楊振 賈陌楊 魏傳奎 劉建剛

(山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1普外科,山東 泰安 271000;2消化科)

結(jié)腸癌是胃腸道惡性腫瘤之一,是全球第三大常見癌癥〔1〕。近年來,人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化,結(jié)腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢,且發(fā)病率與死亡率均位列惡性腫瘤中的前五〔2〕。結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確,遺傳、吸煙、飲酒、年齡、肥胖等均為引發(fā)結(jié)腸癌的危險因素〔3〕。結(jié)腸癌臨床癥狀較為隱匿,確診時多已發(fā)展至晚期,轉(zhuǎn)移率與復(fù)發(fā)率較早期明顯升高,對患者預(yù)后和遠(yuǎn)期生存皆不利〔4〕。因此,探索結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵調(diào)控分子、揭示其遷移的具體機(jī)制,對結(jié)腸癌的防治具有重要的理論價值。miRNA具有對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等過程的調(diào)控作用,多項研究表明,miR-182-5p在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌等癌癥中呈高表達(dá),對癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為起促進(jìn)作用〔5～7〕。特定富含AT堿基DNA序列結(jié)合蛋白(SATB)2是一種核基質(zhì)結(jié)合蛋白,在結(jié)腸癌組織中呈低表達(dá),Chen等〔8〕研究表明,低水平SATB2與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,Kinget等〔9〕發(fā)現(xiàn),miR-182-5p對SATB2具有靶向調(diào)控作用。本研究通過檢測miR-182-5p、SATB2與SATB2/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nox)4通路相關(guān)蛋白在結(jié)腸癌組織與細(xì)胞中表達(dá),觀察細(xì)胞增殖、遷移能力的變化,并分析miR-182-5p與SATB2/nox4間的調(diào)節(jié)關(guān)系。

1 材料和方法

1.1組織樣本 收集山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2019年3～8月手術(shù)切除的43例結(jié)腸癌與癌旁正常結(jié)腸組織,組織均接受術(shù)后病理診斷鑒定〔10〕。其中男26例,女17例,年齡54～71〔平均(61.76±6.44)〕歲。TNM分期：Ⅰ期17例,Ⅱ期12例,Ⅲ期14例;分化程度：低分化12例,中分化24例,高分化7例;左半結(jié)腸癌23例,右半結(jié)腸癌20例。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均知情同意并自愿提供組織樣本。

1.2研究材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480(貨號CL-0223)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號11965092)、胎牛血清(貨號16140063)、Trizol試劑(貨號15596018)、mirVana miRNA分離試劑盒(貨號AM1561)購自美國Thermo Fisher公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(貨號RR820A)購自大連寶生生物科技有限公司;All-in-One miRNA實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒(貨號QP016/AOMD-Q060)購自亞太恒信生物科技(北京)有限公司;慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定、包裝與滴度測定由廣州輝駿生物科技股份有限公司完成;PCR引物與內(nèi)參購自鏡像綺點(diǎn)(上海)細(xì)胞技術(shù)有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解液(貨號P0013G)、噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞檢測試劑盒(貨號C0009S)、二喹啉甲酸(BCA)檢測試劑盒(貨號P0012)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔IgG抗體(貨號ab172730)、兔SATB2(貨號ab92446)、兔nox4(貨號ab133303)、兔E-鈣黏蛋白(E-cadherin,貨號ab40772)、兔波形蛋白(Vimentin,貨號ab137321)購自美國Abcam公司;SP法免疫組化試劑盒(貨號PH1698)購自福州飛凈生物科技有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。SW480分為對照組(不進(jìn)行處理)、NC-mimics組(轉(zhuǎn)染NC-mimics)、miR-182-5p-mimics組(轉(zhuǎn)染miR-182-5p-mimics)、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組(轉(zhuǎn)染miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC)、miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2組(轉(zhuǎn)染miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2)、NC-inhibitor組(轉(zhuǎn)染NC-inhibitor)、miR-182-5p-inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-182-5p-inhibitor)。按照分組進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染,48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.4雙熒光素酶報告基因檢測 使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScanHuman預(yù)測分析miR-182-5p和SATB2的結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建野生型(WT)和突變型(MUT)熒光質(zhì)粒：psiCheck2-SATB2-Luc、psiCheck2-SATB2-MUT-Luc,并與miR-182-5p模擬物共轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中,檢測熒光素酶活性。

1.5qRT-PCR檢測組織miR-182-5p、SATB2與細(xì)胞miR-182-5p、SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin水平 組織、細(xì)胞使用Trizol試劑、mirVana miRNA分離試劑盒提取組織、細(xì)胞總RNA、miRNAs。總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒配制20 μl PCR體系。miRNAs用All-in-One miRNA qRT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測。引物序列(5′-3′)為：miR-182-5p正向：ACGTGATGCTGATGCTGCG,反向：TAGCGTAGCTGTACTGTGC;U6正向：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT,反向：ACGCTTCA CGAATTTGCGTGTC;SATB2正向：TGTAGCTGTAG CTGTAGTGCAC,反向：GTAGCTGATCGTAGTGCTGTAT;nox4正向：TAGCTGATCGTGATGCTGTAGC,反向：CGGTATCGTTACTGTAGTCGTA;E-cadherin正向：TAGCTGTAGTCGTGATCGTAGT,反向：GTCATGCTGTAGTGCTGATGCG;Vimentin正向：CTAGCTGTAGCTGTAGTGCTGTC,反向：GCTGATGCTGTAGCTGTAGCTC;β-actin正向：ATGCATCTGCTGATGCGTACTG,反向：GCTGATGCTGTAGCTGTAGCTC。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算miR-182-5p、SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin的相對表達(dá)水平。

1.6染色質(zhì)免疫共沉淀 對照組細(xì)胞培養(yǎng)覆蓋率達(dá)到90%后,加入37%多聚甲醛,室溫交聯(lián)10 min后加入濃度為0.125 mol/L的甘氨酸終止交聯(lián)。吸出細(xì)胞培養(yǎng)基,加入預(yù)冷1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩遍,刮下細(xì)胞并于4 ℃、2 000 r/min條件下離心2 min。收集細(xì)胞沉淀,加入SDS裂解液后超聲破碎,收集上清液并分為IgG陰性對照組和SATB2組,加入protein A磁珠與相應(yīng)抗體后置于4 ℃過夜。洗滌沉淀復(fù)合物,設(shè)計miR-182-5p的ChIP引物為正向：5′-GAGTGTCCAGGGTTCGTCTG-3′,反向：5′-GGTACACTTCTTTGCCCCCA-3′,qRT-PCR分析洗滌后的DNA片段,用2-ΔΔCt法計算相對值。

1.7MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、NC-inhibitor組、miR-182-5p-inhibitor組細(xì)胞接種于96孔板上,接種密度5×103個/孔,每孔100 μl,培養(yǎng)24、48、72、96 h后每孔加入濃度為5 mg/ml的MTT試劑10 μl,37 ℃孵育4 h后除去上清液,每孔加入100 μl二甲基亞砜,酶標(biāo)儀570 nm測定吸光度(OD)值。重復(fù)3次。

1.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、NC-inhibitor組、miR-182-5p-inhibitor組細(xì)胞接種于6孔板中,接種密度1×106個/孔。待細(xì)胞鋪滿90%,用200 μl移液器槍頭作劃痕,清除脫落的細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。于劃痕后(0 h)、培養(yǎng)24 h后拍照,測量劃痕寬度,計算細(xì)胞遷移率。

1.9Western印跡檢測SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin表達(dá) 收集對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、NC-inhibitor組、miR-182-5p-inhibitor組細(xì)胞沉淀,經(jīng)裂解液充分裂解后于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min,保留上清液,BCA定量后制樣。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜,截取目的條帶浸于封閉液中,室溫封閉1 h。加入稀釋比例為1∶500的一抗孵育液,4 ℃環(huán)境下過夜。加入稀釋比例為1∶5 000的對應(yīng)二抗孵育液,室溫孵育2 h,洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL),避光反應(yīng)5 min,收集熒光圖像結(jié)果。

1.10體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn) 對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2組細(xì)胞制成5×107個/ml的單細(xì)胞懸液。裸鼠按照各組細(xì)胞名稱隨機(jī)分組,每組6只。原位接種細(xì)胞懸液,3 w后處死裸鼠,完整取出腫瘤,拍照稱重后置于10%甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋制成切片。

1.11免疫組化檢測腫瘤組織SATB2、nox4表達(dá)情況 采用免疫組化SP法檢測裸鼠腫瘤組織SATB2、nox4表達(dá)。按照試劑盒要求處理石蠟切片并進(jìn)行染色操作,光鏡下拍攝實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用ImageJ軟件分析圖像,計算SATB2、nox4相對表達(dá)量。

1.12統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-182-5p和SATB2在結(jié)腸癌中表達(dá) 結(jié)腸癌組織miR-182-5p相對表達(dá)量(1.47±0.08)明顯高于癌旁組織(1.00±0.05;t=32.716,P=0.000),結(jié)腸癌組織中SATB2相對表達(dá)量(0.20±0.04)明顯低于癌旁組織(0.49±0.07;t=24.608,P=0.000)。miR-182-5p與SATB2水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.655 2,P<0.000 1)。見圖1。

圖1 miR-182-5p與SATB2相關(guān)性

2.2miR-182-5p靶向調(diào)控SATB2表達(dá) miR-182-5p與SATB2存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。miR-182-5p能夠明顯降低野生型3′UTR的SATB2熒光素酶活性(P<0.05),對突變型3′UTR的SATB2熒光素酶活性沒有影響(P>0.05),說明miR-182-5p能夠直接靶向作用于SATB2。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示,過表達(dá)SATB2導(dǎo)致miR-182-5p與SATB2的結(jié)合能力明顯下降(P<0.05)。見表1、表2。

表1 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

表2 染色質(zhì)免疫共沉淀檢測

圖2 miR-182-5p靶向調(diào)控SATB2表達(dá)

2.3miR-182-5p增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移能力 MTT檢測結(jié)果顯示,對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組相比,miR-182-5p-mimics組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05),miR-182-5p-inhibitor組細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組細(xì)胞遷移率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組相比,miR-182-5p-mimics組細(xì)胞遷移率明顯升高(P<0.05),miR-182-5p-inhibitor組細(xì)胞遷移率明顯降低(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 各組細(xì)胞增殖能力、遷移率比較比較

圖3 miR-182-5p增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力(×200)

2.4miR-182-5p影響SATB2/nox4信號通路 對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin mRNA與蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組、NC-inhibitor組相比,miR-182-5p-mimics組SATB2、E-cadherin mRNA與蛋白表達(dá)量明顯下降,nox4、Vimentin mRNA與蛋白表達(dá)量明顯升高,miR-182-5p-inhibitor組SATB2、E-cadherin mRNA與蛋白表達(dá)量明顯升高,nox4、Vimentin mRNA與蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。見表4、圖4。

1～5：對照組、NC-mimics組、miR-182-5p-mimics組、NC-inhibitor組、miR-182-5p-inhibitor組 圖4 各組SATB2/nox4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 各組SATB2/nox4信號通路相關(guān)蛋白與mRNA表達(dá)比較

2.5SATB2逆轉(zhuǎn)miR-182-5p對結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的增強(qiáng)作用 對照組、NC-mimics組腫瘤體積、質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組腫瘤體積、質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組相比,miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組腫瘤體積、質(zhì)量明顯更大(P<0.05),miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2組體積、質(zhì)量明顯更小(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,對照組、NC-mimics組SATB2、nox4表達(dá)無明顯差異(P>0.05),miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組SATB2、nox4表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組、NC-mimics組相比,miR-182-5p-mimics組、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC組SATB2表達(dá)量明顯降低,nox4表達(dá)量明顯升高(P<0.05);miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2組SATB2表達(dá)量明顯上升,nox4表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。見圖5、圖6、表5。

表5 各組腫瘤質(zhì)量、SATB2、nox4相對表達(dá)比較

圖5 各組體內(nèi)異種移植

圖6 各組SATB2、nox4表達(dá)(免疫組化,×400)

3 討 論

結(jié)腸癌的預(yù)后水平與患者接受診斷時的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,早期結(jié)腸癌患者的生存率相對較高,而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移患者的生存率明顯降低〔11〕。結(jié)腸癌細(xì)胞通過遷移和增殖完成轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散,是導(dǎo)致患者接受治療后局部復(fù)發(fā)、病情惡化及死亡的病理基礎(chǔ)〔12〕。miR-182-5p已被多項研究報道其在多種癌癥中表達(dá)異常。王銳等〔13〕對比分析了70例結(jié)直腸癌患者與60例健康體檢者的血清miRNA-182-5p表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者miRNA-182-5p表達(dá)水平上升,且miRNA-182-5p水平與疾病臨床病理特征存在相關(guān)性。Yang等〔14〕研究指出,miR-182-5p在結(jié)直腸癌組織中上調(diào),并與結(jié)直腸癌對5-氟尿嘧啶的抗性有關(guān)。本研究結(jié)果提示,高表達(dá)miR-182-5p對SW480的增殖與遷移能力有促進(jìn)作用。

SATB2是一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白,通過錨定核基質(zhì)附著區(qū)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)重塑等過程,還能通過甲基化水平和蛋白乙酰化等途徑調(diào)控基因的表達(dá),在腫瘤轉(zhuǎn)移、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等方面均發(fā)揮著重要作用〔15〕。SATB2在結(jié)腸癌中呈低表達(dá),其表達(dá)量下降可能與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后情況相關(guān)〔16〕。Mezheyeuski等〔17〕對798例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了人群隊列分析,發(fā)現(xiàn)SATB2高表達(dá)患者的預(yù)后和對化療的反應(yīng)效果較SATB2低表達(dá)患者更好。研究發(fā)現(xiàn),SATB2在結(jié)腸癌中表達(dá)率較高,但表達(dá)量較正常腸黏膜組織更低,提示SATB2是一種抑癌基因〔18〕。本研究結(jié)果提示,SATB2逆轉(zhuǎn)了miR-182-5p對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移的增強(qiáng)作用。nox4能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生,活性氧可作為第2信使促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移等過程〔19〕。Mroueh等〔20〕提到nox4介導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧可防止胰腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是以上皮細(xì)胞極性消失及獲得間質(zhì)特性為主要特征,在形態(tài)學(xué)上發(fā)生成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,并獲得遷移轉(zhuǎn)移的能力,在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、多種纖維化疾病、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮了重要作用〔21〕。E-cadherin、Vimentin可通過改變細(xì)胞間黏附作用調(diào)控癌細(xì)胞遷移、侵襲能力〔22〕,Wang等〔23〕研究表明,SATB2蛋白表達(dá)與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程存在相關(guān)性,與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān),而與Vimentin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果與徐紀(jì)中等〔24〕的研究結(jié)果一致。

綜上,miR-182-5p對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力具有促進(jìn)作用,能夠降低SATB2表達(dá)并影響SATB2/nox4信號通路及其相關(guān)蛋白,SATB2能夠反向調(diào)控miR-182-5p表達(dá)。