徐 悅，陳海藝，周夢(mèng)含，劉藝璇，郭紅蓮,*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市食品質(zhì)量與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

果蔬采后疾病主要是由真菌感染引起，其產(chǎn)生的真菌毒素對(duì)人畜均有害，并且由微生物感染果實(shí)受損情況占果蔬損失總數(shù)的2%～8%，其果實(shí)受損率高達(dá)50%，因此果蔬采后疾病成為急迫解決的問(wèn)題之一[1-2]。冬棗（Ziziphus jujubaMill.cv.Dongzao）易受鏈格孢菌侵染引起冬棗黑斑病，導(dǎo)致棗果產(chǎn)量和質(zhì)量大幅度下降，這給我國(guó)棗產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)和貯藏造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此，新型高效抗真菌材料的研究開(kāi)發(fā)技術(shù)迫在眉睫。

納米材料因其高反應(yīng)性和高效率而受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。如Ag[4]、ZnO[5]、TiO2[6]和SiO2[7]能有效改善材料的物理化學(xué)和功能特性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、生物、食品、化工等領(lǐng)域。然而納米Cu與其他納米材料相比，具有納米粒徑小、比表面積大、價(jià)格低廉和良好的熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[8]，對(duì)食源性病原體具有強(qiáng)大生物殺滅作用，能夠抵抗惡劣加工條件，是食品包裝中使用的最優(yōu)無(wú)機(jī)納米顆粒之一[9-10]。Shankar等[11]將CuO納米粒子與不同的碳水化合物混合制備多功能生物納米復(fù)合薄膜，探究不同基質(zhì)對(duì)納米薄膜的影響。Saravanakumar等[12]成功制備纖維素納米晶須-海藻酸鈉-CuO包埋聚合物膜，對(duì)病原菌具有較高的抑菌活性以及抗氧化性。大量研究[13-14]表明納米Cu在抗菌應(yīng)用時(shí)會(huì)釋放Cu2+，可使細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，并發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化以及DNA降解，進(jìn)而導(dǎo)致生物量生長(zhǎng)受阻。因此存在納米材料從包裝中遷移至食品的可能性。姜紫薇[15]實(shí)驗(yàn)測(cè)得Cu2+質(zhì)量濃度達(dá)到4.5 μg/mL時(shí)，對(duì)人體的肝細(xì)胞開(kāi)始具有損傷作用。Khan等[16]研究發(fā)現(xiàn)納米纖維還原法制備的聚乙烯醇/Cu納米復(fù)合材料中Cu2+的釋放量為4 μg/mL。甲殼類水蚤與扁虱是預(yù)測(cè)污染物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)毒性的良好模型，Heinlaan等[17]實(shí)驗(yàn)測(cè)得納米CuO對(duì)兩者半致死濃度分別為3.2、2.1 μg/mL。因此要有效監(jiān)控納米復(fù)合膜中離子的遷移量。

可食用的薄膜具有生物降解性、相容性、無(wú)毒性、可再生性以及優(yōu)良成膜能力，是食品包裝研究的大趨勢(shì)[18]。Shankar等[11]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉與納米銅具有良好的兼容性。并且與明膠復(fù)配能夠有效提高海藻酸鈉單一薄膜的力學(xué)性能、熱穩(wěn)定性和生物活性等[19]。利用明膠成本低廉、易獲取且有效改善單一薄膜的性能優(yōu)勢(shì)，將其與海藻酸鈉復(fù)配可制備可降解薄膜。另外，海藻酸鈉/明膠復(fù)合膜除了可以作為分散納米材料的基質(zhì)外，還可成為納米粒子的還原劑和穩(wěn)定劑[20]，因此海藻酸鈉/明膠復(fù)合膜可作為納米Cu粒子的優(yōu)良載體。

近年來(lái)抗菌食品包裝膜的研發(fā)引起眾多研究者們的廣泛關(guān)注，而對(duì)抗真菌食品包裝膜的研究甚少。因此，本研究通過(guò)綠色方法合成納米Cu，并以明膠/海藻酸鈉為模板制備納米Cu/多糖復(fù)合膜。對(duì)納米Cu以及納米Cu/多糖復(fù)合膜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及理化性能的測(cè)定，探究復(fù)合膜抗真菌活性，將其應(yīng)用到冬棗黑斑病防治中，并測(cè)定防治處理后薄膜Cu2+遷移量。研究結(jié)論可為進(jìn)一步在果蔬病害防治領(lǐng)域利用納米Cu以及制備高效抗真菌多糖復(fù)合膜提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬棗（Ziziphus jujubaMill.cv.Dongzao）來(lái)自天津?yàn)I海新區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

鏈格孢菌（Alternaria alternata）、鐮刀菌（Fusarium）、灰霉（Botrytis cinerea）由實(shí)驗(yàn)室從冬棗中提?。获R鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、硫酸銅、甘油、二水檸檬酸鈉、VC、氫氧化鈉 天津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；海藻酸鈉（分析純，黏度350～550 Pa·s，相對(duì)分子質(zhì)量222.00）、明膠（膠強(qiáng)度～250 g Bloom）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FEI-Apreo型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscope，F(xiàn)E-SEM）美國(guó)捷克公司；IS50型傅里葉變換紅外光譜（Fourier-transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀 美國(guó)尼高利公司；Q50型熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）儀美國(guó)TA Instruments Waters LLC公司；UV-3600 Plus型紫外-可見(jiàn)近紅外分光光譜（diffuse reflection spectroscopy，DRS）儀 日本島津公司；ICAPQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS）儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；TA.TOUCH型質(zhì)構(gòu)儀上海保圣實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；CH1S 型數(shù)字測(cè)微計(jì)蘇天瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納米Cu制備

根據(jù)Pariona等[21]方法，稱取2.5 g的二水檸檬酸鈉溶于100 mL的蒸餾水中，加入5 g的硫酸銅，然后加入50 mL的抗壞血酸（0.2 mol/L）充分溶解，加入30 mL的NaOH（1 mol/L）在95 ℃加熱90 min。冷卻至室溫，離心（4000×g、4 ℃）10 min后得到紅棕色粉末，為納米Cu。然后用蒸餾水洗滌3 次，用乙醇洗滌1 次。所得粉末在室溫下干燥48 h。

1.3.2 納米Cu/多糖復(fù)合膜的制備

明膠溶液（8%）與海藻酸鈉溶液（2%）以質(zhì)量比6∶4混合均勻，然后添加1.5%（以前面混合溶液質(zhì)量計(jì)）甘油混合成基礎(chǔ)膜液。將納米Cu粉末加入基礎(chǔ)膜液中，使其質(zhì)量濃度最終為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L，使用攪拌器中速攪拌1 h，然后采用延流法[22]，將15 mL的納米膜液倒入直徑為90 mm的圓形平皿中，45 ℃干燥5 h，冷卻至室溫揭膜，在相對(duì)濕度（55±2）%環(huán)境中平衡72 h備用。

1.3.3 復(fù)合膜的表征

1.3.3.1 微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

隨機(jī)選取完整、表面無(wú)劃痕的納米薄膜，切割制成為5 mm×5 mm的正方形，噴金處理后，放置在FE-SEM下進(jìn)行觀察。

1.3.3.2 紅外光譜、熱穩(wěn)定性測(cè)定

使用FT-IR儀測(cè)量薄膜紅外光譜以評(píng)估薄膜的結(jié)構(gòu)。光譜分辨率為2 cm-1，范圍為450～4000 cm-1。

使用TGA儀評(píng)估薄膜的熱穩(wěn)定性能，將制備的材料在惰性氣體（N2）環(huán)境中以10 ℃/min的加熱速率從30 ℃加熱到600 ℃。

1.3.3.3 透光性測(cè)定

使用DRS儀測(cè)定膜的透光率。

1.3.4 復(fù)合膜理化檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 厚度使用數(shù)字測(cè)微計(jì)在薄膜樣品上隨機(jī)選取10 個(gè)位置，測(cè)量膜的厚度。

1.3.4.2 水蒸氣透過(guò)率（water vapor permeability，WVP）參照李雪[23]的方法測(cè)量。首先，在稱重瓶中注入蒸餾水（100%相對(duì)濕度），并覆蓋上制備的薄膜。然后將稱量瓶放在干燥器中（75%相對(duì)濕度、25 ℃），每24 h對(duì)稱量瓶的質(zhì)量進(jìn)行一次稱質(zhì)量。通過(guò)式（1）得到WVP：

式中：Δm為稱量瓶在Δt時(shí)間內(nèi)的質(zhì)量變化/g；Δt為測(cè)量時(shí)間間隔/d；A為薄膜的有效面積/m2；x為薄膜的平均厚度/m；Δp為薄膜兩邊的水蒸氣分壓差/Pa（純水25 ℃時(shí)的飽和水蒸氣壓為3.1671 kPa，75%相對(duì)濕度水蒸氣壓為2.3753 kPa）。

1.3.4.3 吸濕性與含水量

參照李雪[23]的方法，對(duì)膜吸濕前后和干燥前后進(jìn)行質(zhì)量變化的測(cè)定，進(jìn)而計(jì)算出吸濕性和含水量。

1.3.4.4 機(jī)械性能測(cè)定

使用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)薄膜樣品（20 mm×60 mm的長(zhǎng)方形）進(jìn)行拉伸強(qiáng)度（tensile strength，TS）和斷裂伸長(zhǎng)率（elongation break，EB）的測(cè)定。初始抓取分離距離為30 mm，十字頭速率為1mm/s。TS和EB分別通過(guò)式（2）、（3）得到：

式中：F為薄膜破裂時(shí)的最大拉力/N；L為薄膜的寬度/mm；d為薄膜的厚度/mm。

式中：L0為薄膜的原始長(zhǎng)度/mm；L1為薄膜斷裂時(shí)的長(zhǎng)度/mm。

1.3.5 納米Cu/多糖復(fù)合膜抗真菌活性的測(cè)定

1.3.5.1 復(fù)合膜液對(duì)真菌菌絲的影響

使用藥平板方法測(cè)定納米材料對(duì)真菌菌絲的抑制效果。分別吸取1 mL質(zhì)量濃度為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L的納米Cu/多糖復(fù)合膜液涂布PDA表面，待含藥平板干燥后，向平板中央分別接入鏈格孢菌、鐮刀孢菌、灰霉菌片，共設(shè)置3 組不同種抗菌實(shí)驗(yàn)，每組3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。于27 ℃放置7 d，并進(jìn)行記錄與觀察。

1.3.5.2 復(fù)合膜液對(duì)真菌生物量的影響

分別吸取10 mL質(zhì)量濃度為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L的納米Cu/多糖復(fù)合膜液加入90 mL的PDB培養(yǎng)基中，然后向液體培養(yǎng)基中分別接入一個(gè)鏈格孢菌、鐮刀孢菌、灰霉菌片，共設(shè)置3 組不同種抗菌實(shí)驗(yàn)，每組3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。于27 ℃放置7 d，離心得到菌絲體，烘干直至質(zhì)量無(wú)變化，觀察錐形瓶中真菌生物量生長(zhǎng)狀況及稱量菌絲體的質(zhì)量。

1.3.6 納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)感染真菌冬棗的防治

1.3.6.1 菌懸液的制備

用接種環(huán)刮去平板上的鏈格孢菌，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌水中，加入玻璃珠，徹底搖勻溶液。溶液經(jīng)6 層無(wú)菌紗布過(guò)濾，得到鏈格孢子懸浮液。使用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子懸浮液濃度至1×105spores/mL，現(xiàn)用現(xiàn)制備。

1.3.6.2 納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)有傷接種冬棗的防治效果測(cè)定

首先對(duì)冬棗進(jìn)行預(yù)處理，用清水浸泡2 min，流水沖洗2 min，晾干備用。用無(wú)菌接種環(huán)在赤道位置打小孔直徑為2 mm（盡量減小果實(shí)創(chuàng)傷），注入濃度為1×105spores/mL的鏈格孢菌懸液10 μL。待菌液吸收后將基礎(chǔ)膜、納米Cu/多糖復(fù)合膜緊貼于果實(shí)表面進(jìn)行包裹，以覆蓋膜的為實(shí)驗(yàn)組，無(wú)膜處理的為對(duì)照組（感染無(wú)處理組），只進(jìn)行微小打孔的為空白組（自然組）。每種防治方式處理30 個(gè)果實(shí)，并設(shè)置3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。將冬棗置于在室溫下、相對(duì)濕度85%的泡沫箱中，避光存放，每天觀察記錄發(fā)病情況、測(cè)量病斑直徑，并根據(jù)式（4）、（5）計(jì)算發(fā)病率及防治效果：

1.3.7 納米Cu/多糖復(fù)合膜中Cu2+向果實(shí)遷移量的測(cè)定

1.3.7.1 Cu系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確移取1000 μg/mL Cu標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的HNO3溶液定容至100 mL容量瓶中，制得Cu標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（50 μg/mL）。分別移取一定量的Cu標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中，用5% HNO3溶液定容得到Cu系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.7.2 樣品處理方法

使用ICP-MS儀評(píng)估食品復(fù)合膜中Cu2+的遷移量[24]，用來(lái)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。取1.3.6.2節(jié)中貯藏期間（5 d和10 d）冬棗果實(shí)，將揭膜后不清洗的和揭膜后經(jīng)3 min流水清洗過(guò)的第5、10天冬棗設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組，共4 組，感染無(wú)處理組為空白對(duì)照組。對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行烘干粉碎，準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品至50 mL消解容器中，加入5%硝酸5 mL、雙氧水1 mL，放入石墨加熱板150 ℃消解90 min，中途不間斷加上述酸至樣品消解完全，趕酸，冷卻后過(guò)濾，定容至10 mL容量瓶中，同法做3 次平行，上機(jī)測(cè)試。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 納米Cu/多糖復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)分析

用FE-SEM對(duì)納米Cu及納米Cu/多糖復(fù)合膜的形貌進(jìn)行表征。如圖1A所示，合成的納米Cu粒子為規(guī)則的球形，大小均一，粒徑約44 nm。從圖1B可以看出，基礎(chǔ)膜表面光滑緊致、連續(xù)無(wú)孔隙，說(shuō)明明膠與海藻酸鈉結(jié)合良好。圖1C為0.25 g/L質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復(fù)合膜，顯示復(fù)合膜的表面相比基礎(chǔ)膜稍有粗糙，而納米Cu粒子在膜中均勻而不連續(xù)地分散，與多糖膜液具有良好相容性，略微出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。圖1D中為高質(zhì)量濃度納米復(fù)合膜，團(tuán)聚程度顯著加重。說(shuō)明納米Cu在薄膜中團(tuán)聚現(xiàn)象會(huì)隨著質(zhì)量濃度遞增而加重。以上結(jié)果表明適量質(zhì)量濃度的納米Cu的加入不會(huì)導(dǎo)致薄膜表面出現(xiàn)不均勻的裂紋，所以明膠/海藻酸膜可作為納米Cu粒子的優(yōu)良載體。

圖1 納米Cu/多糖復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of nano-Cu/polysaccharide composite films

2.2 納米Cu/多糖復(fù)合膜紅外光譜與熱穩(wěn)定性分析

紅外光譜分析是研究膜物質(zhì)結(jié)構(gòu)的有效手段，通過(guò)觀測(cè)吸收峰的變化，可分析納米Cu與基礎(chǔ)膜分子間的相互作用。如圖2A所示，3042～3600 cm-1之間存在一個(gè)寬頻帶，這與自由—OH基團(tuán)的分子內(nèi)和分子間拉伸或與氫鍵有關(guān)。在2930 cm-1處的特征峰與葡萄糖環(huán)中甲基氫原子的C—H拉伸有關(guān)。在1630 cm-1處的峰是由水分子的—OH拉伸引起。在1540 cm-1處的峰是由羧基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起。在1185～1011 cm-1處的條帶歸因于C—O、C—C、O—H和C—O—C糖苷鍵的拉伸和彎曲。然而發(fā)現(xiàn)隨著納米Cu質(zhì)量濃度的增加，并沒(méi)有出現(xiàn)的新的峰，說(shuō)明納米Cu只是吸附在基礎(chǔ)膜液中，沒(méi)有化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變。但是在相同波長(zhǎng)下，摻有納米Cu的多糖復(fù)合膜吸收峰的強(qiáng)度增強(qiáng)，推測(cè)納米Cu的加入加強(qiáng)了明膠與海藻酸鈉之間的相互作用力，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)更加緊密，更具有韌性[25]。

圖2 不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復(fù)合膜的紅外光譜與TGA曲線Fig.2 FT-IR spectra and TGA curves of composite films with different concentrations of nano-Cu

在熱分解實(shí)驗(yàn)中，用TGA儀對(duì)復(fù)合膜熱穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。從膜的熱重曲線圖（圖2B）可以看出，在100 ℃的降解過(guò)程中，質(zhì)量損失是由于水分的蒸發(fā)造成的，由圖2C可知，基礎(chǔ)膜（0.00 g/L）與含納米Cu的復(fù)合膜在100 ℃內(nèi)發(fā)生水分蒸發(fā)，這與表1中含水量的測(cè)定結(jié)果相似，且不同質(zhì)量濃度薄膜之間存在略微差異。在100～300 ℃之間膜發(fā)生顯著熱分解，在0.00、0.10、0.25、0.50 g/L的膜熱分解最高峰溫度在165～182 ℃之間，0.75 g/L膜趨于182～227 ℃之間，而1.00 g/L膜的熱分解最高峰溫度在227 ℃，說(shuō)明納米Cu的加入使基礎(chǔ)膜熱分解向更高溫度轉(zhuǎn)移。推測(cè)納米Cu與基礎(chǔ)膜之間存在更高的鍵能，這與FT-IR分析結(jié)果一致。綜上所述，納米Cu的加入略微降低了基礎(chǔ)膜的熱分解行為，這對(duì)包裝材料的高溫滅菌具有重要意義。

表1 復(fù)合膜的厚度、WVP、吸濕性、含水量及機(jī)械性能Table 1 Thickness,water vapor permeability,hygroscopicity,moisture content and mechanical properties of composite films

2.3 膜的透光性分析

薄膜的透光性影響消費(fèi)者對(duì)食品的感官評(píng)價(jià)，使用DRS儀對(duì)不同水平的納米Cu/多糖膜的透光性進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示?；A(chǔ)膜具有較高的透明度，摻有納米Cu材料的復(fù)合膜呈現(xiàn)淡綠色，隨納米Cu含量的增加，膜的顏色逐漸加深，所以復(fù)合膜的透明度逐漸降低。圖3B為不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復(fù)合膜的透光率，基礎(chǔ)薄膜在可見(jiàn)光下透過(guò)率最高，0.75 g/L與1.00 g/L膜的透光性大體一致?？傮w隨著納米Cu添加量的增加，透光率呈降低狀態(tài)，這與復(fù)合膜的外觀形態(tài)表述一致。

圖3 不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復(fù)合膜的外觀（A）與透光率（B）Fig.3 Appearance (A) and transmittance (B) of composite films with different concentrations of nano-Cu

2.4 納米Cu/多糖復(fù)合膜的理化性能分析

薄膜的厚度直接影響膜的理化、光學(xué)性能，并對(duì)膜的TS、EB與WVP也有直接影響。如表1所示，基礎(chǔ)膜與復(fù)合膜厚度差異顯著（P＜0.05），而隨著納米Cu質(zhì)量濃度的增加，多糖復(fù)合膜厚度隨之增加，存在略微差異。

WVP是水通過(guò)可食用薄膜的質(zhì)量轉(zhuǎn)移機(jī)制。具有較低WVP的薄膜有助于減少或避免食物與外界環(huán)境之間的水分交換，防止食品變質(zhì)[26]。如表1所示，摻有納米Cu的多糖膜的WVP顯著低于基礎(chǔ)膜（P＜0.05），1.00 g/L的膜WVP最低（5.5394×10-5g·m/（m2·Pa·d））。推測(cè)納米Cu材料加入到多糖膜網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)中，減少了膜內(nèi)空間結(jié)構(gòu)的自由體積，增強(qiáng)了基質(zhì)中的分子間相互作用[27]。因此復(fù)合膜形成致密結(jié)構(gòu)，減少了水蒸氣的透過(guò)性。還有研究[28]發(fā)現(xiàn)，小分子基質(zhì)的摻入為水分子通過(guò)聚合物屏障創(chuàng)造復(fù)雜的途徑。所以納米Cu的加入顯著降低了基礎(chǔ)薄膜的WVP。

膜的吸濕性越大，其阻隔性越低[23]。復(fù)合膜的吸濕性結(jié)果見(jiàn)表1，基礎(chǔ)膜的吸濕性最大（（38.8211±0.8112）%），阻隔性能最差。而1.00 g/L 的納米C u/多糖復(fù)合膜的吸濕性最小（（28.2573±0.8163）%），與基礎(chǔ)膜相比降低了10.56%，表現(xiàn)出最好的阻隔性能。所以隨著納米Cu的添加量增加，膜的吸濕性逐漸降低，說(shuō)明納米Cu的加入顯著降低膜的吸濕性（P＜0.05）。已知納米Cu含量越高，復(fù)合膜的WVP越低，推測(cè)是由于納米Cu粒子占據(jù)多糖膜網(wǎng)絡(luò)空間孔隙結(jié)構(gòu)。由此可知，隨著納米材料的增加，含水量亦逐漸降低，這與表1描述一致。

食品包裝膜具有可拉伸特征，利于保持膜的完整性和機(jī)械強(qiáng)度，能夠承受食品加工、處理和儲(chǔ)存過(guò)程中的外部壓力[29]。利用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)復(fù)合膜進(jìn)行了薄膜機(jī)械性能的測(cè)定。如表1所示，0.50 g/L至1.00 g/L的膜TS遠(yuǎn)大于0.00、0.10 g/L和0.25 g/L膜。說(shuō)明納米Cu的加入顯著提高基礎(chǔ)膜的TS，降低EB。推測(cè)納米Cu填充多糖復(fù)合膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)基礎(chǔ)膜與納米Cu之間的界面相互作用，導(dǎo)致復(fù)合膜結(jié)構(gòu)緊密，增強(qiáng)了TS，機(jī)械性能優(yōu)異。

2.5 納米Cu/多糖復(fù)合膜的抗真菌活性

2.5.1 納米Cu/多糖復(fù)合膜液對(duì)真菌的抑制活性

抑菌食品包裝膜的研究近年來(lái)成為廣泛重點(diǎn)關(guān)注問(wèn)題，而抗真菌食品包裝膜一方面可作為防止真菌入侵的堅(jiān)固物理屏障，另一方面也是抗真菌的抑菌劑，延長(zhǎng)果蔬保質(zhì)期。本實(shí)驗(yàn)使用瓊脂平板擴(kuò)散法探究納米Cu/多糖膜液對(duì)不同真菌的抑菌活性。探究不同質(zhì)量濃度（0.00、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L）納米Cu/多糖復(fù)合膜材料在PDA板上對(duì)鏈格孢菌、鐮刀孢菌及灰霉的菌絲體的抑制作用，結(jié)果如圖4A所示。不同質(zhì)量濃度的納米Cu/多糖復(fù)合膜材料對(duì)不同真菌表現(xiàn)出不同程度的抗真菌活性，如圖4B所示，納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)鏈格孢菌、鐮刀孢菌及灰霉的抑制率與納米Cu質(zhì)量濃度呈正比，在0.10 g/L時(shí)對(duì)鐮刀孢菌（10.93%）與灰霉（12.90%）的抑制效果相似，對(duì)鏈格孢菌的抑制效果最顯著，可達(dá)32.69%。在0.25、0.50 g/L時(shí)復(fù)合膜液對(duì)鐮刀孢菌的抑制性能較低，而在0.75 g/L時(shí)抑菌活性上升。納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)鏈格孢菌、鐮刀孢菌及灰霉最高抑菌率分別為87.80%、77.73%、81.96%，因此抑制效果為鏈格孢菌＞灰霉＞鐮刀孢菌。

圖4 不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)真菌抑制效果Fig.4 Antifungal effects of composite films with different concentrations of nano-Cu

2.5.2 納米Cu/多糖復(fù)合膜液對(duì)真菌生物量的影響

基于不同質(zhì)量濃度的納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)不同真菌菌絲生長(zhǎng)抑制的比較并不意味著最佳的抗真菌能力，因此要考慮生物量等綜合因素。圖5顯示在未加入納米材料的膜液（0.00 g/L）中，鏈格孢菌的生長(zhǎng)繁殖能力遠(yuǎn)大于鐮刀孢菌及灰霉，而在相同濃度納米材料下，對(duì)鐮刀孢菌和灰霉的抑制效果更佳，這與表2所示抑菌效果相似。在相同真菌條件下，質(zhì)量濃度與真菌生物量呈反比，說(shuō)明質(zhì)量濃度越高，對(duì)真菌菌絲體、孢子以及真菌毒素的抑制作用越強(qiáng)。并且納米Cu質(zhì)量濃度為0.25 g/L時(shí)，對(duì)鏈格孢菌抑制率為55.80%，可稱為該真菌的半抑制濃度。但是據(jù)圖4可知，在相同質(zhì)量濃度的納米材料下，鏈格孢菌的菌絲菌落直徑遠(yuǎn)小于鐮刀孢菌、灰霉，而在圖5中顯示鏈格孢菌的生物量遠(yuǎn)大于鐮刀孢菌、灰霉。因此可推測(cè)納米Cu對(duì)不同真菌產(chǎn)孢量影響存在差異，對(duì)產(chǎn)孢量抑制效果為鐮刀孢菌＞灰霉＞鏈格孢菌。綜上結(jié)果，推測(cè)納米Cu具有破壞真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用[30]，對(duì)真菌生物量起著抑制生長(zhǎng)作用，根據(jù)表2可知，納米Cu對(duì)真菌生物量的抑制效率為鐮刀孢菌＞灰霉＞鏈格孢菌。

表2 納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)真菌生物量的影響Table 2 Effect of nano-Cu/polysaccharide composite films on fungal biomass

圖5 不同質(zhì)量濃度納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)真菌生物量作用效果Fig.5 Effects of composite films with different concentrations of nano-Cu on fungal biomass

2.6 納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)感染黑斑病冬棗的防治效果

冬棗的真菌感染防治在貯藏、運(yùn)輸和銷售過(guò)程中是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。因此，本研究以冬棗為代表性果實(shí)，檢測(cè)納米Cu/多糖復(fù)合膜的生物防治效果。使用0.25 g/L的納米復(fù)合膜進(jìn)行果實(shí)生物防治。圖6A為10 d貯藏期的膜處理有傷接種鏈格孢菌冬棗的防治效果圖，圖6B顯示，冬棗果實(shí)發(fā)病率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈上升趨勢(shì)，納米Cu/多糖復(fù)合膜組發(fā)病率顯著低于感染無(wú)處理組、基礎(chǔ)膜組（P＜0.05）。感染無(wú)處理組果實(shí)在第2天開(kāi)始發(fā)病，而基礎(chǔ)膜和復(fù)合膜處理的果實(shí)均在第4天開(kāi)始發(fā)病。第10天時(shí)感染無(wú)處理組發(fā)病率高達(dá)94.44%，而納米復(fù)合膜組僅為44.24%，發(fā)病率降低53.16%，兩者差異顯著（P＜0.05）。圖6C、D是貯藏期為10 d防治效果，納米復(fù)合膜組病斑直徑顯著低于基礎(chǔ)膜與感染無(wú)處理組（P＜0.05），對(duì)果實(shí)的防治效果最高達(dá)52.53%，說(shuō)明納米Cu/多糖復(fù)合膜能有效延遲感染真菌果實(shí)的發(fā)病時(shí)間并抑制發(fā)病速率及病斑直徑擴(kuò)展范圍，延長(zhǎng)感染黑斑病冬棗的保質(zhì)期。

圖6 納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)有傷接種冬棗防治效果Fig.6 Control effect of nano-Cu/polysaccharide composite films on black spot disease of winter jujube

2.7 納米Cu/多糖復(fù)合膜中Cu2+向果實(shí)的遷移分析

以0.25 g/L納米Cu/多糖復(fù)合膜為研究對(duì)象，當(dāng)復(fù)合膜與食品接觸時(shí)，Cu2+會(huì)從膜中向果實(shí)遷移，少量的Cu2+進(jìn)入果實(shí)表面或是內(nèi)部，可以抑制果實(shí)中致病菌繁殖，從而延長(zhǎng)果實(shí)保質(zhì)期。實(shí)驗(yàn)測(cè)得Cu標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝1177.71X+24.33，決定系數(shù)R2為0.9998，說(shuō)明該方法的線性相關(guān)性高，滿足樣品檢測(cè)要求。如圖7所示，冬棗在0 d時(shí)Cu含量為0.9581 mg/kg，在5 d未清洗時(shí)為1.2471 mg/kg，清洗后可去除0.0388 mg/kg，Cu2+遷移量為0.2890 mg/kg（0.0145 μg/mL）。在10 d未清洗時(shí)Cu含量為1.3321 mg/kg，清洗可去除0.0885 mg/kg，Cu2+遷移量為0.3740 mg/kg（0.0187 μg/mL）。發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間變化，復(fù)合膜中的Cu2+遷移量增加，并且5 d和10 d清洗后的果實(shí)中Cu含量差異較小，而對(duì)未清洗果實(shí)，10 d時(shí)的Cu含量顯著高于5 d（P＜0.05），說(shuō)明復(fù)合膜中的Cu2+僅存在于果皮表面，不會(huì)進(jìn)入果實(shí)內(nèi)部。姜紫薇[15]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度達(dá)到4.5 μg/mL時(shí)，對(duì)人體的肝細(xì)胞開(kāi)始具有損傷作用。而納米Cu/多糖復(fù)合膜在10 d時(shí)Cu2+遷移量（0.0187 μg/mL）遠(yuǎn)小于4.5 μg/mL，所以該納米Cu/多糖復(fù)合膜在果蔬包裝領(lǐng)域應(yīng)用存在危害健康風(fēng)險(xiǎn)較低，可放心使用。

圖7 納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)冬棗Cu含量的影響Fig.7 Migration of Cu2+ from nano-Cu/polysaccharide composite films to winter jujube

3 結(jié)論

本研究通過(guò)綠色合成納米Cu材料，與明膠/海藻酸鈉膜液共混制備納米Cu/多糖復(fù)合膜，測(cè)定合成的納米Cu為規(guī)則的球形，大小均一，粒徑約44 nm。并且納米Cu粒子的摻入影響膜的外觀形態(tài)，多糖膜可作為納米Cu的優(yōu)良載體。綠色合成納米Cu的摻入有效降低多糖膜的WVP、吸濕性及含水量，使復(fù)合膜具有良好的機(jī)械性能。進(jìn)而探究了納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)鏈格孢菌、鐮刀孢菌、灰霉的最高抗真菌活性分別為87.80%、77.73%、81.96%。使用0.25 g/L的納米Cu/多糖復(fù)合膜對(duì)感染黑斑病的冬棗進(jìn)行10 d的防治，發(fā)病率有效降低53.16%，防治效果達(dá)52.53%，在10 d時(shí)Cu2+遷移量為0.0187 μg/mL。根據(jù)以上結(jié)果，納米Cu摻入明膠/海藻酸鈉多糖膜可以有效降低感染真菌果實(shí)的腐爛率，延長(zhǎng)冬棗果實(shí)的保質(zhì)期，可作為一種新型的食品專用抗真菌包裝材料。