郭自賀，王 祎，朱夢姚，袁海陽，呂 馨，貢岳松，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046； 2.江蘇鵬鷂藥業(yè)新藥創(chuàng)新中心，江蘇 宜興 214200）

阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease，AD） 是一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征有β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ） 沉積形成斑塊，Tau 蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結，基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失，以及神經(jīng)炎癥、氧化應激、突觸和神經(jīng)元缺陷，最終導致腦萎縮和認知障礙［1］。AD 早期的神經(jīng)變性特征為突觸功能障礙，尤其在海馬區(qū)［2］，突觸是大腦中信息傳遞和存儲的基本單位，其可塑性和記憶的形成受PSD-95、Shank3、NMDAR 等標志物的調控。AMPK 是調節(jié)能量代謝穩(wěn)態(tài)的重要激酶，激活后能抑制炎癥信號轉導和氧化應激，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有關鍵作用。衰老及環(huán)境中過量的金屬接觸是散發(fā)性AD 的重要致病因素，鋁是生物圈中豐度最高的神經(jīng)毒性金屬，低濃度下即顯示出較強的作用。D-半乳糖處理小鼠可模擬衰老過程［3］，而鋁能促進Aβ 過表達，增強炎癥信號轉導，擾亂能量代謝［4］與膽堿能傳遞［5］，從而損傷認知。

十全大補湯源自《太平惠民和劑局方》，是補血益氣的經(jīng)典方，能促進AD 小鼠的Aβ 清除，改善膽堿能系統(tǒng)損傷，對線蟲發(fā)揮抗衰老功效［6-8］。因此，本研究采用D-半乳糖聯(lián)合AlCl3建立AD 模型，通過行為學實驗、組織病理學檢查、相關指標檢測來探究十全大補湯對AD 的作用和潛在機制。

1 材料

1.1 動物 60 只SPF 級雄性ICR 小鼠，體質量20～22 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （浙） 2019-0001］，飼養(yǎng)于溫度（25±1）℃、相對濕度（50±10）%、12 h/12 h 明暗循環(huán)的受控環(huán)境中，自由獲得水和食物。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（倫理號202207A069）。

1.2 試劑與藥物 十全大補湯各組方藥材均由南京同仁堂藥業(yè)有限責任公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學吳啟南教授鑒定為正品。氯化鋁 （批號A104930，美國Sigma 公司）； 鹽酸美金剛［批號E080294，薩恩化學技術（上海） 有限公司］； 二甲苯（批號10023428，國藥集團化學試劑有限公司）； 中性樹膠（批號N861409，上海麥克林生化科技股份有限公司）； 蛋白定量BCA 試劑盒（批號P0009，上海碧云天生物技術有限公司）； SOD、MDA、ACh、AChE 試劑盒 （ 批號 A001-3-2、A003-1-2、A105-1-1、A024-1-1，南京建成生物工程研究所有限公司）； TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒（批號RX202412M、RX203063M，泉州市睿信生物科技有限公司）； PSD-95、NR1、NR2A、AMPK 抗體（批號36233S、5704S、4205S、5831s，美國Cell Signaling Technology 公司）； p-AMPK 抗體（批號ab133448，英國Abcam 公司）； Shank3 抗體（批號sc-377470，美國Santa Cruz 公司）； NR2B 抗體（批號21920-1-AP，武漢三鷹生物技術有限公司）； GAPDH 抗體（批號FD0063，杭州弗德生物科技有限公司）；D-半乳糖、二抗HRP-羊抗小鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG （批號BS971、BL001A、BL003A，合肥白鯊生物科技有限公司）； ECL 發(fā)光液（批號180-5001，上海天能科技有限公司）。

1.3 儀器 Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)V2.0 （安徽正華生物儀器設備有限公司）； ACT-100A 型FreezeFrame 系統(tǒng)（美國Actimetrics 公司）； Tecan Infinite 200 Pro 型酶標儀（瑞士Tecan 公司）； VE-180B 型垂直水浴槽、EPS300 型電泳儀、Tanon 5200 Multi 型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 十全大補湯制備 十全大補湯按《太平惠民和劑局方》 中原方配比制備，10 味藥材各等分，洗凈后加水浸泡30 min，按常規(guī)方法煎煮2 次，合并濾液并濃縮至生藥量為0.624 g/mL，在-20 ℃下保存。濃縮藥液于臨用前稀釋至所需質量濃度，0.22 μm 微孔濾膜過濾。

2.2 分組、造模與給藥 60 只小鼠隨機分為對照組、模型組、美金剛組（5 mg/kg） 和十全大補湯高、中、低劑量組（6.24、3.12、1.56 g/kg，分別為臨床等效劑量的8、4、2 倍），每組10 只。除對照組外，其余各組小鼠腹腔注射120 mg/kgD-半乳糖并灌胃20 mg/kg AlCl3，連續(xù)70 d。第29 天開始給藥與造模間隔6 h，各給藥組灌胃相應劑量藥物，對照組和模型組灌胃等量純水，每天1 次，連續(xù)42 d。

2.3 Morris 水迷宮實驗 實驗進行5 d，前4 d 為訓練期，將小鼠從各象限面向池壁放入水中，記錄60 s 內找到平臺所需時間即為逃避潛伏期，若60 s內小鼠未能找到平臺，則逃避潛伏期記為60 s，并且需引導其在平臺上停留10 s，每天訓練4 次。訓練結束后，于第5 天進行測試，將小鼠從任一象限放入水中，記錄其逃避潛伏期，通過Morris 水迷宮圖像自動監(jiān)視系統(tǒng)完成實驗數(shù)據(jù)采集與記錄。

2.4 條件恐懼實驗 參考文獻［9］ 報道，實驗進行3 d。第1 天為訓練測試，將小鼠放入訓練室中自由探索3 min，隨后暴露于2.5 Hz、85 db 的音調中30 s 作為條件刺激（CS），后給予75 mA 的雜亂足刺激2 s 作為非條件刺激（US），在一次CS/US 剝離后2 min 內記錄小鼠僵直時間，即為瞬時僵直反應，重復7 次，共1 244 s。24 h 后進行保持測試，將小鼠放入同一訓練室中20 min，不給予任何刺激，記錄其情景僵直反應。第3 天為條件提示測試階段，改變訓練室內部環(huán)境，小鼠適應3 min 后給予2.5 Hz、85 db 的音調刺激30 s，2 min后進行下一輪音調刺激（其間無電刺激），重復10次，共1 680 s，記錄小鼠條件提示僵直反應。采用軟件對小鼠僵直行為進行評分，換算為僵直反應比，公式為僵直反應比＝ （總僵直時間/總測試時間） ×100%。

2.5 組織病理學檢查 行為學實驗結束后，小鼠麻醉脫頸處死，收集血清和腦組織。取全腦組織，在4%多聚甲醛中固定24 h 后用石蠟包埋，制備4 μm 切片，脫蠟，用蘇木素-伊紅（HE） 染色，脫水封片，在顯微鏡下觀察海馬組織CA1、CA3 區(qū)病理變化，采集圖像。

2.6 氧化應激、炎癥水平及膽堿能系統(tǒng)功能檢測 取小鼠全腦組織置于冰上，迅速分離出海馬體，加入9 倍量生理鹽水，超聲破碎勻漿，4 ℃、4 000 r/min 離心15 min，取上清液待測。使用試劑盒檢測小鼠血清SOD 活性和MDA 水平，海馬組織SOD、AChE 活性，MDA、ACh、TNF-α、IL-1β水平。

2.7 Western blot 法檢測海馬組織相關蛋白表達取海馬組織，加入含1 mmol/L PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液，于冰上裂解，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，即為蛋白溶液，BCA 法測定蛋白濃度，將等量樣品與上樣緩沖液混合后煮沸5 min 進行變性。每組上樣30 μg 蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳分離后轉移到NC 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入相應一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，TBTS 清洗，將膜與HRP 標記的二抗在室溫下孵育1 h，洗膜，ECL 發(fā)光顯影。凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片，通過Image J 軟件定量分析蛋白條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計學分析 通過GraphPad Prism 8.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 十全大補湯對AD 小鼠空間學習記憶能力的影響 與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長（P＜0.01），找到平臺的路徑增長； 與模型組比較，十全大補湯中、高劑量組和美金剛組小鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。

圖1 十全大補湯對AD 小鼠空間學習記憶能力的影響（±s，n＝10）Fig.1 Effects of Shiquan Dabu Decoction on spatial learning and memory ability of AD mouse models （±s，n＝10）

3.2 十全大補湯對AD 小鼠聯(lián)想記憶能力的影響 各組小鼠在第1 天訓練測試期中表現(xiàn)出相似的瞬時僵直水平，見圖2A。在第2 天保持測試和第3天條件提示測試階段，模型組小鼠情景僵直及條件提示僵直水平低于對照組（P＜0.01）； 與模型組比較，十全大補湯高劑量組情景僵直反應水平升高，中劑量組條件提示僵直水平升高（P＜0.05），見圖2B～2C。

圖2 十全大補湯對AD 小鼠聯(lián)想記憶的影響（±s，n＝10）Fig.2 Effects of Shiquan Dabu Decoction on associative memory in AD mouse models （±s，n＝10）

3.3 十全大補湯對AD 小鼠海馬組織神經(jīng)細胞形態(tài)的影響 如圖3 所示，對照組小鼠CA1、CA3 區(qū)細胞排列規(guī)則，結構完整，形態(tài)清晰，無明顯病理損傷； 模型組可見細胞排列松散，胞體固縮，胞漿濃染的異常形態(tài)； 十全大補湯各劑量組及美金剛組神經(jīng)細胞形態(tài)改變減少，排列更緊密，染色較均勻，病理損傷減輕。

圖3 十全大補湯對AD 小鼠海馬組織神經(jīng)細胞形態(tài)的影響（×400）Fig.3 Effects of Shiquan Dabu Decoction on morphology of neurons in hippocampus of AD mouse models （×400）

3.4 十全大補湯對AD 小鼠體內氧化應激水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠血清、海馬組織中SOD 活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，十全大補湯高、中劑量組和美金剛組小鼠血清及海馬組織SOD 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），十全大補湯高劑量組血清及海馬組織MDA 水平降低（P＜0.01），美金剛組小鼠海馬組織MDA 水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 十全大補湯對AD 小鼠體內氧化應激水平的影響（±s，n＝5）Fig.4 Effects of Shiquan Dabu Decoction on oxidative stress in AD mouse models （±s，n＝5）

3.5 十全大補湯對AD 小鼠腦內膽堿能系統(tǒng)的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬組織ACh 水平降低（P＜0.01），AChE 活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，十全大補湯高劑量組和美金剛組小鼠海馬組織ACh 水平升高（P＜0.05），十全大補湯高、中劑量組小鼠海馬組織AChE 活性降低（P＜0.01），見圖5。

3.6 十全大補湯對AD 小鼠海馬組織炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β 水平升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，十全大補湯高劑量組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β 水平降低（P＜0.05），中劑量組小鼠海馬組織TNF-α 水平降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 十全大補湯對AD 小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β水平的影響（±s，n＝5）Fig.6 Effects of Shiquan Dabu Decoction on the hippocampal levels of TNF-α and IL-1β of AD mouse models （±s，n＝5）

3.7 十全大補湯對AD 小鼠海馬組織突觸蛋白及AMPK 表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬組織PSD-95、Shank3、NR1、NR2A、NR2B、p-AMPK 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，十全大補湯高劑量組小鼠海馬組織PSD-95、Shank3、NR1、NR2A、NR2B、p-AMPK蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），中劑量組小鼠海馬組織PSD-95、NR2A、p-AMPK 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），美金剛組小鼠海馬組織PSD-95、NR2A、NR2B 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖7。

圖7 十全大補湯對AD 小鼠海馬組織突觸蛋白及AMPK 表達的影響（±s，n＝6）Fig.7 Effects of Shiquan Dabu Decoction on synaptic protein and AMPK expression in hippocampus of AD mouse models （±s，n＝6）

4 討論

AD 作為一種年齡相關疾病，衰老被認為是其最危險誘因［10］，機體會隨之發(fā)生氧化應激，炎性因子分泌增多，代謝功能改變等變化，因此本研究采用D-半乳糖誘導小鼠發(fā)生亞急性衰老，聯(lián)合具有神經(jīng)毒性的AlCl3，從多方面模擬AD 的病理特征。在中醫(yī)理論中AD 屬“癡呆” 范疇，因氣血兩虛、痰瘀痹阻而導致元神受阻，神機失用［11］。中藥復方相較于單一成分藥物具有多靶點、多途徑的優(yōu)勢，十全大補湯方中人參、黃芪益氣，熟地、當歸補血，白術、茯苓健脾，白芍養(yǎng)血，川芎行氣開郁，肉桂回陽通脈，甘草溫補脾胃［12］，有望兼治AD 本標。

本研究首先通過行為學實驗測試十全大補湯對AD 小鼠空間學習記憶和聯(lián)想記憶能力的影響［13］，結果顯示十全大補湯縮短了小鼠的逃避潛伏期，增強了情景和條件提示僵直反應，可有效改善其認知缺陷。海馬體是大腦中與學習記憶聯(lián)系最為緊密的組織，是情景及空間記憶形成和鞏固的必要區(qū)域［14］，HE 染色結果顯示十全大補湯可減輕海馬神經(jīng)元損傷，從而恢復小鼠學習記憶能力。

在大腦衰老的過程中，神經(jīng)細胞發(fā)生脂質過氧化反應引起氧化應激［15］，破壞膽堿能系統(tǒng)功能與完整性，使AChE 活性升高，過量ACh 被水解，進而損傷認知功能［16］； 同時，衰老細胞會上調促炎因子如TNF-α、IL-1β 的釋放，誘發(fā)神經(jīng)炎癥。本研究顯示，十全大補湯能升高小鼠體內抗氧化酶SOD 活性，降低脂質過氧化產(chǎn)物MDA 水平； 此外，十全大補湯處理后小鼠腦內ACh 水平升高，AChE 活性及TNF-α、IL-1β 水平下降，表明十全大補湯能降低AD 小鼠氧化應激水平，恢復膽堿能傳遞，抑制炎癥信號轉導。

突觸功能障礙和丟失是AD 的主要神經(jīng)病理特征，是導致AD 早期記憶受損最關鍵的相關因素。突觸可塑性在電生理學上體現(xiàn)為長時程增強（long-term potentiation，LTP），位于突觸后膜的谷氨酸受體NMDAR 在LTP 誘導中發(fā)揮關鍵作用［17］，其主要由亞單位NR1、NR2A、NR2B 組成［14］。PSD-95 是突觸后支架蛋白，可與NMDAR 相互作用并調控其功能［18］； Shank3 是突觸后結構蛋白，通過鳥氨酸蛋白激酶與PSD-95 相連，調節(jié)前腦區(qū)域的興奮性神經(jīng)傳導［19］。AMPK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，協(xié)調代謝和能量需求［20］，激活AMPK 可保護細胞免受氧化損傷，修復線粒體功能障礙［21］，進而抑制炎癥信號轉導，改善突觸缺陷。本研究顯示，十全大補湯可增加PSD-95、Shank3、NR1、NR2A、NR2B 及p-AMPK 的表達，表明十全大補湯能激活AMPK 信號通路，逆轉AD 小鼠的突觸丟失，增強突觸可塑性。

綜上所述，十全大補湯能上調AMPK 信號通路，改善突觸功能障礙，抑制神經(jīng)炎癥與氧化應激，從而恢復D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導的AD 小鼠膽堿能傳遞，減輕海馬神經(jīng)元損傷，改善認知障礙與記憶衰退。