李曉蒙，鄭嫵媚，張智強(qiáng)

（1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450064； 2.雄安創(chuàng)新研究院，河北 雄安 071800）

柚皮素屬于二氫黃酮類化合物［1］，具有抗腫瘤、抗動(dòng)脈硬化、抗炎、抗纖維化、鎮(zhèn)咳、抗心律失常等藥理活性［1-2］，可通過多靶點(diǎn)作用來對(duì)胃癌顯示出良好的治療作用［3］，還能通過多途徑來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡［2］，并且其毒性極低［4］，具備開發(fā)成新藥的潛力。該成分在蒸餾水及不同pH 值磷酸鹽緩沖液中的溶解度為34.13 ～79.52 μg/mL，屬于生物藥劑學(xué)分類中的Ⅳ藥物［5］，但其體內(nèi)吸收受外排作用的影響［6］，導(dǎo)致口服生物利用度僅為5.81%［7］。目前，已有柚皮素PLGA 納米粒［8］、固體脂質(zhì)納米粒［9］、脂質(zhì)體［10］等報(bào)道，但載藥量均較低。

納米混懸劑是在穩(wěn)定劑作用下制備的一種“純” 藥物納米制劑［11-12］，載藥量高，可提高水溶性，促進(jìn)藥物溶出，但對(duì)其脂溶性改善程度有限［13］，而磷脂復(fù)合物可明顯改善藥物脂溶性［14-16］，故將其與納米混懸劑聯(lián)用可有效促進(jìn)藥物體內(nèi)吸收。本實(shí)驗(yàn)制備柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑，并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為該成分提供一種新型納米制劑。

1 材料

AL204 型電子天平［梅特勒托利多儀器（上海） 有限公司］； MS-H-S 型磁力攪拌器［大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京） 股份公司］； Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； Winner 802型激光粒度儀 （濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司）； LM20 型高壓微射流均質(zhì)機(jī) （ 美國Microfluidizer 公司）； MIRA3 型掃描電鏡 （捷克Tescan 公司）； DHJ-25C 型實(shí)驗(yàn)型凍干機(jī)（上海博登生物科技有限公司）； JC-220B 型氮吹儀（聚創(chuàng)華業(yè)儀器有限公司）。

柚皮素對(duì)照品（批號(hào)20200712，純度98.3%，成都德思特生物技術(shù)有限公司）； 染料木素對(duì)照品（批號(hào)K18642，純度98.0%，西安開來生物工程有限公司）。柚皮素原料藥（批號(hào)20200328，純度97.0%，陜西秦邦藥業(yè)有限公司）。維生素E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS，南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司）； 大豆磷脂（批號(hào)210826，磷脂酰膽堿含量為92%，愛必信上海生物科技有限公司）； 甘露醇（批號(hào)20191020，河北源創(chuàng)生物科技有限公司）。

健康SD 大鼠，雌雄兼具，體質(zhì)量（220±20） g，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （豫） 2020-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 柚皮素含量測定 參考文獻(xiàn)［8］ 報(bào)道，采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 Angilent SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相甲醇-0.1% 醋酸（60 ∶40）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長288 nm。

2.1.2 線性關(guān)系考察 稱取柚皮素對(duì)照品25 mg，置于100 mL 量瓶中，加入60 mL 甲醇，超聲提取3 min 溶解，甲醇稀釋至刻度，即得0.25 mg/mL對(duì)照品溶液，流動(dòng)相依次稀釋至10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝22.015 5X＋0.024 7 （r＝0.999 8），在0.05 ～10 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取磷脂復(fù)合物納米混懸劑1 mL （柚皮素質(zhì)量濃度約為250 μg/mL），置于50 mL 量瓶中，加甲醇超聲提取3 min，流動(dòng)相稀釋至刻度，6 000 r/min 離心10 min，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 取10、1、0.05 μg/mL 對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得柚皮素峰面積RSD 分別為0.22%、0.46%、0.38%，表明儀器精密度良好。取“2.1.3” 項(xiàng)下供試品溶液適量，于0、3、6、9、18、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素峰面積RSD 為1.44%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素含量RSD 為1.60%，表明該方法重復(fù)性良好。取9份磷脂復(fù)合物納米混懸劑，每份0.5 mL，分成低、中、高3 組，分別加入0.25 mg/mL 對(duì)照品溶液0.3、0.5、0.8 mL，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素平均加樣回收率分別為101.44%、100.08%、100.96%，RSD 分別為0.46%、0.81%、0.72%。

2.2 磷脂復(fù)合物及其納米混懸劑制備

2.2.1 磷脂復(fù)合物 參考文獻(xiàn)［14］ 報(bào)道，取柚皮素原料藥適量，置于40 ℃真空干燥箱中1 d 以除盡水分，取0.5 g 加到100 mL 四氫呋喃中，加入1.5 g 大豆磷脂，45 ℃水浴800 r/min 攪拌3 h，得澄清透明溶液，在45 ℃下減壓旋蒸除去四氫呋喃，即得。由于柚皮素不溶于二氯甲烷，而磷脂復(fù)合物易溶于后者，故加入該溶劑復(fù)溶，0.45 μm 微孔濾膜過濾除去未參加復(fù)合的原料藥，參考文獻(xiàn)［14］ 報(bào)道測得復(fù)合率為99.3%。

2.2.2 磷脂復(fù)合物納米混懸劑 參考文獻(xiàn)［15，17］ 報(bào)道，取磷脂復(fù)合物50 mg，置于10 mL 乙醇中溶解，作為有機(jī)相； 制備含一定濃度穩(wěn)定劑的水相50 mL，室溫下800 r/min 攪拌溶解，將有機(jī)相緩慢滴到水相中，在250 W 下超聲提取5 min，在45 ℃下減壓旋蒸20 min，立即在一定均質(zhì)壓力下循環(huán)均質(zhì)數(shù)次，置于-10 ℃冰箱中固化10 min，取出，補(bǔ)加蒸餾水至50 mL，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 粒徑、PDI、Zeta 電位測定 取磷脂復(fù)合物納米混懸劑適量，蒸餾水稀釋50 倍，取適量在粒度分析儀上進(jìn)行測定，平行3 次，取平均值。

2.4 制備工藝優(yōu)化 采用單因素試驗(yàn)。

2.4.1 穩(wěn)定劑種類 固定磷脂復(fù)合物用量50 mg，穩(wěn)定劑與磷脂復(fù)合物用量比例3 ∶1，均質(zhì)壓力100 MPa，均質(zhì)次數(shù)8 次，考察穩(wěn)定劑種類對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結(jié)果見表1。由此可知，單用泊洛沙姆188、PVP K30 或TPGS 時(shí)磷脂復(fù)合物納米混懸劑粒徑較大，而聯(lián)用PVP K30 ＋TPGS（1 ∶1） 時(shí)粒徑、PDI 最小，Zeta 電位絕對(duì)值大于30 mV，故選擇其作為穩(wěn)定劑。

表1 穩(wěn)定劑種類對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.1 Effects of stabilizer type on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.4.2 穩(wěn)定劑與磷脂復(fù)合物用量比例 固定磷脂復(fù)合物用量50 mg，穩(wěn)定劑PVP K30＋TPGS （1 ∶1），均質(zhì)壓力100 MPa，均質(zhì)次數(shù)8 次，考察穩(wěn)定劑與磷脂復(fù)合物用量比例對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結(jié)果見表2。由此可知，穩(wěn)定劑用量過小時(shí)粒徑、PDI 較大，Zeta 電位絕對(duì)值較??； 隨著穩(wěn)定劑比例增加，粒徑、PDI 均先降后升，Zeta 電位絕對(duì)值逐漸升高； 當(dāng)兩者比例為3 ∶1 時(shí)，粒徑、PDI 較小，Zeta 電位絕對(duì)值較大，故選擇其作為穩(wěn)定劑與磷脂復(fù)合物用量比例。

表2 穩(wěn)定劑與磷脂復(fù)合物用量比例對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.2 Effects of stabilizer-phospholipids complex consumption ratio on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.4.3 均質(zhì)壓力 固定磷脂復(fù)合物用量50 mg，穩(wěn)定劑為PVP K30＋TPGS （1 ∶1），穩(wěn)定劑與磷脂復(fù)合物用量比例3 ∶1，均質(zhì)次數(shù)8 次，考察均質(zhì)壓力對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結(jié)果見表3。由此可知，均質(zhì)壓力對(duì)Zeta 電位絕對(duì)值影響不大，為80 MPa 時(shí)粒徑大于400 nm，PDI 大于0.3； 隨著均質(zhì)壓力增加，粒徑、PDI 先降后升，表明其過大時(shí)會(huì)導(dǎo)致粒徑變大，分布不均勻，為100 MPa時(shí)兩者較小，故選擇其作為均質(zhì)壓力。

表3 均質(zhì)壓力對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.3 Effects of homogenization pressure on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.4.4 均質(zhì)次數(shù) 固定磷脂復(fù)合物用量50 mg，穩(wěn)定劑PVP K30＋TPGS （1 ∶1），穩(wěn)定劑與磷脂復(fù)合物用量比例3 ∶1，均質(zhì)壓力100 MPa，考察均質(zhì)次數(shù)對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響，結(jié)果見表4。由此可知，均質(zhì)次數(shù)較少時(shí)粒徑、PDI 均較大，但過多時(shí)兩者有減小趨勢； 均質(zhì)10 次時(shí)粒徑、PDI較小，Zeta 電位絕對(duì)值大于30 mV，故選擇其作為均質(zhì)次數(shù)。

表4 均質(zhì)次數(shù)對(duì)粒徑、PDI、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.4 Effects of homogenization frequency on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)及形態(tài)觀察

2.5.1 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)“2.4” 項(xiàng)下結(jié)果，得到最優(yōu)處方為磷脂復(fù)合物用量50 mg，穩(wěn)定劑PVP K30＋TPGS （1 ∶1），穩(wěn)定劑與磷脂復(fù)合物用量比例3 ∶1，均質(zhì)壓力100 MPa，均質(zhì)次數(shù)10 次。按上述優(yōu)化處方平行制備3 批樣品，測得平均粒徑（圖1）、PDI、Zeta 電位（圖2） 分別為（260.53±25.86） nm、0.160±0.024、（-31.08±1.37） mV。

圖1 柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of nanosuspensions of naringenin phospholipids complex

圖2 柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of nanosuspensions of naringenin phospholipids complex

2.5.2 形態(tài)觀察 取磷脂復(fù)合物納米混懸劑適量，蒸餾水稀釋50 倍，渦旋2 s 混勻，滴到銅膠帶上，置于30 ℃真空干燥箱中干燥30 min，噴濺1 min，在掃描電鏡下放大50 000 倍進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖3。由此可知，該制劑基本形態(tài)為類球形或橢圓形，并且其粒徑與激光粒度儀所測值存在一定差異，這是因?yàn)閽呙桦婄R觀察前需對(duì)樣品進(jìn)行干燥。

圖3 柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopic image of nanosuspensions of naringenin phospholipids complex

2.6 凍干粉制備 取磷脂復(fù)合物納米混懸劑適量，加入5%甘露醇，振蕩溶解，分裝至西林瓶中，置于-50 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍1 d，轉(zhuǎn)移到-30 ℃冷凍干燥機(jī)中抽真空，冷凍干燥1 d，即得，蒸餾水復(fù)溶后，測得其平均粒徑、PDI、Zeta 電位分別為（281.16±28.96） nm、0.184±0.027、（-28.17±1.05） mV。另外，磷脂復(fù)合物納米混懸劑凍干粉中柚皮素含量為（0.45±0.02）%。

2.7 凍干粉穩(wěn)定性考察 取磷脂復(fù)合物納米混懸劑及其凍干粉適量，密封后置于恒溫恒濕箱（溫度30 ℃，相對(duì)濕度65%） 中，發(fā)現(xiàn)磷脂復(fù)合物納米混懸劑在第3 天即可肉眼觀察到底部沉淀，而凍干粉于0、10、15、30、45、60、75、90 d 取樣，蒸餾水復(fù)溶后測定粒徑、PDI，結(jié)果見圖4。由此可知，凍干粉放置90 d 后復(fù)溶時(shí)粒徑仍小于300 nm，PDI 仍小于0.3，表明制成凍干粉后可增強(qiáng)磷脂復(fù)合物納米混懸劑穩(wěn)定性。

2.8 X 射線粉末衍射（XRPD） 分析 取柚皮素原料藥、空白輔料（輔料比例同磷脂復(fù)合物納米混懸劑凍干粉）、物理混合物（柚皮素原料藥＋空白輔料，比例同磷脂復(fù)合物納米混懸劑凍干粉）、柚皮素磷脂復(fù)合物、柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑凍干粉適量，填充至樣品槽中，壓平整后進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。由此可知，原料藥在7.2°、8.8°、12.2°等處晶型峰較強(qiáng)； 在物理混合物中上述晶型峰仍可觀察到； 在磷脂復(fù)合物及其納米混懸劑凍干粉中原料藥上述晶型峰消失，表明該成分以無定型狀態(tài)存在。

2.9 溶解度、油水分配系數(shù)測定

2.9.1 溶解度 按“2.5.1” 項(xiàng)下最優(yōu)處方制備磷脂復(fù)合物納米混懸劑，以柚皮素原料藥與磷脂的物理混合物代替磷脂復(fù)合物來制備納米混懸劑，按“2.6” 項(xiàng)下方法制成凍干粉。取柚皮素原料藥、柚皮素磷脂復(fù)合物、柚皮素納米混懸劑、柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑凍干粉適量，置于20 mL 蒸餾水及pH 2.0、4.5、6.8、7.4 磷酸鹽緩沖液中，在250 W 下超聲處理15 min，在25 ℃下磁力攪拌2 d，混懸液過濾，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算溶解度，結(jié)果見圖6。由此可知，磷脂復(fù)合物納米混懸劑在蒸餾水、不同pH 值磷酸鹽緩沖液中的溶解度高于其他3 種樣品。

圖6 各樣品溶解度（n＝3）Fig.6 Solubilities of various samples （n＝3）

2.9.2 油水分配系數(shù) 取柚皮素原料藥、柚皮素磷脂復(fù)合物、柚皮素納米混懸劑、柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑凍干粉適量，加到正辛醇飽和蒸餾水及pH 2.0、4.5、6.8、7.4 磷酸鹽緩沖液中，在250 W 下超聲提取15 min，在25 ℃下磁力攪拌2 d，取上層混懸液，過0.45 μm 水性濾膜，測定濃度C1； 取水相5 mL，加到飽和后同體積正辛醇中，在25 ℃下磁力攪拌2 d，5 000 r/min 離心，取下層水相，測定濃度C0，計(jì)算油水分配系數(shù)P，公式為P＝ （C1-C0） /C0，并計(jì)算lgP，結(jié)果見圖7。由此可知，將原料藥制成磷脂復(fù)合物后lgP升高，表明其脂溶性得到改善； 納米混懸劑lgP降低，可能是由于它對(duì)原料藥水溶性的提高程度大于對(duì)脂溶性的所致； 磷脂復(fù)合物納米混懸劑lgP高于納米混懸劑，可能與磷脂復(fù)合物可提高原料藥脂溶性有關(guān)。

圖7 各樣品油水分配系數(shù)（n＝3）Fig.7 Oil-water partition coefficients for various samples （n＝3）

2.10 解離率測定

2.10.1 均質(zhì)前磷脂復(fù)合物 取磷脂復(fù)合物50 mg（柚皮素含量為W0），置于10 mL 乙醇中溶解，作為有機(jī)相； 取蒸餾水50 mL，室溫下磁力攪拌（800 r/min），作為水相，將有機(jī)相緩慢滴到水相中，在250 W 下超聲提取5 min，在45 ℃下減壓旋蒸20 min，蒸餾水定容至50 mL，12 500 r/min 離心30 min，棄去上清液，殘?jiān)屑尤爰s20 mL 二氯甲烷振蕩10 min，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，二氯甲烷定容至刻度，過0.45 μm 微孔濾膜，減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得，甲醇復(fù)溶，測定柚皮素含量W1，計(jì)算磷脂復(fù)合物在水中的解離率，公式為解離率＝ （1-W1/W0） ×100%。

2.10.2 均質(zhì)后磷脂復(fù)合物 取新制備的磷脂復(fù)合物納米混懸劑0.1 mL，加入乙醇10 mL，超聲提取10 s 溶解，減壓旋蒸除去溶劑得殘?jiān)ú患訜幔?，測定柚皮素含量W0，按“2.10.1” 項(xiàng)下方法測定殘?jiān)形唇怆x磷脂復(fù)合物的量W1，計(jì)算解離率。

2.10.3 凍干后磷脂復(fù)合物 取新制備的磷脂復(fù)合物納米混懸劑凍干粉約50 mg，加入1 mL 蒸餾水復(fù)溶，精密量取0.1 mL，按“2.10.2” 項(xiàng)下方法測定W1，計(jì)算解離率。

2.10.4 結(jié)果分析 均質(zhì)前磷脂復(fù)合物解離率為17.86%，均質(zhì)后增加至28.61%，進(jìn)一步制成凍干粉后為29.07%，表明凍干未對(duì)其解離率產(chǎn)生明顯影響。

2.11 體外釋藥研究 取柚皮素原料藥、柚皮素磷脂復(fù)合物、柚皮素納米混懸劑凍干粉、柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑凍干粉適量（柚皮素含量10 mg），加入6 mL 蒸餾水，轉(zhuǎn)移至透析袋中（截留分子量8～12 kDa），扎緊，設(shè)置轉(zhuǎn)速為75 r/min，介質(zhì)為1 000 mL 蒸餾水，待介質(zhì)恒溫至37 ℃時(shí)放入樣品，取樣點(diǎn)選擇0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、18、24、36 h，取樣、補(bǔ)加蒸餾水體積均為4 mL，0.45 μm 水膜過濾，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算累積溶出度，結(jié)果見圖8。由此可知，原料藥36 h 內(nèi)累積釋放度為44.52%，磷脂復(fù)合物增加至63.34%，而磷脂復(fù)合物納米混懸劑4 h 內(nèi)累積釋放度即達(dá)90%以上。

圖8 各樣品體外釋藥曲線（n＝3）Fig.8 In vitro drug release curves for various samples （n＝3）

2.12 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.12.1 灌胃液制備 取柚皮素原料藥、柚皮素磷脂復(fù)合物、柚皮素納米混懸劑凍干粉、柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑凍干粉適量，0.5% CMC-Na 溶液制成混懸液，即得（柚皮素含量5 mg/mL，臨用現(xiàn)配）。

2.12.2 分組、給藥與采血 24 只大鼠隨機(jī)分為4組，每組6 只，分別給予 “2.12.1” 項(xiàng)下藥液（30 mg/kg），于0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h 置于盛有乙醚的容器中，麻醉5 s 后眼眶采血各約250 μL，置于肝素浸潤離心管中，棉球覆蓋于采血處止血，3 000 r/min 離心3 min，取上層血漿，低溫保存。

2.12.3 血漿樣品處理 參考文獻(xiàn)［18］ 報(bào)道，取100 μL 血漿樣品，加入NH4H2PO4緩沖液（0.06 mol/L，pH 5.0）、甲醇各100 μL，渦旋1 min，加入1 mL 乙酸乙酯，渦旋3 min 后6 500 r/min 離心5 min，吸取上層有機(jī)相至離心管中，40 ℃氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 甲醇復(fù)溶。

2.12.4 線性關(guān)系考察 取柚皮素對(duì)照品適量，甲醇制成2 000、1 000、500、100、50 ng/mL 溶液，分別取100 μL，40 ℃氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 空白血漿，渦旋1 min，即得質(zhì)量濃度分別為2 000、1 000、500、100、50 ng/mL 的血漿對(duì)照品溶液，按“2.12.3” 項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)（染料木素）峰面積比值（Y） 對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝0.001 3X＋0.156 2 （r＝0.994 8），在50～2 000 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.12.5 方法學(xué)考察 取柚皮素原料藥給藥1.5 h后的血漿樣品適量，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD 為9.66%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取50、500、2 000 ng/mL 血漿對(duì)照品溶液適量，同一天內(nèi)在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD 分別為8.12%、5.04%、6.13%，表明該方法日內(nèi)精密度良好； 同法連續(xù)測定6 d，每天1 次，測得兩者比值 RSD 分別為 5.02%、9.42%、7.88%，表明該方法日間精密度良好。取50、500、2 000 ng/mL 血漿對(duì)照品溶液適量，按“2.11.3”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素平均加樣回收率分別為94.05%、93.80%、95.17%，RSD 分別為8.14%、5.09%、4.18%。

2.12.6 結(jié)果分析 血藥濃度-時(shí)間曲線見圖9，再采用3P97 程序統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表5。由此可知，與原料藥比較，磷脂復(fù)合物tmax無顯著差異（P＞0.05），但Cmax、AUC0～t升高（P＜0.05），相對(duì)生物利用度增加至1.97 倍；納米混懸劑、磷脂復(fù)合物納米混懸劑tmax縮短（P＜0.05），Cmax升高（P＜0.01），相對(duì)生物利用度分別增加至3.07、4.38 倍，而與納米混懸劑比較，磷脂復(fù)合物納米混懸劑Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05）。

圖9 柚皮素血藥濃度-時(shí)間曲線（n＝6）Fig.9 Plasma concentration-time curves for naringenin （n＝6）

表5 柚皮素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetics parameters for naringenin （±s，n＝6）

表5 柚皮素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetics parameters for naringenin （±s，n＝6）

注： 與柚皮素原料藥比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與柚皮素納米混懸劑比較，＃P＜0.05。

參數(shù)單位柚皮素原料藥柚皮素磷脂復(fù)合物柚皮素納米混懸劑柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑tmaxh2.11±0.272.23±0.360.96±0.28*1.03±0.31*Cmaxng·mL-1426.33±63.10623.57±94.34*990.93±148.75**1 492.13±203.68**＃AUC0～tng·mL-1·h1 122.73±194.042 209.81±235.01*3 452.10±351.77**4 923.48±512.84**＃AUC0～∞ng·mL-1·h1 210.27±202.522 296.54±246.23*3 508.56±382.60**5 219.67±560.87**＃

3 討論與結(jié)論

何小燕等［16］對(duì)柚皮素磷脂復(fù)合物制備工藝進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)柚皮素與磷脂比例約為1 ∶5，即后者用量過大，故本實(shí)驗(yàn)重新考察該處方。前期報(bào)道，柚皮素制成磷脂復(fù)合物后溶出度較低，可能與該劑型黏性大、分散性差、疏水性強(qiáng)等因素有關(guān)［12］。根據(jù)Ostwald-Freundlich 方程可知，藥物粒徑對(duì)溶解度、溶出速率、溶出度影響很大［19］，而磷脂復(fù)合物本身具有較強(qiáng)的疏水性，故需引入納米混懸劑加以改善［20］。

一般認(rèn)為，藥物吸收最佳logP范圍為-1 ～2［14］，柚皮素磷脂復(fù)合物在pH 2.0、4.5 下該數(shù)值均為2.5 左右，可能會(huì)影響吸收，而其納米混懸劑在1～2 之間，有利于吸收。藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑tmax縮短，可能與該制劑前期釋藥速率較快有關(guān)；Cmax升高，一方面由于磷脂復(fù)合物納米混懸劑提高了原料藥水溶性和脂溶性，另一方面與藥物累積溶出度明顯改善有關(guān)；相對(duì)生物利用度增加至4.38 倍，可能與多種因素有關(guān)，例如無定形藥物比晶型藥物更易吸收［21］；納米藥物與胃腸道接觸更充分，有利于吸收； 柚皮素水溶性、脂溶性、溶出度得到改善，解決了吸收瓶頸［19-22］； 處方中TPGS、磷脂等輔料具有促吸收作用［6］等。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為柚皮素磷脂復(fù)合物納米混懸劑后續(xù)藥效學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，也為相關(guān)納米制劑開發(fā)提供了新思路。