吳洪超，霍寧寧，丁航天，曹玉姣，陳亞磊，陳云豫，王璐璐，劉玉秀*，田克恭1，*

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450000；2. 國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471003；3. 洛陽惠中生物技術有限公司，河南 洛陽 471003；4. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471003)

犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的急性、高度接觸性傳染病[1]。水貂、狐貍、貉等毛皮經(jīng)濟動物和犬對該病毒易感，本病已廣泛存在于包括我國在內(nèi)的所有毛皮動物養(yǎng)殖國家，對毛皮經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)威脅極大[2]?；疾∷醣憩F(xiàn)為呼吸道、消化道癥狀，還伴隨鼻鏡干燥、足墊增厚、皮屑等癥狀。水貂病毒性腸炎是由水貂腸炎病毒(mink enteritis virus，MEV)感染引起的高度接觸性傳染病，發(fā)病水貂主要表現(xiàn)為精神不振、食欲減退、腹瀉、嘔吐等[3-4]，該病具有較高的發(fā)病率和死亡率[5]。

水貂犬瘟熱和水貂病毒性腸炎是對水貂危害最大的兩種傳染病[6]，臨床上常以接種疫苗作為主要防控措施，對于水貂犬瘟熱活疫苗和水貂病毒性腸炎疫苗的免疫，已被列入養(yǎng)殖場的常規(guī)免疫計劃[7]。臨床上常采用不同時間接種以上兩種疫苗，或者在同一時間、不同部位接種疫苗，并且具有良好的免疫效果[8]，但是頻繁抓取或者多次注射，給水貂群造成多次應激，導致死淘率增加，同時也增加了人工成本。然而水貂病毒性腸炎滅活疫苗與水貂犬瘟熱活疫苗混合后同時免疫，是否出現(xiàn)相互干擾而影響免疫效果，還需比較研究。

為了減少水貂群的應激次數(shù)，節(jié)省人工，同時使疫苗更加符合臨床實際應用，本研究用水貂病毒性腸炎桿狀病毒載體滅活疫苗(簡稱MEV亞單位疫苗)稀釋水貂犬瘟熱活疫苗(簡稱CDV活疫苗)，稀釋后室溫靜置不同時間測定CDV含量，以及對水貂免疫，綜合評價混合免疫的效果，為這兩種病原的疫苗免疫程序優(yōu)化提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

MEV JL株、CDV HL001株、CDV單克隆抗體、MEV單克隆抗體、Vero細胞，均由普萊柯生物工程股份有限公司保存；MEV亞單位疫苗和CDV活疫苗，均由洛陽惠中生物技術有限公司制備；CDV膠體金檢測試紙條購自洛陽普泰生物技術有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；新生牛血清購自PAN公司；RT-PCR和PCR相關試劑購自北京全式金生物技術有限公司；FITC標記羊抗鼠IgG購自Sigma公司。

4～5月齡健康水貂，均購自洛陽市周邊水貂養(yǎng)殖場。未接種水貂犬瘟熱疫苗和水貂病毒性腸炎疫苗，采集眼鼻拭子和肛拭子經(jīng)RT-PCR/PCR檢測，CDV和MEV核酸均為陰性，免疫前采血分離血清，采用血清中和試驗測定CDV抗體為陰性，采用血凝抑制試驗測定MEV抗體為陰性。

1.2 方法

1.2.1 不同稀釋液稀釋CDV活疫苗后病毒含量測定

將MEV亞單位疫苗充分搖勻，用注射器抽取10 mL注入CDV活疫苗瓶中完全溶解，輕輕混勻。將充分混勻的混合疫苗在室溫(25 ℃)靜置0、2 h分別取樣測定CDV含量。同時取CDV活疫苗用稀釋液按同樣方法稀釋，稀釋后的CDV活疫苗在室溫(25 ℃)靜置0、2 h分別取樣，用DMEM培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-2、10-3、10-4、10-54個稀釋度，與Vero細胞同步接種96孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種6孔，0.1 mL/孔，同時設正常細胞對照6孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，用冷丙酮固定細胞，以CDV單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠IgG為二抗，置熒光顯微鏡下觀察每個稀釋度出現(xiàn)特異性熒光染色的細胞孔數(shù)。按Reed-Muench法計算半數(shù)熒光抗體感染劑量(50% Fluorescent antibody infectious dose，F(xiàn)AID50)。

1.2.2 動物分組及免疫

將30只健康水貂，隨機分為6組，每組5只，分組及免疫試驗設計見表1。

表1 動物分組及試驗設計

1.2.3 CDV免疫效力評價

第1、3、5組水貂，分別在免疫前和免疫后21 d采血，分離血清，按《中國獸藥典》附注方法測定CDV中和抗體效價。免疫后21 d用CDV強毒攻毒，每只滴鼻2 mL、腹腔注射4 mL(105.5FAID50/mL)，攻毒后觀察21 d，每日觀察水貂的臨床表現(xiàn)，包括精神狀態(tài)、食欲、糞便、眼鼻分泌物、鼻鏡、足墊等，攻毒后7～14 d采集眼鼻拭子，用CDV膠體金試紙條檢測排毒情況。攻毒對照水貂眼鼻拭子檢測為CDV陽性，且出現(xiàn)精神不振、食欲減退、排稀便或粘便，眼鼻分泌物，鼻鏡干燥或足墊增厚時，判為發(fā)??；免疫水貂眼鼻拭子檢測為CDV陰性，且不出現(xiàn)以上任意臨床表現(xiàn)時，判為保護。

攻毒后21 d處死水貂，采集肺臟，經(jīng)10%福爾馬林固定，制備切片，HE染色后顯微鏡下觀察肺臟病理變化，另取制備的切片進行免疫組化檢測，切片用馬血清封閉后，滴加CDV單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后滴加HRP標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后滴加AEC顯色液顯色，用蘇木精復染后封片，普通光學顯微鏡下觀察。

1.2.4 MEV免疫效力評價

第2、4、6組水貂，分別在免疫前和免疫后14 d采血，分離血清，按參照文獻[9-10]，并適當改進來測定MEV血凝抑制(HI)效價。免疫后14 d用MEV強毒攻毒，每只灌胃感染水貂腸炎病毒JL株病毒液15 mL(106.5FAID50/mL)。攻毒后連續(xù)觀察14 d，并記錄水貂的臨床表現(xiàn)，包括精神狀態(tài)、食欲、糞便等。同時在攻毒前和攻毒后3～7 d采集糞便，測定糞便中MEV的血凝(HA)效價。攻毒對照水貂出現(xiàn)精神不振、食欲減退，排稀便、黏便、血便等腸炎癥狀，糞便中病毒HA效價不低于1∶128時，判為發(fā)??；免疫水貂不出現(xiàn)以上任意表現(xiàn)時，判為保護。

攻毒后14 d處死水貂，采集小腸，經(jīng)10%福爾馬林固定，制備切片，HE染色后顯微鏡下觀察小腸病理變化，另取制備的切片進行免疫組化檢測，切片用馬血清封閉后，滴加MEV單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后滴加HRP標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后滴加AEC顯色液顯色，用蘇木精復染后封片，普通光學顯微鏡下觀察。

取采集的糞便樣品作為待檢樣品進行血凝試驗。在微量血凝反應板的1～12孔各加入PBS(0.015 mol/L，pH值6.5)25 μL，取待檢樣品25 μL加入第1孔，混勻，從第1孔吸取混合液25 μL加入第2孔，混勻后吸取25 μL到第3孔，依次2倍系列稀釋至第11孔，棄去25 μL，第12孔為紅細胞對照；吸取1%豬紅細胞懸液加入各孔，每孔25 μL；輕輕振蕩混勻，2～8 ℃作用90 min后觀察結(jié)果；在紅細胞對照成立(紅細胞完全不凝集)的條件下，以使紅細胞100%凝集的樣品最高稀釋倍數(shù)作為待檢樣品的HA效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDV含量測定

經(jīng)不同稀釋液稀釋的混合疫苗和CDV活疫苗，在室溫(25 ℃)放置0、2 h取樣測定CDV含量。結(jié)果顯示，復溶后的混合疫苗和CDV活疫苗放置2 h內(nèi)，CDV含量無明顯下降，結(jié)果見表2。

表2 CDV含量測定結(jié)果 FAID50/mL

2.2 CDV免疫效力評價

CDV中和抗體檢測結(jié)果見圖1。由圖1發(fā)現(xiàn)免疫后21 d，G1和G3組的CDV中和抗體效價達到1∶64.6～1∶128.8。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗而成的混合疫苗和CDV活疫苗免疫后，均能刺激水貂產(chǎn)生良好的CDV中和抗體。

圖1 水貂血清CDV中和抗體檢測結(jié)果

免疫后21 d進行CDV攻毒，結(jié)果顯示，混合疫苗和CDV活疫苗單獨免疫組的保護率均為100%，結(jié)果見表3和圖2。HE染色顯示，G1和G3組水貂的肺臟均未見明顯病理變化，見圖3A、B，對照組水貂肺臟可見肺泡隔增厚，上皮細胞增生，大量巨噬細胞小灶性浸潤，見圖3C箭頭所示。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，G1和G3組水貂的肺臟均為CDV陰性，見圖3D、E，對照水貂的肺臟為CDV陽性，見圖3F。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗后，不影響CDV疫苗的免疫效力。

A. G1組水貂未見異常；B. G3組水貂未見異常；C. G5組水貂眼睛黏性分泌物、鼻鏡干燥。

A～C. G1、G3、G5組肺臟HE染色；D～F. G1、G3、G5組肺臟免疫組化檢測。箭頭表示肺臟病理變化及免疫組化陽性處。

表3 CDV免疫效力評價結(jié)果

2.3 MEV免疫效力評價

MEV HI抗體檢測結(jié)果見圖4，發(fā)現(xiàn)免疫后14 d，G2和G4組的MEV HI抗體效價達到1∶128～1∶1 024。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗而成的混合疫苗和MEV亞單位疫苗免疫后，均能刺激水貂產(chǎn)生良好的MEV HI抗體。

圖4 水貂血清MEV HI抗體檢測結(jié)果

免疫后14 d進行MEV攻毒，結(jié)果顯示，混合疫苗和MEV亞單位疫苗免疫水貂的保護率均為100%，結(jié)果見表4、表5和圖5。HE染色顯示，G2和G4組水貂的空腸均未見明顯病理變化，見圖6A、B，對照組水貂的空腸可見黏膜上皮細胞腫脹變性、脫落，見圖6C。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，G2和G4組水貂的空腸均為MEV陰性，見圖6D、E，對照水貂的空腸為MEV陽性，見圖6F。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗后，不影響MEV疫苗的免疫效力。

A、B. G2、G4組水貂糞便未見異常；C、D. G6組水貂排稀便、黏便。

A～C. G2、G4、G6組空腸HE染色；D～F. G2、G4、G6組空腸免疫組化檢測。箭頭表示空腸病理變化及免疫組化陽性處。

表4 MEV免疫效力評價結(jié)果

表5 攻毒前后水貂糞便中水貂腸炎病毒HA效價測定結(jié)果

3 討論

CDV和MEV是危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的兩大病原，給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失[11-15]，主要采用接種疫苗進行預防，目前臨床上已經(jīng)將CDV疫苗、MEV疫苗納入養(yǎng)殖場的常規(guī)免疫程序中。早期免疫程序中，將兩種疫苗在不同時間接種，或者在同一時間、不同部位注射，從而達到防疾病的目的，但是該免疫程序仍有優(yōu)化的空間。

為了減少水貂群的免疫應激次數(shù)，降低防疫成本，優(yōu)化水貂群免疫程序，本研究使用MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗，混合后在室溫靜置2 h檢測CDV含量無明顯下降，為臨床上混合疫苗的使用提供時間保證。羅國良等[16]研究顯示水貂細小病毒性腸炎滅活疫苗稀釋犬瘟熱活疫苗，在25 ℃條件下存放5 h內(nèi)對CDV含量無明顯影響，與本文的研究結(jié)果相近。臨床實際情況下，犬瘟熱活疫苗復溶后2 h內(nèi)即可用完，本文未檢測兩種疫苗混合后室溫保存2 h或更長時間的CDV含量，但是兩種疫苗混合后2 h內(nèi)CDV含量無明顯下降，可以滿足臨床使用。

為了評價MEV亞單位疫苗和CDV活疫苗混合免疫的效果，本研究篩選CDV抗原、MEV抗原、CDV抗體、MEV抗體均為陰性的健康水貂，進行混合疫苗的免疫效果評價。CDV和MEV的免疫效力，均采用血清學方法和免疫攻毒方法進行評價，結(jié)果混合使用的效果與MEV亞單位疫苗單獨使用、CDV活疫苗單獨使用的效果相當，均能誘導產(chǎn)生高滴度的抗體效價。CDV攻毒后免疫水貂未出現(xiàn)犬瘟熱的臨床表現(xiàn)，眼鼻拭子中未檢測到CDV抗原，剖檢后肺臟未見明顯病理變化，免疫組化檢測為CDV抗原陰性；MEV攻毒后免疫水貂未出現(xiàn)病毒性腸炎的臨床表現(xiàn)，糞便樣品對豬紅細胞的凝集效價遠低于對照組，剖檢后空腸未見明顯病理變化，免疫組化檢測為MEV陰性，表明混合免疫后可產(chǎn)生對CDV、MEV良好的保護效果。

綜上，MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗，混合免疫后各組的免疫效力均不受影響，從而為此兩種疫苗的聯(lián)合使用提供試驗依據(jù)，為其推廣應用奠定基礎。