劉潔瓊 姚雅儷 隋倩 李科 黃芳 曹永清

長沙市第一醫(yī)院（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬長沙醫(yī)院） 1血液腫瘤科，2婦科 （長沙 410005）

多柔比星（DOX）是一種高效的蒽環(huán)類化療藥物，用于治療多種類型的腫瘤，如急性白血病、惡性淋巴瘤和實(shí)體瘤［1］。然而，劑量依賴性DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性是一種有害的心肌病副作用，導(dǎo)致治療過早終止，并增加了隨后癌癥復(fù)發(fā)的可能性［2-3］。右雷佐生是目前臨床用于預(yù)防蒽環(huán)類心臟毒性的保護(hù)制劑，然而在表柔比星的化療方案中能按照說明書和指南規(guī)范正確使用右雷佐生的病例數(shù)并不多［4］。鑒于目前除了靜脈應(yīng)用的右雷佐生之外，尚無有效預(yù)防蒽環(huán)類心臟毒性的保護(hù)制劑，有必要探尋新的保護(hù)劑為DOX 誘導(dǎo)心臟毒性的臨床治療提供新的選擇。沙庫巴曲纈沙坦鈉片（Entresto）作為一種新的血管緊張素受體-血管緊張素抑制劑，同時具有沙庫巴曲和纈沙坦兩種藥物的特性，可減少心力衰竭患者的心血管事件［5］。ARNI 作為處方口服藥，確定Entresto 在DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性中的有益作用的分子機(jī)制將有助于其在臨床中推廣應(yīng)用。研究［6］表明，在DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性中，Entresto 可以減少心肌損傷并改善心臟功能。心肌細(xì)胞富含線粒體，當(dāng)DOX 在線粒體基質(zhì)中累積時，可引起大量ROS 和線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟毒性［7］。最近研究［8］證實(shí)Entresto 通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和線粒體功能完整性來保護(hù)心腎綜合征大鼠的心肌細(xì)胞和心臟功能。因此，在這項(xiàng)研究中，我們探討了在DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性小鼠中，Entresto 的心臟保護(hù)作用是否涉及氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 動物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)雄性成年ICR小鼠［6 ～ 8周齡，體質(zhì)量（22 ± 3）g］，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，質(zhì)量證書編號為SCXK（京）-2019-0004。本研究經(jīng)我院動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2021080003）。所有小鼠在溫度為（23.0 ± 2.0）℃、濕度為（60.0 ± 10.0）%的飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)，光照/黑暗周期為12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后，將小鼠隨機(jī)分為3 組（n= 8）：對照組、DOX 組和DOX + Entresto 組。動物實(shí)驗(yàn)中使用的Entresto 劑量是基于初步實(shí)驗(yàn)并結(jié)合先前描述其預(yù)防心臟毒性功效的研究確定［9］。DOX + Entresto 組小鼠接受連續(xù)28 d 口服Entresto治療，治療劑量為30 mg/（kg·d）。從Entresto給藥的第7 天起，DOX 組和DOX + Entresto 組小鼠每周通過尾靜脈注射DOX（5 mg/kg）1 次，連續(xù)4 周，累積劑量為20 mg/kg，以誘導(dǎo)亞急性心肌損傷。DOX 劑量的選擇是基于初步實(shí)驗(yàn)和以前對DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性的研究［10］。對照組的小鼠注射相同體積的生理鹽水（0.9% NaCl），每周1 次，持續(xù)4 周。最后一次注射DOX 后，于次日處死小鼠，取出心臟，計(jì)算小鼠心臟指數(shù)，公式為心臟重量與體質(zhì)量比值。

1.2 血清學(xué)測定通過市售試劑盒（南京建成生物工程研究所）檢測血清中的肌酸磷酸激酶（CK）、肌激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脫氫酶（LDH）的活性。

1.3 組織學(xué)變化分析將新鮮心臟組織在室溫下浸入10%中性緩沖甲醛中超過48 h。在分級乙醇中脫水后，將組織包埋在石蠟中，切成5 μm厚度。切片用H&E 染料試劑盒染色，然后在光學(xué)顯微鏡下檢查心臟組織的病理變化。

1.4 超聲波心動描記術(shù)在VisualSonics Vevo 2100 超聲系統(tǒng)（加拿大VisualSonics 公司）上通過M-模式在長軸視圖上對小鼠進(jìn)行超聲心動圖檢查。在至少3 個連續(xù)完整的心動周期測量左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）。

1.5 心肌線粒體的透射電鏡檢查將來自不同實(shí)驗(yàn)組的心臟組織樣本切成小塊（1 mm3）并在電子顯微鏡固定緩沖液中固定24 h，然后在1%四氧化鋨中固定1 h，并包埋在環(huán)氧樹脂中。通過HT7800透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）獲得圖像。

1.6 氧化應(yīng)激檢測通過DCFH-DA 染色（南京建成生物工程研究所）評估ROS 產(chǎn)生。將新鮮的心臟冷凍切片或H9c2 細(xì)胞在黑暗中用DHE 或DCFH-DA 在37 ℃下染色30 min，然后用熒光顯微鏡分析。

1.7 TUNEL 染色使用TUNEL 檢測試劑盒（熒光法）（上海碧云天公司）對心臟切片和H9c2 細(xì)胞進(jìn)行TUNEL 染色，以檢測小鼠心臟組織和細(xì)胞的凋亡。使用BX50-FLA 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）觀察凋亡細(xì)胞。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)和活力測定小鼠心肌細(xì)胞（H9c2）獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。H9c2 細(xì)胞在含有10% FBS、100 U/mL 青霉素和鏈霉素的DMEM 中培養(yǎng)。每48 h 更換培養(yǎng)基，直到細(xì)胞培養(yǎng)到80% ～ 90%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

H9c2 細(xì)胞在DOX（1 mmol/L）存在或不存在的情況下用Entresto（0 ～ 48 μmol/L）預(yù)處理24 h，向細(xì)胞中加入20 μL MTT 溶液（美國Sigma 公司）。用Fluoroskan 酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）在490 nm處檢測細(xì)胞活力。

1.9 線粒體膜電位檢測JC-1 熒光探針（北京Solarbio公司）分析DOX誘導(dǎo)的線粒體膜電位變化。向細(xì)胞中加入1 mL JC-1工作溶液，充分混合，孵育20 min。在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.10 Western blot 檢測使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液（上海碧云天公司）勻漿來自細(xì)胞和心臟組織的總蛋白樣品。用SDS-PAGE（8% ～ 12%）分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在室溫下用5%脫脂乳封閉2 h 后，將膜與初級抗體在4 ℃下孵育過夜。將膜與HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶5 000）在室溫下孵育2 h，然后與電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)1 min（在黑暗中）。用Image lab軟件檢測和分析膜上蛋白質(zhì)的灰度值。使用以下抗體：抗SIRT1 抗體（1∶1 000）、抗PGC-1α 抗體（1∶1 000）、抗MFN2 抗體（1∶800）和GAPDH（1∶2 000）（均購自美國Cell Signaling Technology 公司）。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在SPSS 22.0上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單向方差分析和Tukey 事后檢驗(yàn)。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Entresto 改善DOX 誘導(dǎo)的體內(nèi)心臟毒性與對照組相比，DOX 組心肌細(xì)胞內(nèi)CK、CK-MB 和LDH 的漏出量顯著增加（P＜ 0.01），和心臟指數(shù)顯著降低（P＜ 0.01），見表1。Entresto 給藥逆轉(zhuǎn)了DOX 組的這些變化。此外，在DOX 組中觀察到心肌纖維的廣泛變性和碎裂。Entresto 給藥可改善上述組織病理學(xué)改變，心肌纖維呈現(xiàn)與對照組相似的放射模式（圖1）。

圖1 Entresto 對DOX 所致亞急性心肌損傷小鼠心肌組織病理學(xué)的影響Fig.1 Effect of Entresto on myocardial histopathology in mice with subacute myocardial injury induced by DOX

表1 Entresto 改善DOX 誘導(dǎo)的體內(nèi)心臟毒性Tab.1 Entresto improves DOX-induced cardiotoxicity in vivo ±s

表1 Entresto 改善DOX 誘導(dǎo)的體內(nèi)心臟毒性Tab.1 Entresto improves DOX-induced cardiotoxicity in vivo ±s

注：與Control組比較，*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.001；與DOX組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01

項(xiàng)目CK（ng/mL）CK-MB（ng/mL）LDH（U/L）心臟指數(shù)心臟組織病理學(xué)評分對照組（n = 8）42 ± 3 1.24 ± 0.28 422 ± 23 0.004 4 ± 0.000 3 0.20 ± 0.01 DOX組（n = 8）71 ± 5*1.82 ± 0.18*735 ± 38**0.003 6 ± 0.000 4*3.21 ± 0.11**DOX+Entresto組（n = 8）48 ± 4##1.33 ± 0.20#531 ± 29##0.004 2 ± 0.000 6#1.39 ± 0.14##

2.2 Entresto 改善DOX 誘發(fā)的心肌功能障礙與對照組相比，DOX 嚴(yán)重影響小鼠左心室收縮功能，其中EF 和FS 顯著降低（P＜ 0.01）。相反，Entresto治療顯著逆轉(zhuǎn)了DOX 誘發(fā)的左心室收縮功能障礙（P＜ 0.05）。DOX 組小鼠的E/A 比值明顯低于對照組（P＜ 0.01）。與DOX 組相比，DOX+Entresto組E/A 比值顯著降低（P＜ 0.05）。見圖2、表2。

圖2 每組獲得的代表性M 型超聲心動圖Fig.2 The representative M-mode echocardiography obtained in each group

表2 Entresto 改善了DOX 誘發(fā)的心肌功能障礙Tab.2 Entresto improves myocardial dysfunction induced by DOX ±s

表2 Entresto 改善了DOX 誘發(fā)的心肌功能障礙Tab.2 Entresto improves myocardial dysfunction induced by DOX ±s

注：與Control組比較，*P ＜ 0.01；與DOX組比較，#P ＜ 0.05

項(xiàng)目E/A LVIDd（mm）LVIDs（mm）LVEF （%）LVFS （%）對照組（n = 8）1.71 ± 0.06 2.23 ± 0.43 2.62 ± 0.50 79.80 ± 2.03 52.21 ± 1.64 DOX組（n = 8）0.88 ± 0.18*2.95 ± 0.28*3.76 ± 0.47*52.65 ± 3.11*24.06 ± 2.08*DOX+Entresto組（n = 8）1.42 ± 0.15#2.60 ± 0.22#3.42 ± 0.32#67.86 ± 2.14#43.39 ± 2.67#

2.3 Entresto 保護(hù)心肌細(xì)胞免受DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性DOX 刺激的H9c2 細(xì)胞存活率明顯低于對照組（P＜ 0.01）。Entresto 預(yù)處理可以劑量依賴性地增強(qiáng)心肌細(xì)胞的活力，并當(dāng)Entresto 濃度為12 μmol/L 時達(dá)到峰值（P＜ 0.01）。因此，研究選擇12 μmol/L 作為后續(xù)研究的Entresto 干預(yù)濃度。見表3。

表3 Entresto 對H9c2 細(xì)胞活性和DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞毒性的影響Tab.3 The effect of Entresto on H9c2 cell activity and DOX induced H9c2 cell toxicity ±s

表3 Entresto 對H9c2 細(xì)胞活性和DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞毒性的影響Tab.3 The effect of Entresto on H9c2 cell activity and DOX induced H9c2 cell toxicity ±s

注：與Ctrl組比較，*P ＜ 0.01；與DOX+Entresto （0 μmol/L）組比較，#P＜0.05，##P ＜ 0.01

處理方法Entresto （μmol/L）DOX+Entresto （μmol/L）劑量Ctrl 0.75 3 12 48 96 Ctrl 0 0.75 3 12 48細(xì)胞活力（%）100 ± 2 102 ± 2 105 ± 3 97 ± 3 88 ± 3 72 ± 2*100 ± 3 70 ± 2*72 ± 2*84 ± 2#90 ± 1##82 ± 1#

2.4 Entresto 保護(hù)心肌細(xì)胞免受DOX 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和線粒體損傷與對照組比較，DOX 組心室組織中的ROS 水平和凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增加（P＜ 0.001）。DOX+Entresto 組心室組織中的ROS水平和凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著低于DOX 組（P＜ 0.05）。DOX 誘導(dǎo)了小鼠心臟中的線粒體損傷，如線粒體腫脹、嵴縮短和減少以及局灶性空泡的出現(xiàn)。DOX+Entresto 組中的線粒體結(jié)構(gòu)基本完整。見圖3、表4。

圖3 Entresto 保護(hù)心肌細(xì)胞免受DOX 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和線粒體損傷Fig. 3 Entresto protects cardiomyocytes from oxidative stress and mitochondrial damage induced by DOX

表4 ROS 熒光強(qiáng)度和凋亡細(xì)胞百分比量化Tab.4 Quantification of ROS fluorescence intensity and percentage of apoptotic cells ±s

表4 ROS 熒光強(qiáng)度和凋亡細(xì)胞百分比量化Tab.4 Quantification of ROS fluorescence intensity and percentage of apoptotic cells ±s

注：與Control組比較，*P ＜ 0.001；與DOX組比較，#P ＜ 0.01

項(xiàng)目ROS熒光強(qiáng)度凋亡率 （%）對照組（n=8）22 ± 2 5 ± 1 DOX組（n = 8）65 ± 4*42 ± 3*DOX+Entresto組（n = 8）35 ± 3#16 ± 2#

2.5 Entresto 改善DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體損傷與對照組相比，DOX 組H9c2 細(xì)胞中ROS 的熒光強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加（P＜ 0.001），和線粒體膜電位明顯降低（P＜ 0.001）。與DOX 組相比，Entresto+DOX 組H9c2 細(xì)胞中的ROS 水平和凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著降低（P＜ 0.05），和線粒體膜電位顯著增加（P＜ 0.05）。見圖4、表5。

圖4 Entresto 改善DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體損傷Fig.4 Entresto improves oxidative stress and mitochondrial damage induced by DOX in H9c2 cells

表5 Entresto 改善DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體損傷Tab.5 Entresto improves oxidative stress and mitochondrial damage induced by DOX in H9c2 cells ±s

表5 Entresto 改善DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體損傷Tab.5 Entresto improves oxidative stress and mitochondrial damage induced by DOX in H9c2 cells ±s

注：對對照組比較，*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.001；與DOX 組比較，#P ＜0.01，##P ＜ 0.001

項(xiàng)目ROS熒光強(qiáng)度凋亡百分比（%）相對熒光（紅色/綠色比率）對照組（n = 3）8 ± 1 1.00 ± 0.02 1.62 ± 0.08 DOX組（n = 3）52 ± 4**22 ± 1**0.82 ± 0.07*DOX+Entresto組（n = 3）24 ± 2##6 ± 0.3###1.46 ± 0.05##

2.6 Entresto 激活SIRT1/PGC-1α/MFN2 信號通路DOX+Entresto 組心室組織中的SIRT1、PGC-1α、MFN2 蛋白水平顯著高于DOX 組（P＜ 0.05）。Entresto+DOX組H9c2細(xì)胞中SIRT1、PGC-1α、MFN2蛋白水平較DOX 組顯著增加（P＜ 0.05）。見圖5、表6-7。

圖5 Entresto 激活SIRT1/PGC-1α/MFN2 信號通路Fig. 5 Entresto activates SIRT1/PGC-1α/MFN2 signal pathway

表6 Western blot 檢測小鼠心室組織中的SIRT1、PGC-1α、MFN2 蛋白水平Tab.6 Western blot was used to detect the protein levels of SIRT1， PGC-1α and MFN2 in mouse ventricular tissues ±s

表6 Western blot 檢測小鼠心室組織中的SIRT1、PGC-1α、MFN2 蛋白水平Tab.6 Western blot was used to detect the protein levels of SIRT1， PGC-1α and MFN2 in mouse ventricular tissues ±s

注：與對照組比較，*P ＜ 0.001；與DOX組比較，#P ＜ 0.001

項(xiàng)目SIRT1 Mfn2 PGC-1α對照組（n = 8）1.00 ± 0.03 1.00 ± 0.02 1.00 ± 0.03 DOX組（n = 8）0.28 ± 0.02*0.22 ± 0.03*0.25 ± 0.02*DOX+Entresto組（n=8）1.33 ± 0.06#1.42 ± 0.07#1.08 ± 0.04#

表7 Western blot 檢測H9c2 細(xì)胞中的SIRT1、PGC-1α、MFN2 蛋白水平Tab.7 Western blot was used to detect the protein levels of SIRT1， PGC-1α and MFN2 in H9c2 cells ±s

表7 Western blot 檢測H9c2 細(xì)胞中的SIRT1、PGC-1α、MFN2 蛋白水平Tab.7 Western blot was used to detect the protein levels of SIRT1， PGC-1α and MFN2 in H9c2 cells ±s

注：與對照組比較，*P ＜ 0.001；與DOX組比較，#P ＜ 0.001

項(xiàng)目SIRT1 Mfn2 PGC-1α對照組（n = 3）1.00 ± 0.03 1.00 ± 0.02 1.00 ± 0.03 DOX組（n = 3）0.14 ± 0.02*0.20 ± 0.03*0.25 ± 0.02*DOX+Entresto組（n = 3）1.56 ± 0.06#1.12 ± 0.07#1.13 ± 0.04#

3 討論

DOX 化療不可避免地給腫瘤患者帶來一些劑量相關(guān)的心臟毒副作用［2-3］。因此，迫切需要尋找有效的藥物來預(yù)防DOX 引起的心臟毒性。這項(xiàng)研究的主要發(fā)現(xiàn)是Entresto 在小鼠模型中保護(hù)DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性。在最近的研究［11-12］中，已報(bào)道Entresto 對心血管系統(tǒng)的潛在保護(hù)作用。例如，Entresto 通過激活PI3K/Akt 通路和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡來保護(hù)實(shí)驗(yàn)性大鼠心臟免受缺血/再灌注損傷［11］。此外，Entresto 逆轉(zhuǎn)高血壓性肥厚型心肌病模型心臟結(jié)構(gòu)和功能［12］。然而，關(guān)于Entresto 對抗DOX 誘導(dǎo)的心肌損傷有益作用的報(bào)道仍然有限。因此，本研究探索了Entresto 對DOX 誘導(dǎo)的心肌損傷保護(hù)作用的潛在分子機(jī)制。

DOX 化療破壞了身體的正常穩(wěn)態(tài)。有報(bào)道稱，DOX 暴露誘導(dǎo)的心臟毒性可能是心臟膜脂質(zhì)過氧化增加后的繼發(fā)性事件，導(dǎo)致心臟毒性相關(guān)標(biāo)志物的泄漏［13］。我們的結(jié)果表明，DOX 刺激的小鼠血清中CK、CK-MB、LDH 的釋放明顯高于對照組。Entresto 預(yù)處理減少了這些心肌酶的釋放，改善了DOX 誘導(dǎo)的心肌損傷。ROS 產(chǎn)生是觸發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的早期事件，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡或壞死［14］。本研究表明，DOX 刺激后H9c2 心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 積累顯著增加，表明氧化應(yīng)激與DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性密切相關(guān)。Entresto預(yù)處理可降低H9c2心肌細(xì)胞ROS 的表達(dá)水平。研究［15］發(fā)現(xiàn)，DOX 治療可以顯著降低內(nèi)源性抗氧化酶的活性，導(dǎo)致內(nèi)源性ROS 的積累，最終導(dǎo)致不同程度的組織或細(xì)胞損傷。因此，Entresto 可能通過降低氧化應(yīng)激來改善DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性。

DOX 引起的心臟毒性不僅與過度氧化應(yīng)激有關(guān)，還與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［16］。維持線粒體穩(wěn)態(tài)的能力對維持心肌細(xì)胞的正常功能具有重要作用。在DOX 誘導(dǎo)的心肌病中，線粒體形態(tài)、動力學(xué)和線粒體能量代謝變得紊亂［17］。DING 等［7］發(fā)現(xiàn)，線粒體融合蛋白（MFN2）表達(dá)上調(diào)通過介導(dǎo)線粒體融合、減少細(xì)胞損傷和抑制DOX 心臟毒性來增強(qiáng)線粒體氧化代謝。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DOX 給藥后，心室組織中ROS 生成增加，線粒體膜電位去極化，電鏡下內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)不完整。這些線粒體變化可能與MFN2 的下調(diào)有關(guān)。SIRT1/PGC-1α 軸是哺乳動物細(xì)胞中線粒體生成的主要信號通路［18］。研究［19］表明，SIRT1 可以調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)以增強(qiáng)線粒體功能，或通過中間因子PGC-1α調(diào)節(jié)MFN2 表達(dá)。在這項(xiàng)研究中，DOX 刺激降低了SIRT1、PGC-1α 和MFN2 的表達(dá)；這一結(jié)果與之前的研究一致，在這些研究中，DOX 降低了H9c2和新生大鼠心肌細(xì)胞中SIRT1 和MFN2 的表達(dá)［20］。因此，Entresto 可能通過激活SIRT1/PGC-1α/MFN2信號通路改善DOX 的心臟毒性。

綜上所述，本研究表明Entresto 通過抑制ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和凋亡來改善DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性，其機(jī)制可能與SIRT1/PGC-1α/MFN2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。我們的結(jié)果表明，Entresto 具有潛在的心臟保護(hù)作用，有望成為降低腫瘤化療心臟毒性的有效藥物。

【Author contributions】LIU Jieqiong performed the experiments and wrote the article. LI Ke and SUI Qian performed the experiments.HUANG Fang and CAO Yongqing revised the article.YAO Yali designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.