何 園，李自強，馬淑梅，龍 銦，劉 莉*

（1.上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620； 2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院藥理評價研究中心，上海 200437； 3.上海市生物物質(zhì)成藥性評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200437； 4.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200437； 5.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院中醫(yī)科，陜西 西安 710032）

隨著現(xiàn)代社會環(huán)境變化和人口老齡化加劇，癌癥、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、心腦血管等發(fā)病率也隨之增長。衰老被認為是導(dǎo)致這些疾病的主要因素［1］。因此，抗衰老逐漸成為研究熱點。研究表明，藥物治療或基因干預(yù)可能延長壽命，也可能推遲與衰老有關(guān)疾病的發(fā)病，從而促進健康。因此，對延緩衰老過程和預(yù)防衰老相關(guān)疾病的需求日益增加。

中藥作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成，歷史源遠流長，其醫(yī)學(xué)功效和預(yù)防作用一直備受關(guān)注［2-3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，許多中藥具有抗衰老作用［4］。地黃可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠腎脂質(zhì)過氧化及紅細胞溶血，通過清除自由基的產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過氧化，延緩細胞衰老［5］； 紅參能夠通過激活A(yù)MP 蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK） 來保護細胞免受鐵誘導(dǎo)的活性氧（reactive oxygen species，ROS） 和線粒體損傷［6］。黃精枸杞膠囊由熟地黃（RehmanniaeRadixPraeparata）、枸杞子（FructusLycii）、黃精 （PolyonatiRhizoma）、女貞子（FructusLigustriLucidi） 和西洋參 （PanacisQuinquefolii Radix） 組成，具有提高免疫、緩解疲勞的作用，擬開發(fā)成為抗衰老的復(fù)方藥物。

秀麗隱桿線蟲（CaenorhabditisElegans） 生命周期為14～21 d，通體透明，基因組成明確，擁有人類基因組的60% ～80%同源基因，是研究壽命周期的良好模式動物［7-8］。本實驗利用秀麗隱桿線蟲研究黃精枸杞膠囊的抗衰老作用及對壽命健康延長的可及性。

1 材料

1.1 試劑與藥物 野生型N2 秀麗隱桿線蟲株、TJ356 株、AM141 株、大腸桿菌E.coliOP50 均購自美國線蟲中心。胡桃醌（批號H861192） 購自北京華威銳科化工有限公司；蛋白胨（批號20190324）、瓊脂（批號20190130） 及其他試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。黃精枸杞膠囊（批號21030401） 購自蘇州科豪生物制品有限公司，由熟地黃、枸杞子、黃精、女貞子、西洋參組成，經(jīng)粉碎、輻照滅菌（60Co，5 kGy）、提取（西洋參、女貞子用70% 乙醇回流提取2 次，每次8 倍量、1.5 h； 熟地黃、枸杞子、黃精煎煮2 次，每次8 倍量水、1.5 h，過濾，合并濾液）、濃縮、真空干燥（60 ℃）、制粒、裝囊、包裝等工藝制成，規(guī)格0.42 g/粒。

1.2 儀器 KB115 型生化培養(yǎng)箱 （德國Binder 公司）；GI54DWS 型全自動高壓滅菌鍋（50 L，美國Zealway 公司）； Legend Micro 21R 型離心機、Variskan Flash 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； Eppendorf 5810R 型高速離心機（德國Eppendorf 公司）； XP105DR 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； NIB-100 型倒置生物顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）； ECLipse Ti 型熒光倒置顯微鏡［尼康儀器（上海） 有限公司］。

2 方法

2.1 含黃精枸杞膠囊的NGM 培養(yǎng)基配制 稱取黃精枸杞膠囊適量，加入55 ℃恒溫孵育線蟲生長培養(yǎng)基（NGM） 中，搖勻后澆板，制成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1 mg/mL 的培養(yǎng)基，作為黃精枸杞膠囊低、中、高劑量組； 對照組為不含黃精枸杞膠囊的NGM 培養(yǎng)基； 4 ℃保存。

2.2 秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)、同步化 線蟲培養(yǎng)于20 ℃、涂有OP50 的NGM 培養(yǎng)基中，將處于產(chǎn)卵高峰期的線蟲N2用M9 緩沖液沖洗至EP 管，靜置3 min，棄上清獲得線蟲沉淀。利用Bleach 液漂白法對線蟲進行同步化處理［9］。

2.3 秀麗隱桿線蟲壽命實驗 按“2.2” 項下方法獲得同步化的線蟲，分為對照組和給藥組，將同期化的L4 期線蟲分別轉(zhuǎn)移到含有不同質(zhì)量濃度的黃精枸杞膠囊的NGM 培養(yǎng)基中，每組50 條線蟲，置于20 ℃培養(yǎng)。生存期每隔1 d評估1 次，直至死亡。當(dāng)線蟲對鉑金線鎬的觸碰沒有反應(yīng)時，判定為死亡［10］（培養(yǎng)皿邊緣或覆蓋在培養(yǎng)皿上直到培養(yǎng)皿干燥或在瓊脂中鉆洞的線蟲被排除在外）。

2.4 秀麗隱桿線蟲應(yīng)激實驗及生殖實驗 按“2.2” 項下方法制備線蟲，于L4 期將線蟲轉(zhuǎn)移到NGM 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d 后用M9 緩沖液沖洗，除去OP50 和黃精枸杞膠囊。

熱應(yīng)激： 取上述線蟲各50 條，轉(zhuǎn)移至新的NGM 培養(yǎng)基上，置于35 ℃培養(yǎng)箱中，每隔1 h 統(tǒng)計線蟲死亡量，直至所有線蟲死亡［11］。

氧化應(yīng)激： 取上述線蟲各50 只，轉(zhuǎn)移至含胡桃醌（濃度250 μmol/L） 的NGM 培養(yǎng)皿中，每隔24 h 統(tǒng)計死亡數(shù)并記錄，直至所有線蟲死亡［12］。

第二階段溶液pH值在4.56～6.52時，此時溶液中H+離子數(shù)量較少，不能夠完全占據(jù)分子篩表面金屬陽離子空穴，使得表面絡(luò)合作用消失；此時，Pb2+離子吸附機理主要是離子交換作用。

生殖能力： 分組及處理方法同“2.1” 項，于L4 期將線蟲轉(zhuǎn)移至涂有E.coliOP50 的NGM 平皿上，每皿1 條，于成年第1 天將線蟲轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿上，計數(shù)前一培養(yǎng)皿上的蟲卵數(shù)目，連續(xù)5 d，比較給藥組和對照組的平均排卵數(shù)目。

2.5 秀麗隱桿線蟲咽泵速率實驗 按“2.2” 項下方法獲得同步化線蟲。在整個生殖期間，每天將成蟲轉(zhuǎn)移至新的NGM 培養(yǎng)皿中。在成年期第5、10 天在體視鏡下觀察線蟲咽泵30 s，評價咽部的泵血活動，作為老化過程中肌肉損傷的衡量指標。

2.6 秀麗隱桿線蟲身體彎曲試驗 按“2.2” 項下方法獲得同步化線蟲。在整個生殖期間，每天將成蟲轉(zhuǎn)移至新的NGM 培養(yǎng)皿中。在成年期第5、10 天記錄線蟲運動30 s 時所產(chǎn)生的正弦曲線數(shù)［13］。

2.7 秀麗隱桿線蟲超氧化物歧化酶（SOD） 活性及丙二醛（MDA） 水平測定 按“2.2” 項下方法制備線蟲，于L3期將線蟲轉(zhuǎn)移到含/不含黃精枸杞膠囊黃精枸杞膠囊的NGM 板上，每組平行3 次。培養(yǎng)5 d 后，收集線蟲至離心管，M9 緩沖液沖洗3 次，除去OP50 和黃精枸杞膠囊，加入500 μL PBS，于液氮中反復(fù)凍融3 次，4 ℃離心取上清液，超氧化物歧化酶（SOD） 活性和丙二醛（MDA） 水平通過商用試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司） 測定。

2.8DAF-16 亞細胞定位實驗 將TJ356 線蟲同質(zhì)化，收集蟲卵至S-培養(yǎng)基中，于L1 期進行分組，藥物作用5 d 后轉(zhuǎn)移線蟲至2%瓊脂糖墊上，用10 mmol/L 疊氮化鈉麻醉，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.9 多聚谷氨酸（polyQ） 熒光定量實驗 AM141 秀麗線蟲是在其unc-54 基因上轉(zhuǎn)入了融合GFP 的40 個多聚谷氨酰胺長度的polyQ 重復(fù)片段（polyQ） 構(gòu)建而成，由于unc-54 基因在秀麗線蟲肌球蛋白重鏈上表達，如果polyQ 在其中表達則會導(dǎo)致polyQ 在體壁肌肉層聚集。將同步化的AM141 線蟲加到含藥平皿中，20 ℃培養(yǎng)5 d，轉(zhuǎn)移線蟲至2%瓊脂糖墊上，10 mmol/L 疊氮化鈉麻醉，熒光顯微鏡下統(tǒng)計線AM141 周身的熒光點數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗線蟲壽命的影響 如圖1 所示，黃精枸杞膠囊對秀麗線蟲壽命有一定的延長作用，并且呈劑量依賴性。黃精枸杞膠囊中、高劑量組處理的N2秀麗隱桿線蟲平均壽命分別提高了14.76%、20.64% （圖1、表1），說明黃精枸杞膠囊具有潛在的抗衰老作用。

表1 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗隱桿線蟲壽命的影響（Mean±SEM）

圖1 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗隱桿線蟲壽命的影響

3.2 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗隱桿線蟲應(yīng)激能力的影響從成蟲第1 天開始，用不同質(zhì)量濃度的黃精枸杞膠囊預(yù)處理5 d，發(fā)現(xiàn)其對胡桃醌（250 μmol/L） 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有保護作用（圖2a ～2b）。對照組平均存活時間為2.98 d，黃精枸杞膠囊低劑量組平均存活時間為3.18 d （P＞0.05），中劑量組為3.48 d （P＜0.05），高劑量組為4.02 d （P＜0.01）。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，黃精枸杞膠囊高劑量組平均存活時間與對照組相比延長了34.89%。

圖2 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗隱桿線蟲應(yīng)激能力的影響（n＝50）

對照組平均存活時間為7.90 h，黃精枸杞膠囊低劑量組平均存活時間為8.32 h （P＞0.05），中劑量組為8.54 h（P＞0.05），高劑量組為10.34 h （P＜0.01），與對照組相比延長了30.88% （圖2c～2d）。

3.3 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗隱桿線蟲生殖能力的影響如圖3 所示，與對照組比較，黃精枸杞膠囊各劑量組均未影響線蟲的產(chǎn)卵率（P＞0.05），說明黃精枸杞膠囊誘導(dǎo)的壽命延長并不依賴生殖信號通路。

圖3 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗隱桿線蟲生殖能力的影響（n＝50）

3.4 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗隱桿線蟲健康壽命的影響秀麗隱桿線蟲在成年期第5、10 天的咽泵速率和身體彎曲頻率被記錄，并顯示出差異，與對照組比較，黃精枸杞高劑量組線蟲咽泵速率、身體彎曲頻高升高（P＜0.05，P＜0.01） （圖4），表明在黃精枸杞膠囊高劑量作用下，隨著年齡增長，肌肉功能得到了更好的保護。

圖4 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗隱桿線蟲健康壽命的影響（n＝30）

3.5 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗線蟲超氧化物歧氧化酶（SOD） 活性和丙二醛（MDA） 水平的影響 黃精枸杞膠囊高劑量處理線蟲5 d 后，與對照組比較，它可提高線蟲體內(nèi)SOD 活性（P＜0.05），降低體內(nèi)MDA 水平（P＜0.01）（圖5）。

圖5 黃精枸杞膠囊對N2 秀麗線蟲超氧化物歧氧化酶（SOD） 活性和丙二醛（MDA） 水平的影響（n＝300）

3.6 黃精枸杞膠囊對TJ356 線蟲DAF-16 核定位的影響與對照組比較，經(jīng)黃精枸杞膠囊高劑量處理的蟲體熒光強度增強，細胞核內(nèi)DAF-16：： GFP 顆粒數(shù)量增加（P＜0.01）（圖6），說明黃精枸杞膠囊高劑量處理提高了DAF-16 水平，并刺激了其核轉(zhuǎn)位。

圖6 黃精枸杞膠囊對TJ356 線蟲DAF-16 核定位的影響（n＝30）

3.7 黃精枸杞膠囊對AM141 線蟲PolyQ 的影響 對照組AM141 線蟲在第5 天體壁細胞中的熒光聚集點為（39.53±2.94） 個，黃精枸杞膠囊低、中、高劑量組的線蟲其體壁GFP 數(shù)量減少（P＜0.05） （圖7），提示它對AM141 線蟲polyQ 的聚集有一定的抑制作用。細胞中的熒光聚集點分別為（29.72±2.27）、（26.85±3.33）、（27.30±3.32） 個，表明黃精枸杞膠囊各劑量組線蟲polyQ40：：

圖7 黃精枸杞膠囊對AM141 線蟲PolyQ 的影響（n＝30）

4 討論

衰老是所有生物固有的生理過程，會導(dǎo)致細胞保護和生理功能逐步下降。本實驗利用壽命較短的模式生物線蟲，研究黃精枸杞膠囊對線蟲壽命和相關(guān)衰老指標的影響。研究發(fā)現(xiàn)，黃精枸杞膠囊可延長線蟲的平均壽命，黃精枸杞膠囊中、高劑量組的N2 線蟲壽命分別提高了14.76%、20.64%； 對于同質(zhì)化后生長至相同生命時期的N2 線蟲，黃精枸杞膠囊高劑量組處理后，其咽泵頻率與身體彎曲頻率高于對照組。有研究表明，壓力應(yīng)激抵抗能力的提高與生物體壽命延長有關(guān)； 本實驗發(fā)現(xiàn)，對于胡桃醌誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，黃精枸杞膠囊中、高劑量組可提高N2 線蟲抗氧化應(yīng)激能力及存活率； 在熱應(yīng)激條件下，黃精枸杞膠囊高劑量處理的N2 線蟲的抗熱應(yīng)激能力提升。

為進一步了解黃精枸杞膠囊發(fā)揮抗衰老作用的潛在機制，本實驗對黃精枸杞膠囊處理的N2 線蟲的超氧化物歧化酶（SOD） 活性和丙二醛（MDA） 水平進行檢測。研究表明，黃精枸杞膠囊可以誘導(dǎo)SOD 活性升高，從而消除氧自由基，同時顯著降低體內(nèi)MDA 水平?？係OD 活性升高提示了轉(zhuǎn)錄因子DAF-16 可能參與了此過程。DAF-16 是秀麗隱桿線蟲FOXO轉(zhuǎn)錄因子的同源基因，其靶基因主要參與抗逆性、代謝和壽命［14-15］。本實驗用黃精枸杞膠囊處理突變體線蟲TJ356 后發(fā)現(xiàn)，黃精枸杞膠囊提高了TJ356 線蟲細胞核內(nèi)DAF-16 的水平，并刺激其核轉(zhuǎn)位，說明轉(zhuǎn)錄因子DAF-16 參與了黃精枸杞膠囊的抗氧化作用。

然而，壽命的延長并不一定是健康期的延長，健康期是指生命中沒有疾病的時期［16］。如果僅僅是延長了虛弱期，那么延長壽命是不可取的，因為在虛弱期，易患上與衰老相關(guān)疾病［17-18］。神經(jīng)退行性疾病在老年人中更為普遍，并極大地損害生活質(zhì)量［19］。最近研究表明，蛋白動態(tài)失衡不僅是經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素，也是衰老的主要特征，壽命調(diào)節(jié)相關(guān)信號是聯(lián)系衰老、蛋白動態(tài)平衡以及神經(jīng)退行性疾病這三者的重要橋梁［20-21］。因此，本實驗通過黃精枸杞膠囊處理表達polyQ40 的突變體線蟲AM141。結(jié)果表明，黃精枸杞膠囊可抑制AM141 體壁細胞中polyQ 蛋白的聚集，說明黃精枸杞膠囊是通過減緩多聚谷氨酰胺的聚集起到神經(jīng)保護作用的。

綜上所述，黃精枸杞膠囊抗氧化活性顯著。該膠囊可能通過調(diào)控DAF-16/FOXO通路增強線蟲的抗逆性。此外，該膠囊可抗衰老、延長壽命并減弱衰老標志，如與年齡相關(guān)的肌肉功能下降、polyQ40 聚集體的形成。為支持黃精枸杞膠囊的廣泛使用，其生物活性和毒理學(xué)特征還需進一步研究。