蔡玉蘭 陽琰 岳瑜 牟芝群 姚楊 胡皓銘 吳旻 鄧嘉杰

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內分泌與代謝病科,貴州 遵義 563003)

糖尿病足(DF)是糖尿病患者常見的嚴重并發(fā)癥之一,指由于患者下肢不同程度神經和血管病變導致的足部潰瘍、感染和(或)深層組織破壞,DF發(fā)病率及相關死亡率逐年升高,我國DF發(fā)病率高達15%,年截肢率高達22%,年死亡率高達11%〔1,2〕。準確識別DF創(chuàng)面中菌群組成,及時使用針對性的抗生素治療,是創(chuàng)面愈合過程中最重要、最關鍵的一步。目前經驗性抗生素的選用基于臨床醫(yī)生對DF創(chuàng)面嚴重程度的判斷和指南中對廣譜抗生素的推薦,結合患者對當前抗生素的治療效果,綜合決定抗感染治療方案〔3〕。然而,DF中多重耐藥菌的高發(fā)生率與廣譜抗生素的不恰當使用密切相關〔4〕。越來越多的證據表明,基于下一代測序的菌群分析具有全面、快速的優(yōu)勢,可以為DF的診治提供可靠依據。目前尚未有研究基于下一代測序全面分析DF創(chuàng)面菌群組成,本文基于16S rRNA測序分析不同嚴重程度DF創(chuàng)面菌群的組成。

1 對象與方法

1.1研究對象 納入2020年7月至2021年7月遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院治療的DF患者80例,根據患者創(chuàng)面感染嚴重程度、體征及檢驗指標將患者分為足部血流、受影響范圍、嚴重程度、感染、感覺能力(PEDIS)1、2、3、4級組,每組20例。各組性別組成、年齡、體質量指數、空腹血糖、血紅蛋白及白蛋白等資料無明顯差異(P>0.05)。隨著患者的DF病程增加,其PEDIS分級也逐漸增加。且PEDIS分級越高的DF患者,血糖控制不佳,糖化血紅蛋白逐漸增加有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。血白細胞、血中性粒細胞、降鈣素原、C-反應蛋白、紅細胞沉降率及血肌酐均隨著PEDIS分級的增加而逐漸升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組人口統(tǒng)計學和實驗室資料(n=20)

1.2納入與排除標準 納入標準：①符合2019 國際糖尿病足工作組指南中對糖尿病足的診斷并符合PEDIS分級。PEDIS 1級(未感染)：創(chuàng)面無炎癥表現或膿性分泌物;2級(輕度感染)：局部感染,僅累及皮膚和皮下組織,未累及深層組織,潰瘍周圍皮膚炎癥范圍≤2 cm2;3級：具備輕度感染的表現,同時感染累及皮膚和皮下深層組織(如：肌腱、肌肉、關節(jié)和骨),潰瘍周圍皮膚炎癥范圍>2 cm2,不存在感染的全身中毒表現;4級(重度感染)：具備中度感染的表現,并有全身炎癥反應綜合征(SIRS)≥2項的以下表現：體溫>38 ℃或<36 ℃;心率>90次/min;呼吸頻率>20次/min或動脈二氧化碳分壓<32 mmHg;白細胞計數>2×109/L或<4×109/L,或不成熟形式≥10%〔5,6〕;②未合并其他皮膚病變;③未合并其他可能影響創(chuàng)面愈合的疾?。喝缱陨砻庖咝约膊〉?④患者及其家屬同意參與本項研究。排除標準：①合并嚴重心、腦、腎疾病;②雖存在足部病變,但未明確診斷糖尿病;③既往有服用免疫抑制劑或激素等影響自身免疫及創(chuàng)面愈合的藥物。

1.3取樣 取適量生理鹽水沖洗創(chuàng)面,清除創(chuàng)面表面壞死組織后取深部組織標本,立即保存于-80 ℃,用于后續(xù)樣本DNA的提取。標本命名為DF01、DF02……DF80,其中,DF01～20為PEDIS 1級組,DF21～40為PEDIS 2級組,DF41～60為PEDIS 3級組,DF61～80為PEDIS 4級組。

1.416S rRNA測序 根據組織DNA提取試劑盒的操作步驟(EchoLUTION),在同一時間提取保存在-80 ℃創(chuàng)面組織的DNA,經過質控后PCR擴增細菌16S rRNA基因的V3、V4區(qū)(引物序列：V3區(qū)：355F：5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′和534R：5′-ATTACGGCGGCTGCTGG-3′;V4區(qū)：515F：5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R：5′-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3′)。擴增后的產物經過質量檢測及純化后構建測序文庫,上機測序(測序平臺為：Illumina;測序方案為：PE250)。

1.5下機數據處理 測序獲得的下機數據經過拆分、組合、質控、聚類后與Greengenes數據庫比對進行物種注釋。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計分析,符合正態(tài)分布的計量資料、獨立樣品t檢驗、獨立樣品曼-惠特尼U檢驗、Pearsonχ2檢驗。

2 結 果

2.1菌群α多樣性分析 反映菌群物種豐富度的Chao1(P=0.518)和ACE指數(P=0.621)在PEDIS 1～4級中無顯著差異,而反映物種多樣性的Shannon和Simpson指數在4組中有明顯差異,呈逐漸降低趨勢(均P<0.001),見圖1。

圖1 菌群的α多樣性分析

2.2優(yōu)勢菌門及優(yōu)勢菌屬分析 隨著DF患者PEDIS分級的增加,創(chuàng)面菌群中厚壁菌門及放線菌門的豐度逐漸降低,而擬桿菌門的豐度逐漸增加,在PEDIS 4級創(chuàng)面中豐度最高。隨著PEDIS分級的增加,創(chuàng)面中普氏菌屬、厭氧球菌屬、擬桿菌屬、戈爾德菌屬的豐度逐漸增加,鏈球菌屬、葡萄球菌屬的豐度逐漸降低(P<0.05),見圖2。

圖2 各組優(yōu)勢菌門、菌屬堆疊圖

2.3各組Marker菌群分析 基于LEfSe分析尋找各組Marker菌群,結果顯示,PEDIS 1～4級組的Marker菌門分別是厚壁菌門、厚壁菌門、變形菌門及擬桿菌門;PEDIS 1～4級組的Marker菌屬分別是鏈球菌屬、厭氧球菌屬/葡萄球菌屬、克雷伯菌屬及普氏菌屬(P<0.05),見圖3。

圖3 各組Marker菌門及菌屬分析

3 討 論

近年來,糖尿病患病率逐年升高,2015～2017年我國第8次全國性糖尿病流行病學調查結果顯示,我國糖尿病患病率已高達11.2%,中國內地的糖尿病患者預計達1.298億(2020年中國2型糖尿病防治指南)〔7〕。糖尿病患病人數逐年升高,多種糖尿病相關并發(fā)癥的發(fā)生率也隨之上升,其中,對患者生活質量影響最大的DF的患病率顯著上升。2016年,糖尿病相關下肢并發(fā)癥的患者人數達到全球人口總數的1.8%(1.31億),DF不僅是常見需要住院治療的糖尿病并發(fā)癥,也是糖尿病患者下肢截肢的最常見誘因,高達28%的DF患者發(fā)生不同程度的下肢截肢,全世界約每20 s就有1例患者因為DF失去下肢。據統(tǒng)計,因DF進行大截肢或小截肢的患者,術后5年死亡率接近40%〔8〕。DF發(fā)病率高、預后差,不僅降低了患者的生活質量,還帶來了巨大的經濟負擔,對醫(yī)療保健體系挑戰(zhàn)巨大〔9〕。

感染是導致DF創(chuàng)面加重,影響其創(chuàng)面愈合的重要因素,目前的治療通?；谂R床醫(yī)生對患者創(chuàng)面嚴重程度的判斷而經驗性選用抗生素?；谂囵B(yǎng)法的研究結果提示,DF創(chuàng)面中最常見的革蘭陽性(G+)球菌是金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、無乳鏈球菌;最常見的革蘭陰性(G-)桿菌是大腸埃希菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌〔10〕?；赪agner分級的DF創(chuàng)面菌群培養(yǎng)結果顯示,Wagner 2級創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌占52.63%,大腸埃希菌占25.00%。Wagner 3級創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌占82.61%,大腸埃希菌占30.00%。Wagner 4級創(chuàng)面中金黃色葡萄球菌占66.67%,大腸埃希菌占25.00%〔11〕。隨著DF創(chuàng)面進展,PEDIS分級增加,創(chuàng)面中G+菌的豐度逐漸降低,G-菌的豐度逐漸增加,且好氧菌逐漸轉變?yōu)閰捬蹙??？梢钥闯?培養(yǎng)法雖然仍然是在臨床上占主導地位的微生物檢測方法,但受限于培養(yǎng)條件及取樣方法等,其在培養(yǎng)厭氧菌方面的有效性仍具有爭議〔12〕。且隨著DF進展,創(chuàng)面越來越深,感染厭氧菌的可能性會大比例升高,淺層好氧菌消耗掉氧氣也給深層的厭氧菌生長創(chuàng)造了條件〔13〕。與本研究獲得的結果相符,最常見的厭氧菌是普氏菌屬及厭氧球菌屬。

本研究利用16S rRNA測序全面分析了DF創(chuàng)面進展過程中的創(chuàng)面菌群組成,更全面地闡述了不同PEDIS分級創(chuàng)面中的菌群差異。但目前高通量測序技術分析感染組織標本中菌群組成的方法還未納入臨床常規(guī)操作流程,尚不能直接指導臨床治療。此外,涉及DF創(chuàng)面菌群毒力因子和抗生素抗性及創(chuàng)面菌群之間相互作用的研究還有待完善。隨著研究的深入,高通量測序技術將來在臨床上的應用會越來越多,有望替代傳統(tǒng)培養(yǎng)法成為臨床一線檢測方法。