劉芳 吳茜

(武漢市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北 武漢 430070)

腦血管疾病是一個重大的公共衛(wèi)生問題。一方面,缺血性腦卒中引起的神經(jīng)受損會引起多種神經(jīng)疾病;另一方面,在缺血性腦卒中的急性期和恢復期,患者會出現(xiàn)免疫抑制,而這會引起全身性的感染,極大的影響患者預后〔1,2〕。雞血藤是草本藥密花豆的干燥藤莖,研究已經(jīng)顯示雞血藤提取物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、鎮(zhèn)靜等功效,研究表明雞血藤也具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的功能〔3,4〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)是一種損傷相關通路,HMGB1和RAGE可通過多種通路并最終介導炎癥反應,從而誘導缺血性腦卒中〔5〕。水通道蛋白(AQP)-4主要存在于腦室周圍區(qū)域,腦卒中后AQP-4被上調(diào)并參與腦水腫的發(fā)生〔6〕。以生長相關蛋白(GAP)-43為代表的磷酸蛋白質(zhì),主要存在于神經(jīng)細胞膜,不僅具有高度的特異性,還能一定程度上參與神經(jīng)突觸連接的可塑性和重建及再生及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控,抑制GAP-43可緩解缺血性腦卒中〔7〕。本研究分析雞血藤提取物改善缺血性腦卒中大鼠免疫抑制的作用及對HMGB1/RAGE信號通路和AQP-4和GAP-43表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料和器材 雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠(體質(zhì)量270～290 g,周齡8～10 w,北京維通利華動物公司),ECLIPSE Ni光學顯微鏡(美國Nikon公司),SAR830/AP呼吸機(美國CWE 公司),流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。蘇木素-伊紅(HE)染色、末端脫氧核苷酸內(nèi)切末端標記(TUNEL)凋亡試劑盒(美國羅氏公司),大鼠CD3+、CD4+和CD8+表型抗體試劑(美國Becton Dickinson公司),Trizol試劑(Aidlab公司),實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒(深圳博泰爾生物技術LTD),RNAspin Mini試劑盒(上海創(chuàng)賽科技LTD),兔抗人磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(pERK)1/2單抗,兔抗人ERK1/2單抗,羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標記IgG二抗購自美國cell signaling公司,電化學發(fā)光(ECL)顯色試劑盒(浙江聯(lián)碩生物科技LTD),聚偏二氟乙烯膜(上海鑫華城塑化LTD)等。

1.2大鼠建模、分組和干預 取50只大鼠參照文獻〔8〕的方法建立缺血性腦卒中模型〔8〕,具體方法為：首先通過腹腔注射2 ml/kg戊巴比妥將大鼠麻醉,進而將大鼠以仰臥的方式將其固定在試驗臺上。剔除大鼠頸部毛發(fā),切開右側頸部皮膚,使右側頸總動脈暴露,游離右側頸總動脈和分差,在頸總動脈分叉處插入栓線(4-0單股尼龍線),栓線頭距頸總動脈分叉處約18 mm,建立缺血性腦卒中模型成功。在大鼠缺血2 h后,需拔出動脈栓線且對大鼠皮膚進行縫合,進行抗生素的注射以預防因感染出現(xiàn)的實驗誤差。在建模成功標準方面,以建模2 h后大鼠Longa神經(jīng)功能評分為標準。在本次實驗中建模成功率在90%(45/50)。采用隨機數(shù)字表法將45只建模成功的大鼠隨機分組：模型組、雞血藤1.5組、雞血藤3.0組,各15只。另取15只健康大鼠作為對照組,對其僅暴露頸動脈但不結扎。根據(jù)參考文獻〔4〕,雞血藤粉末過2號篩后加入30倍(V/V)的80%的乙醇回旋蒸餾提取,將提取液合并后蒸發(fā)掉乙醇,用去離子水溶解配制為1 g/ml的母液。大鼠通過雞血藤提取物灌胃干預,劑量分別為1.5、3.0 g/kg,連續(xù)2 w,對照組通過生理鹽水灌胃作為對照。

1.3改良大鼠神經(jīng)功能評分(mNSS)評價 以mNSS系統(tǒng)〔9〕作為評判大鼠神經(jīng)功能缺損情況的標準,且從感覺、行走、平衡測試、提尾反射、反射缺失及反常運動6個方面,總評分0～18分,0分表示無神經(jīng)功能損害,評分越高則在損害程度方面越嚴重,且在此過程中由1位研究者進行mNSS。

1.4HE染色 大鼠安樂死后收集腦組織,通過使用HE染色的方法,對其腦水腫邊緣組織的病理變化進行檢測。首先將腦組織樣品通過甲醛溶液進行固定,再進行流水沖洗后使用不同濃度的乙醇進行脫水處理,進而將樣品組織浸入蠟后切成小塊。進一步的將其脫蠟后進行HE染色。且將細胞核使用蘇木素,細胞質(zhì)使用伊紅分別進行染色1～2 min,將細胞進行切片脫水處理后通過顯微鏡觀察。

1.5TUNEL染色 首先使用二甲苯對切片的腦組織重復脫蠟處理2次,每次不少于10 min,進而使用乙醇法進行脫水處理,并在一定溫度條件下對其使用反應溶液處理,加入鏈霉親和素-HRP后進行孵育及脫水脫色等操作。通過光學顯微鏡對細胞凋亡情況進行觀察,同時計算細胞凋亡指數(shù)。

1.6RT-qPCR 使用RNeasy Mini試劑盒以Trizol法對腦組織過總RNA進行提取,檢測RNA的完整性和濃度后,逆轉錄cDNA,同時,反應條件保持在37 ℃ 15 min及98 ℃ 5 min。進而使用BestarqPCR預混液行PCR擴增,反應條件為95 ℃ 60 s,94 ℃ 30 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 60 s;72 ℃下延伸4 min,重復上述步驟40個循環(huán)左右。通過Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行qPCR分析,同時將GAPDH內(nèi)部參照,分別對AQP-4、RAGE、HMGB1、GAP-43 mRNA相對表達水平進行計算。

1.7Western印跡檢測RAGE等蛋白 取各組腦組織,快速將其置于預冷的RIPA蛋白裂解中進行腦組織裂解后,60 s后進行離心,4 ℃,12 000 r/min離心15 min,獲取并收集總蛋白,檢測蛋白定量后置于-80 ℃冰箱中冰凍保存。取蛋白質(zhì)通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,轉移至硝酸纖維素膜上,在一定環(huán)境下將其浸入脫脂牛奶進行封閉處理,進而加入兔抗鼠一抗體、二抗在一定溫度條件下進行孵育,同時化學發(fā)光試劑處理。將GAPDH用于本次研究所使用的內(nèi)參,通過Quantum One軟件分析灰度對AQP-4、RAGE、HMGB1、GAP-43蛋白表達量進行計算。

1.8流式細胞術 大鼠摘眼球取外周血,使用密度梯度離心將浸潤的淋巴細胞進行局部分離,首先將其制備獲取單個淋巴細胞懸浮液并使用PBS對樣品細胞進行固定處理,30 min左右使用緩沖液重復清洗2次后收集細胞。將細胞加入通透緩沖液中避光孵育30 min后緩沖液清洗。在室溫下孵育細胞和小鼠CD3+、CD4+和CD8+表型抗體試劑及對照抗體30 min后用緩沖液洗掉抗體,用緩沖液重懸細胞,再用流式細胞儀檢測CD3+、CD4+和CD8+淋巴細胞亞群的百分比。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1雞血藤對缺血性腦卒中大鼠mNSS的影響 4組mNSS差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組〔(0.00±0.00)分〕比較,模型組mNSS〔(9.78±1.36)分〕顯著升高(P<0.05);與模型組比較,雞血藤1.5組mNSS〔(7.12±0.95)分〕顯著降低(P<0.05);與雞血藤1.5組比較,雞血藤3.0組mNSS〔(4.16±0.92)分〕顯著降低(P<0.05)。

2.2雞血藤對缺血性腦卒中大鼠病理學改變的影響 對照組神經(jīng)元分布均勻,細胞核結構清晰。模型組細胞核染色變深并且出現(xiàn)間質(zhì)性水腫。雞血藤1.5組神經(jīng)元損傷和水腫情況輕于模型組,并且雞血藤3.0組腦組織損傷情況較雞血藤1.5組輕,見圖1。

圖1 各組腦組織(×400)

2.3雞血藤對缺血性腦卒中大鼠腦組織細胞凋亡的影響 4組腦組織細胞凋亡率有統(tǒng)計學意義(F=38.256,P<0.001)。模型組細胞凋亡率〔(36.27±3.41)%〕顯著高于對照組〔(8.03±1.10)%,P<0.05〕,雞血藤1.5組細胞凋亡率〔(23.09±1.96)%〕較模型組顯著降低(P<0.05),雞血藤3.0組細胞凋亡率〔(12.35±0.82)%〕顯著低于雞血藤1.5組(P<0.05),見圖1。

2.4雞血藤對缺血性腦卒中大鼠腦組織中HMGB1/RAGE通路的影響 4組腦組織中HMGB1/RAGE通路水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組、雞血藤1.5、3.0組HMGB1、RAGE mRNA和蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05);且雞血藤1.5、3.0組HMGB1、RAGE mRNA和蛋白表達較模型組顯著降低(P<0.05);與雞血藤1.5組比較,雞血藤3.0組HMGB1和RAGE mRNA及蛋白表達顯著降低(P<0.05),見圖2、表1。

表1 各組腦組織中HMGB1/RAGE通路及AQP-4、GAP-43 mRNA及蛋白表達

圖2 Western印跡檢測各組HMGB1和RAGE蛋白表達

2.5雞血藤對缺血性腦卒中大鼠腦組織中AQP-4和GAP-43表達的影響 模型組、雞血藤1.5、3.0組AQP-4、GAP-43 mRNA及蛋白水平顯著高于對照組;且雞血藤1.5、3.0組上述指標明顯低于模型組(P<0.05),雞血藤3.0組上述指標顯著低于雞血藤1.5組(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組AQP-4和GAP-43蛋白表達

2.6雞血藤對缺血性腦卒中大鼠T淋巴細胞亞群的影響 模型組、雞血藤1.5、3.0組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值顯著低于對照組(P<0.05),模型組CD8+明顯低于對照組(P<0.05);雞血藤1.5、3.0組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值均顯著高于模型組(P<0.05),雞血藤3.0組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值均顯著高于雞血藤1.5組(P<0.05),見表2。

表2 雞血藤對缺血性腦卒中大鼠T淋巴細胞亞群的影響

3 討 論

缺血性腦卒中會導致血液灌注障礙,誘發(fā)氧化應激反應和自由基清除變慢,從而誘發(fā)腦水腫,并導致炎性反應和神經(jīng)元凋亡。研究顯示腦損傷也會引起機體免疫力的降低,特別是嚴重神經(jīng)損傷或者昏迷的患者,其腦損傷后會出現(xiàn)交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活,從而引起免疫抑制〔10〕。免疫抑制不但會導致機體中炎性反應的難以控制,并會影響預后。

近年來中藥在缺血性腦卒中和免疫調(diào)節(jié)中的作用受到廣泛關注。雞血藤是一種傳統(tǒng)中藥,味苦、甘,性溫,具有活血補血,舒筋活絡等功效,報道顯示,雞血藤提取物具有廣泛的生物活性,包括鎮(zhèn)靜、消炎、免疫調(diào)節(jié)、凋亡調(diào)節(jié)〔11〕。研究顯示,雞血藤提取物不僅能夠改善局灶性缺血現(xiàn)象,還能夠一定程度上對再灌注損傷的神經(jīng)元起到一定保護作用〔12〕。一項中藥數(shù)據(jù)挖掘分析結果顯示雞血藤中的活性物質(zhì)能夠治療缺血性腦卒中〔13〕。結合文獻報道和本研究結果,說明雞血藤能夠保護缺血性腦卒中引起的神經(jīng)元損傷和凋亡。

此外,本研究結果還顯示,雞血藤能夠顯著抑制HMGB1/RAGE通路及AQP-4、GAP-43的轉錄和翻譯水平。HMGB1是一種核染色質(zhì)蛋白,在所有細胞中普遍表達,HMGB1還參與信號通路的轉導并誘發(fā)炎性反應〔14〕。HMGB1可以通過RAGE將信號傳遞至細胞核并誘導炎性細胞因子的表達,從而引起神經(jīng)元損傷,而抑制HMGB1/RAGE通路可緩解腦損傷相關的神經(jīng)元凋亡〔15〕。AQP-4是HMGB1/RAGE通路下游的驗證標志蛋白,也是腦組織中炎性反應的重要標志蛋白,研究顯示,急性缺血性腦卒中患者的AQP-4與氧化應激誘導的血腦屏障破壞和神經(jīng)元損傷有關,AQP-4水平可反映腦神經(jīng)損傷程度〔16〕。而GAP-43蛋白不僅在神經(jīng)細胞生長、增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用,同時還參與神經(jīng)興奮性和神經(jīng)元突觸形成的過程〔17〕,在缺血性腦卒中后腦脊液中,GAP-43濃度的瞬時增加可反映神經(jīng)元損傷程度,幫助在蛋白水平上評估雞血藤對腦卒中大鼠神經(jīng)的保護作用〔18〕。本研究結果顯示,雞血藤提取物能夠顯著抑制HMGB1/RAGE通路,并降低AQP-4、GAP-43轉錄和翻譯水平。本研究結果表明,在腦卒中模型中,HMGB1/RAGE通路被激活并誘導炎性反應,導致AQP-4蛋白及炎性細胞因子的表達,引起神經(jīng)元凋亡和GAP-43蛋白降低,而雞血藤提取物則可在mRNA和蛋白水平上抑制HMGB1/RAGE通路,進而抑制AQP-4轉錄和蛋白表達,抑制炎性反應,促進GAP-43表達緩解神經(jīng)元損傷。

在缺血性腦卒中急性期,某種情況下會造成先天免疫細胞進入到患者大腦及腦膜,從而造成一定程度上的缺血性損傷,但也可能具有保護作用。同時,受損腦細胞釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的危險信號會激活全身免疫,繼而導致嚴重的免疫抑制,從而導致危及生命的感染〔19〕。而在疾病初期階段,由于抗原呈遞給大腦造成了一定的適應性免疫抑制反應,這可能是神經(jīng)精神后遺癥的基礎,也是腦卒中后神經(jīng)相關并發(fā)癥發(fā)生的重要原因〔20〕。作為機體免疫至關重要的組成部分,T淋巴細胞與腦卒中患者的康復和肺部感染的發(fā)生有關。研究顯示,腦卒中患者較對照組CD3+和CD4+/CD8+水平均明顯降低,而且其是患者發(fā)生肺部感染的獨立危險因素〔21〕。臨床研究結果也顯示,CD3+和CD4+/CD8+比值的提高與腦血管疾病患者療效的提高有關〔22〕。黃詩琦等〔23〕研究結果顯示,雞血藤中的活性物質(zhì)能夠提高小鼠免疫力,從而治療大腸桿菌引起的敗血癥。本研究結果顯示,雞血藤提取物不但能夠保護缺血性腦卒中引起的神經(jīng)元損傷和凋亡,還能夠解除免疫抑制。

但是本研究也有一定的局限性,首先,雞血藤對腦卒中的緩解作用仍需要臨床研究證實,并且其通過HMGB1/RAGE通路保護腦神經(jīng)的機制仍需要抑制劑來驗證,但是由于HMGB1/RAGE通路激活劑的缺乏,這部分實驗可能在未來完成。此外,雞血藤解除免疫抑制的作用是否與其神經(jīng)保護作用有關仍需要進一步探究,雞血藤提取物中何種物質(zhì)發(fā)揮保護作用仍不清楚。