發(fā)揮著重要作用。CD2v蛋白介導了ASFV感染細胞周圍紅細胞的黏附與聚集，促進病毒在體液中的擴散[9]。通過其胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域與肌動蛋白結(jié)合配體SH3P7結(jié)合，CD2v蛋白可促進ASFV在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制和傳播[19]。CD2v蛋白胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域還靶向反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)(TGN)調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物AP-1，從而影響胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運，在病毒感染細胞的免疫逃逸方面發(fā)揮潛在作用[20]。通過激活NF-κB，CD2v蛋白可誘導豬淋巴細胞和巨噬細胞中的IFN信號傳導與凋亡[21]。作為良好的免疫原，CD2v蛋白能刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，是ASFV血清學診斷的主要標識物。針對CD2v蛋白的單克隆抗體不僅有助于深入研究靶抗原的生物學功能，還對多種ASFV抗原抗體檢測方法的開發(fā)有著重要意義。CD2v蛋白屬于單次跨膜蛋白，含有一段強疏水性的氨基酸序列。這種跨膜結(jié)構(gòu)與信號肽結(jié)構(gòu)相似，原核細胞中簡單的細胞器難以像真核細胞一樣完成這類結(jié)構(gòu)的識別及切除，引導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體重新包裝及分泌這一復(fù)雜過程。因此，本研究選擇對國內(nèi)流行毒株ASFV Pig/HLJ/2018的CD2v蛋白C末端膜內(nèi)區(qū)(688～1 083 bp，230～360 aa)進行原核表達。重組CD2v蛋白的相對分子量在23 kDa左右，與預(yù)期相符，誘導產(chǎn)物有約50%以可溶性形式表達。重組蛋白具有良好的抗原性，可被ASFV陽性血清識別，也可刺激小鼠產(chǎn)生高水平的血清抗體。經(jīng)過細胞融合、雜交瘤細胞篩選和2～3次亞克隆，本研究共制備出8株能穩(wěn)定分泌CD2v蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，并收獲了高抗體效價的腹水。Western blot試驗證實了8株CD2v蛋白單克隆抗體良好的反應(yīng)性，可識別糖基化(約85 kDa)和非糖基化(約44 kDa)的真核重組CD2v全長蛋白。其中6株抗體可通過IFA試驗識別感染CD2v重組桿狀病毒的Sf9細胞。8株單克隆抗體的輕鏈類型均為Kappa型，RH1、RH5和RH9這3株單克隆抗體的重鏈亞型為IgG2b，其余5株單克隆抗體的重鏈亞型為IgG1，均適合用protein A/G、分子篩層析和離子交換層析等常規(guī)抗體純化方法[16]。

本研究制備的8株ASFV CD2v蛋白膜內(nèi)區(qū)單克隆抗體將有助于加速解析病毒蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，探究病毒與宿主的相互作用和病毒的免疫逃避機制，從而更高效地篩選出抗病毒藥物，更有針對性地開發(fā)疫苗。同時也為本研究后續(xù)完成靶抗原B細胞表位作圖、中和抗體篩選以及建立高特異、高靈敏性的血清學診斷方法奠定了基礎(chǔ)。