甘佳攀 ，張 旗 ，陸紹銘 ，何思思 ，肖柳君 ，許 妍，譚靈芝，薛倩倩 ，金紅利 ,

1.贛江中藥創(chuàng)新中心，江西 南昌 330000

2.江西省中藥藥效物質基礎重點實驗室，贛江中藥創(chuàng)新中心，江西 南昌 330000

3.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023

4.江西省藥品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330000

5.江西百神藥業(yè)股份有限公司 江西省中藥配方顆粒重點實驗室，江西 宜春 330600

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒，其臨床療效應當和相應飲片保持一致[1]。其中《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》中明確提到：標準湯劑為衡量單味中藥配方顆粒是否與其相對應的單味中藥飲片臨床湯劑基本一致的物質基準，在中藥配方顆粒生產(chǎn)工藝量值傳遞與物料平衡研究中，起到了中藥飲片安全性，有效性的承載作用，以及中藥飲片到中藥配方顆粒的橋接作用[2]。因此，建立科學可靠的質量評價體系是量值傳遞研究的關鍵性內容。

基于定量指紋圖譜技術的中藥質量控制策略是本課題組在2008 年首次提出的質控方式[3]，是在原有中藥指紋圖譜的基礎上，結合多指標成分定量分析的中藥質量控制新模式。該模式可在一個指紋圖譜的方法上賦予指紋圖譜大量的定性、定量信息，從而實現(xiàn)多成分含量測定、指紋圖譜相似度評價。此外，超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（ultra-high performance liquid chromatography Q Exactive-Plus-Orbitrap mass spectrometer，UPLCQE-Plus-MS/MS）技術顯著提升了母離子的選擇與傳輸能力，可使復雜基質中低豐度成分的定量定性分析更加準確。并且其擁有的數(shù)據(jù)非依賴采集和平行反應監(jiān)測技術，可以擁有良好的重現(xiàn)性與置信度，從而實現(xiàn)化合物的精準分析與鑒定。結合2 種技術可以更真實、更準確的表征中藥質量情況，且目前暫未發(fā)現(xiàn)有結合這2 種技術，進行量值傳遞的相關研究。

吳茱萸作為臨床常用中藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，又名食茱萸、吳萸、漆辣子等[4]。與狼毒、枳實、橘皮、半夏、麻黃并稱為“六陳”?！吨袊幍洹?020 年版規(guī)定，吳茱萸的基原為蕓香科吳茱萸屬植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode) Huang 或疏毛吳茱萸E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.bodinieri(Dode) Huang 的干燥近成熟果實[5]。在之前的研究中，本項目組在開發(fā)了HPLC 定量指紋圖譜方法的基礎上，結合聚類分析、正交最小偏二乘等統(tǒng)計學方法，成功實現(xiàn)了吳茱萸3 種不同基原藥材的鑒別與區(qū)分[6]。吳茱萸在我國生長適應性強，資源豐富，分布廣泛，主要分布在江西、浙江、湖南等地?，F(xiàn)代研究表明，吳茱萸具有鎮(zhèn)痛、抗炎、減肥、保護心臟、降血壓等多種藥理學活性[7-8]。所含主要化學成分類型較多，包括生物堿類、有機酸類、黃酮類、檸檬苦素類等成分。其中吳茱萸堿、吳茱萸次堿具有鎮(zhèn)痛[9]、抗炎[10]、抗腫瘤[11]、降壓[12]等活性，檸檬苦素具有抗腫瘤[13]、抗炎[14]、抗菌[15]等作用，是吳茱萸中的主要活性成分。此外，吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素均被收載于《中國藥典》2020 年版，作為吳茱萸的質量評價指標，是吳茱萸的主要質控成分。

現(xiàn)有國家配方顆粒標準僅收載了吳茱萸（吳茱萸）配方顆粒[16]及制吳茱萸（吳茱萸）配方顆粒[17]，未有其他基原的吳茱萸配方顆粒標準。此外，吳茱萸（石虎）為江西省古今吳茱萸藥材資源的重要來源及道地藥材資源品種，且目前關于吳茱萸（石虎）的標準湯劑研究較少，相關研究基礎較為薄弱。因此，本研究以江西道地藥材，蕓香科吳茱萸屬植物石虎為研究對象，利用基于UPLC 的定量指紋圖譜技術建立吳茱萸（石虎）飲片、標準湯劑的定量指紋圖譜，并利用UPLC-QE-Plus-MS/MS 技術對指紋圖譜共有峰進行解析。同時以出膏率、相似度、共有峰轉移率及檸檬苦素、吳茱萸堿與吳茱萸次堿的含量和轉移率等為評價指標，研究吳茱萸（石虎）標準湯劑的量值傳遞規(guī)律，為吳茱萸（石虎）配方顆粒的工藝研究及質量標準制定奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity I Class 超高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元泵，PDA 檢測器，自動進樣器，柱恒溫系統(tǒng)，Empower 色譜工作站，美國沃特世（上海）科技有限公司。Thermo Scientific UPLC-QE-Plus MS/MS 液質聯(lián)用系統(tǒng)，包括電噴霧離子源、二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱恒溫系統(tǒng)、Thermo Scientific Xcalibur 軟件，美國賽默飛世爾科技公司。ML204 T/02 型萬分之一天平、XSR105 型十萬分之一天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；KQ-500 DV 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Sorvall ST8 型高速離心機，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；TB23A1 型煎藥壺，蘇珀爾；H22-X3 型電陶爐，九陽。色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH Shield RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），美國沃特世公司。

1.2 試藥

對照品綠原酸（批號110753-202018，規(guī)格20 mg，質量分數(shù)≥96.1%）、金絲桃苷（批號111521-201809，規(guī)格20 mg，質量分數(shù)≥94.9%）、檸檬苦素（批號110800-201707，規(guī)格20 mg，質量分數(shù)≥97.9%）、吳茱萸堿（批號110802-201710，規(guī)格20 mg，質量分數(shù)≥99.6%）、吳茱萸次堿（批號110801-202109，規(guī)格20 mg，質量分數(shù)≥99.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；吳茱萸（石虎）對照藥材，批號A2109003-210928，根據(jù)《國家藥品標準物質研制技術要求》研制，并于江西省藥品監(jiān)督管理局備案。

甲醇、乙腈，色譜級，均購自美國Fisher 公司；磷酸，色譜級，購自美國Aladdin 公司；甲酸，色譜級，購自德國Sigma-Aldrich 公司；實驗室用水來自Milli-Q IQ 7000 超純水凈化系統(tǒng)，德國默克公司。

18 批吳茱萸（石虎）飲片信息：批號A2109001、A2109002、A2109003、A2109004、A2109005，編號YP1～YP5，產(chǎn)地江西省樟樹市吳城鄉(xiāng)，江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司；批號 2021091901、2021091902、2021091903、2021091904、2021091905，編號YP6～YP10，產(chǎn)地湖南省懷化市沅陵縣，沅陵縣方源農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；批號2021092401、2021092402、2021092403、2021092404、2021092405、211201、211202、211203，編號YP11～YP18，產(chǎn)地浙江省杭州市太陽鎮(zhèn)，杭州臨安益成中藥材有限公司；飲片均經(jīng)贛江中藥創(chuàng)新中心學術顧問張繼研究員鑒定，其基原為蕓香科吳茱萸屬植物石虎E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode) Huang的干燥近成熟果實，均符合《中國藥典》2020 年版相關飲片的質量要求。

2 方法與結果

2.1 色譜和質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH Shield RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫條件：0～4 min，4%乙腈；4～9 min，4%～11%乙腈；9～10 min，11%乙腈；10～14 min，11%～18%乙腈；14～20 min，18%乙腈；20～22 min，18%～35%乙腈；22～28 min，35%～37%乙腈；28～34 min，37%～39%乙腈；34～35 min，39%～80%乙腈；35～38 min，80%乙腈；38～39 min，80%～4%乙腈；體積流量0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1 μL；檢測波長：指紋圖譜254 nm，含量測定215 nm。

2.1.2 質譜條件 流動相為乙腈-0.5%甲酸水溶液，梯度洗脫條件同“2.1.1”項。離子源：加熱電噴霧離子源（HESI）；掃描方式：正/負離子模式；采用Full MS/dd-MS2方式采集質譜信息，離子掃描范圍：m/z100～1 500；毛細管溫度320 ℃；正離子模式噴霧電壓3 500 V，負離子模式噴霧電壓?3 000 V；鞘氣體積流量45 arb；輔助氣體積流量10 arb；階梯碰撞能量20、40、60 eV。

2.2 標準湯劑及供試品溶液、對照品溶液的制備

2.2.1 標準湯劑的制備[2]取吳茱萸（石虎）飲片100 g，稱定，置煎藥壺中，加入800 mL 水浸泡30 min，采用電陶爐加熱的方式，先武火煮沸，再文火煎煮30 min，選擇200 目標準篩趁熱濾過；二煎加600 mL 水，先武火煮沸，再文火煎煮20 min，選擇200 目標準篩趁熱濾過；2 次濾液合并，減壓濃縮至200 mL，相對密度為1.03～1.05（60 ℃），將濃縮液分裝至凍干盤，置于冷凍干燥機中冷凍干燥，干燥后過五號藥典篩，即得吳茱萸（石虎）標準湯劑。與飲片編號YP1～YP18 對應，18 批標準湯劑編號為BT1～BT18。

2.2.2 標準湯劑供試品溶液的制備 精密稱定“2.2.1”項下制備的標準湯劑凍干粉0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理20 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 飲片指紋圖譜供試品溶液的制備[16]將吳茱萸（石虎）飲片粉碎成粉末，過三號藥典篩，精密稱定0.2 g，置具塞錐形瓶中，加水20 mL，加熱回流提取50 min，放冷后搖勻，10 000 r/min 離心（離心半徑10 cm）10 min，取上清液，減壓濃縮至干，殘渣加甲醇10 mL，超聲處理20 min，放冷后搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 飲片含量測定供試品溶液的制備[5]取吳茱萸（石虎）飲片粉末（過三號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質量，浸泡1 h，超聲處理（功率300 W、頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.5 對照品溶液的制備

（1）含量測定用混合對照品溶液制備：取檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含檸檬苦素200 μg/mL、吳茱萸堿70 μg/mL、吳茱萸次堿15 μg/mL 的含量測定用混合對照品溶液。

（2）成分鑒定用混合對照品溶液制備：取綠原酸、金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含綠原酸30 μg/mL、金絲桃苷20 μg/mL 的成分鑒定用混合對照品溶液。

2.3 指紋圖譜的建立及量值傳遞分析

2.3.1 精密度試驗 取批號為BT3 的吳茱萸（石虎）標準湯劑凍干粉，按照“2.2.2”項下方法制備標準湯劑供試品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6 次，按照“2.1.1”項下色譜條件進行分析，記錄指紋圖譜各共有峰峰面積及保留時間。以11 號峰（綠原酸）為參照峰（S1）計算峰1～3、9、10、12 的相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA），以17號峰（金絲桃苷）為參照峰（S2）計算峰14、20、24 的RRT 和RPA。結果顯示，RRT 的RSD 值均小于1.0%，RPA 的RSD 值均小于3.0%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取批號為BT3 的吳茱萸（石虎）標準湯劑凍干粉，精密稱定6 份，按照“2.2.2”項下方法平行制備6 份標準湯劑供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進行分析，記錄指紋圖譜各共有峰峰面積及保留時間。以11 號峰（綠原酸）為參照峰（S1）計算峰1～3、9、10、12 的RRT 和RPA，以17 號峰（金絲桃苷）為參照峰（S2）計算峰14、20、24 的RRT 和RPA。結果顯示，RRT 的RSD 值均小于1.0%，RPA 的RSD 值均小于2.0%，表明樣品的處理方法重復性較好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取批號為BT3 的吳茱萸（石虎）標準湯劑凍干粉，按照“2.2.2”項下方法制備標準湯劑供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h 注入液相色譜儀，按照“2.1.1”項下色譜條件進行分析，記錄指紋圖譜各共有峰峰面積及保留時間。以11 號峰（綠原酸）為參照峰（S1）計算峰1～3、9、10、12 的RRT 和RPA，以17 號峰（金絲桃苷）為參照峰（S2）計算峰14、20、24 的RRT 和RPA。結果顯示，RRT 的RSD 值均小于1.0%，RPA 的RSD 值均小于5.0%，結果表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.4 對照指紋圖譜的建立及共有峰標定 分別取18 批吳茱萸（石虎）飲片（YP1～YP18）和標準湯劑凍干粉（BT1～BT18），分別按照“2.2.2”項下方法制備標準湯劑供試品溶液，按照“2.1.1”項下方法依次進樣檢測，獲得吳茱萸（石虎）飲片和標準湯劑的UPLC 指紋圖譜。將統(tǒng)一積分后的數(shù)據(jù)全部導入國家藥典委員會頒布的《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》（2012 版），以YP1 樣品的圖譜為參照，時間窗口設置為0.1 min，使用平均數(shù)進行自動匹配，加以多點校正，生成飲片的對照指紋圖譜（YPR），結果見圖1-A。采用同樣的方法，以BT1樣品的圖譜為參照，生成標準湯劑的對照指紋圖譜（BTR），結果見圖1-B。隨后對18 批吳茱萸（石虎）飲片（YP1～YP18）指紋圖譜進行比對，共計標定25 個共有峰，結果見圖1-A；對18 批吳茱萸（石虎）標準湯劑（BT1～BT18）指紋圖譜進行比對，共計標定25 個共有峰，結果見圖1-B。

圖1 18 批吳茱萸 (石虎) 飲片 (A) 與標準湯劑 (B) 的UPLC 指紋圖譜及其對照指紋圖譜 (YPR、BTR)Fig.1 UPLC fingerprints of 18 batches of Euodiae Fructus (Euodia rutaecarpa var.officinalis) [EF(ERO)] decoction pieces(A) and standard decoction (B), and its reference fingerprints (YPR, BTR)

2.3.5 共有峰成分的鑒定 分別取YP1、BT1 供試品溶液及成分鑒定用混合對照品溶液，采用UPLCQE-Plus-MS/MS 技術，在“2.1.2”項下的質譜條件進行測定，進樣量為5 μL，正、負離子模式下的總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）如圖2 所示。依據(jù)采集結果，對圖1 中確定的25 個共有峰化合物的保留時間、一級離子質荷比以及二級碎片離子信息進行分析?；跍史肿与x子[M－H]?、[M＋H]+信息判斷，得到一級質譜精確相對分子質量，并根據(jù)產(chǎn)生的二級質譜碎片離子信息，結合文獻、數(shù)據(jù)庫及對照品比對，對吳茱萸（石虎）飲片和標準湯劑共有峰進行成分鑒定，結果見表1、2，其中包括5 個生物堿類化合物、12 個有機酸類化合物、7個黃酮類化合物、1 個檸檬苦素類化合物。

表1 吳茱萸 (石虎) 飲片共有峰的QE-Plus MS/MS 法鑒定Table 1 Identification of common peaks in EF(ERO) decoction pieces by QE-Plus MS/MS method

表2 吳茱萸 (石虎) 標準湯劑共有峰的QE-Plus MS/MS 法鑒定Table 2 Identification of common peaks in EF(ERO) standard decoction by QE-Plus MS/MS method

圖2 吳茱萸 (石虎) 飲片 (A) 和標準湯劑 (B) 的正 (I)、負 (II) 離子模式TIC 圖Fig.2 Positive (I) and negative (II) ion mode TIC of EF(ERO) decoction pieces (A) and standard decoction (B)

（1）生物堿類：從吳茱萸樣品中鑒定出的生物堿類成分有5 個，均在正離子模式下響應較好。其主要是通過結合或失去氫原子、羥基、甲?；然鶊F形成結構更為豐富的化合物[21]。本實驗以吳茱萸堿為例，對生物堿類成分的裂解方式進行分析。吳茱萸堿出峰時間為29.68 min，根據(jù)一級正離子模式下的質譜信息顯示，其準分子離子峰為m/z304.144 1[M＋H]+。進一步進行二級質譜信息分析，結果顯示由準分子離子峰發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德（retro-Diels-Alder reaction，RDA）裂解[22]，產(chǎn)生特征碎片離子m/z171.019 5 和m/z134.060 0。通過對照品對比，質譜信息一致，因此確定其為吳茱萸堿。根據(jù)裂解規(guī)律，共鑒定出吳茱萸樣品中去氫吳茱萸堿、evodiaxinine、吳茱萸酰胺、吳茱萸堿、吳茱萸次堿5 個生物堿。

（2）有機酸類：從吳茱萸樣品中鑒定出的有機酸類成分有12 個，均在負離子模式下響應較好。本實驗以綠原酸為例，對有機酸類成分的裂解方式進行分析。綠原酸的出峰時間為9.29 min，根據(jù)一級負離子模式下的質譜信息顯示，其準分子離子峰為m/z353.087 6 [M－H]?。進一步進行二級質譜信息分析，結果表明準分子離子峰發(fā)生酯鍵水解后，產(chǎn)生m/z191.056 1、179.035 2 及其進一步丟失CO2m/z135.045 1 的二級碎片離子。通過對照品對比，兩者質譜信息一致，因此確定其為綠原酸。隨后根據(jù)裂解規(guī)律，共鑒定出吳茱萸樣品中咖啡酰葡萄糖酸及其同分異構體、阿魏酰葡萄糖酸及其同分異構體、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、阿魏酰奎寧酸等12個有機酸成分[23]。

（3）黃酮類：從吳茱萸樣品中鑒定出的黃酮類成分有7 個，主要在負離子模式下響應較好。在負離子模式下，除產(chǎn)生[M－H]?離子以外，還有[MH－糖基]?等離子[21-22]。本實驗以金絲桃苷為代表性成分，對黃酮類成分的裂解方式進行分析。金絲桃苷的出峰時間為17.38 min，根據(jù)一級負離子模式下的質譜信息顯示，其準分子離子峰為m/z463.087 8[M－H]?。在二級質譜信息中，準分子離子峰丟失1個糖基，產(chǎn)生碎片離子m/z300.027 3，隨后丟失CO，產(chǎn)生碎片離子m/z271.024 7，在繼續(xù)丟失H2O 并發(fā)生RDA 裂解后，產(chǎn)生碎片離子m/z151.003 5。通過對照品對比，兩者質譜信息一致，因此，確定其為金絲桃苷。

隨后根據(jù)裂解規(guī)律，共鑒定出吳茱萸中樣品中香樹素-7-O-β-D-葡萄糖苷、蘆丁、金絲桃苷、檸檬黃素-3-O-蕓香糖苷、柯伊利素-7-O-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷7 個黃酮類成分。

（4）檸檬苦素類：從吳茱萸樣品中鑒定出的檸檬苦素類成分有1 個，在正離子模式下響應較好。檸檬苦素出峰時間為24.42 min，根據(jù)一級正離子模式下的質譜信息顯示，其準分子離子峰為m/z471.200 7 [M＋H]+。進一步進行二級質譜信息分析，MS2中采集到m/z425.194 9、161.059 5、95.013 0 等碎片離子。其中離子m/z425.194 9 是準分子離子峰通過丟失1 個羧基產(chǎn)生。在與對照品對比后，兩者質譜信息一致，因此，確定其為檸檬苦素[24]。

2.3.6 量值傳遞分析

（1）指紋圖譜特征峰個數(shù)傳遞：由表1、2 可見，吳茱萸（石虎）標準湯劑指紋圖譜與飲片指紋圖譜對應編號的共有峰為同一成分，即25 個特征峰均從吳茱萸（石虎）飲片中傳遞到吳茱萸（石虎）標準湯劑中，共有峰傳遞率為100%，結果表明，飲片中的化學成分可以穩(wěn)定傳遞到吳茱萸（石虎）標準湯劑中。

（2）指紋圖譜相似度分析：采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》（2012 版），在圖1 的25 個共有峰中，以峰響應與分離度等為指標，挑選11 個主成分共有峰（峰1～3、9～12、14、17、20、24）為特征峰計算樣品相似度。其中，18 批吳茱萸（石虎）飲片（YP1～YP18）與YPR 的相似度分別為0.952、0.958、0.963、0.940、0.947、0.960、0.941、0.957、0.949、0.942、0.972、0.986、0.980、0.979、0.988、0.897、0.900、0.914；18 批標準湯劑（BT1～BT18）與BTR 的相似度分別為0.986、0.988、0.989、0.992、0.991、0.984、0.984、0.986、0.985、0.983、0.966、0.964、0.969、0.965、0.965、0.925、0.923、0.922。此外，以每批次吳茱萸（石虎）飲片的指紋圖譜為對照，計算對應批次標準湯劑的指紋圖譜相似度，18 批次吳茱萸（石虎）標準湯劑（BT1～BT18）與對應飲片（YP1～YP18）的相似度分別為0.980、0.984、0.980、0.958、0.984、0.970、0.950、0.964、0.950、0.951、0.971、0.966、0.967、0.958、0.956、0.980、0.981、0.980，均大于0.900。表明18 批吳茱萸（石虎）飲片與標準湯劑樣品的指紋圖譜相似度較高，不同批次樣品的質量相對穩(wěn)定，標準湯劑的制備工藝穩(wěn)定可行，飲片質量能較好地傳遞到標準湯劑。

2.4 樣品含量測定及量值傳遞分析

2.4.1 系統(tǒng)適應性試驗 取檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的混合對照品溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣測定，并記錄色譜圖。該條件下的混合對照品色譜圖見圖3。結果表明，檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的保留時間分別為24.52、28.72、30.10 min，本實驗條件下所測的3 種成分均實現(xiàn)基線分離，拖尾因子均在0.95～1.05，理論塔板數(shù)均大于10 000，系統(tǒng)適用性良好。

圖3 混合對照品 (A)、吳茱萸 (石虎) 飲片 (YP3, B) 和標準湯劑 (BT3, C) 的UPLC 圖Fig.3 UPLC of mixed reference substances (A), EF(ERO)decoction pieces (YP3, B) and standard decoction (BT3, C)

2.4.2 線性關系考察 取“2.2.3”項下含量測定用混合對照品溶液，精密量取0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置5 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成系列混合對照品溶液。按照“2.1.1”項下色譜條件進行分析，記錄各指標成分峰面積。以進樣質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析，得到回歸方程及線性范圍分別為檸檬苦素Y＝1 549.9X－4 478.2，R2＝0.999 3，線性范圍8.325 4～208.135 4 μg/mL；吳茱萸堿Y＝19 868X－271.27，R2＝0.999 9，線性范圍2.783 2～69.580 6 μg/mL；吳茱萸次堿Y＝16 902X－2 661.6，R2＝0.999 8，線性范圍0.636 8～15.919 8 μg/mL。結果3 個指標成分的R2均大于0.999，截距誤差均小于3，峰面積與質量濃度呈線性相關。

2.4.3 精密度試驗 取含量測定用混合對照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6 次，按照“2.1.1”項下色譜條件分析，測定檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的色譜峰峰面積，計算RSD 值，結果分別為0.89%、0.66%、0.81%，均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取批號為BT3 的吳茱萸（石虎）標準湯劑凍干粉，按照“2.2.1”項下方法制備標準湯劑供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h 注入液相色譜儀，按照“2.1.1”項下色譜條件分析，記錄定量指紋圖譜。測定檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的色譜峰峰面積，計算RSD值，結果分別為0.89%、0.63%、0.83%，均小于1.0%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取批號為BT3 的吳茱萸（石虎）標準湯劑凍干粉，精密稱定6 份，按照“2.2.1”項下方法平行制備6 份標準湯劑供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，測定檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的色譜峰峰面積，計算RSD值，結果分別為1.07%、1.09%、0.96%，均小于2.0%，表明樣品的處理方法重復性較好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取已測定指標成分含量的批號為BT3 的吳茱萸（石虎）標準湯劑凍干粉，按其中檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的約50%、100%、150%濃度水平準確加入已知量的3 種對照品混合溶液，按“2.2.1”項下方法制備低、中、高質量濃度各3 份的標準湯劑供試品溶液，測定檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的色譜峰峰面積。計算檸檬苦素和吳茱萸堿的平均加樣回收率分別為103.84%和100.95%，RSD 分別為1.77%和0.89%；吳茱萸次堿的平均加樣回收率為95.55%，RSD 為1.50%，表明該方法的準確性良好。

2.4.7 吳茱萸（石虎）樣品含量測定及量值傳遞分析 分別提取“2.3.4”項下測定的YP1～YP18 和BT1～BT18 的215 nm 色譜圖，同“2.4.5”項下方法記錄3 個指標成分的峰面積積分值，采用外標一點法計算吳茱萸（石虎）飲片和標準湯劑中各指標成分的含量，結果見表3。以檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量為指標，計算18 批吳茱萸（石虎）標準湯劑中指標成分的轉移率，結果見表3。18 批吳茱萸（石虎）標準湯劑中檸檬苦素的轉移率平均值（）為29.99%，標準偏差（s）為3.09%，吳茱萸堿的轉移率平均值與標準偏差分別為6.14%與3.71%，吳茱萸次堿的轉移率平均值與標準偏差分別為3.70%與3.20%。3 個成分的轉移率均在±3s[2]之間，表明吳茱萸（石虎）標準湯劑樣品制備工藝穩(wěn)定，飲片中的含量測定成分可以穩(wěn)定傳遞到吳茱萸（石虎）標準湯劑中。

表3 吳茱萸 (石虎) 飲片與標準湯劑中3 個成分含量測定結果Table 3 Content determination results of three components in EF(ERO) decoction pieces and standard decoction

2.5 標準湯劑的出膏率測定

標準湯劑的出膏率作為考察飲片加水煎煮過程中物質的溶出，是作為衡量飲片質量穩(wěn)定程度的指標[25]。取18 批吳茱萸（石虎）標準湯劑濃縮液2 mL，置蒸發(fā)皿中（事先恒定質量），水浴蒸干后于105 ℃烘箱中干燥，質量恒定后取出，置干燥器冷卻30 min，稱定質量，計算出膏率，重復3 次取平均值。結果顯示，18 批標準湯劑的出膏率分別為27.80%、28.15%、27.92%、26.79%、27.58%、24.80%、23.89%、24.39%、24.32%、23.59%、26.93%、27.25%、26.52%、26.54%、26.67%、25.52%、26.20%、26.61%。標準湯劑出膏率在 23.59%～28.15%，均值為26.19%。經(jīng)計算，18 批吳茱萸（石虎）標準湯劑出膏率的±3s范圍為21.88%～30.51%，均值的70%～130%范圍為18.34%～34.05%，18 批標準湯劑出膏率均在規(guī)定的±3s或均值的70%～130%范圍內，結果表明吳茱萸（石虎）標準湯劑制備工藝穩(wěn)定、均一。

3 討論

通過對吳茱萸（石虎）飲片到標準湯劑量值傳遞的相關規(guī)律進行分析，從指紋圖譜的研究結果，可以發(fā)現(xiàn)在吳茱萸（石虎）飲片與標準湯劑的指紋圖譜中，均可標定出25 個共有峰。并在結合UPLCQE-Plus-MS/MS 對共有峰進行鑒定后，確認吳茱萸（石虎）飲片與標準湯劑中對應編號的共有峰為同一成分，即25 個共有峰均從飲片傳遞到標準湯劑中，表明在化學成分上吳茱萸（石虎）飲片與標準湯劑具有等效性。在此基礎上，通過對檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿等的定量成分轉移率以及標準湯劑的出膏率進行研究，結果表明檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿等成分的轉移率與吳茱萸（石虎）標準湯劑的出膏率，均符合國家規(guī)定的指導原則要求。標準湯劑的制備工藝不僅可以保障吳茱萸（石虎）飲片到標準湯劑的化學等效性，且相關研究結果可為吳茱萸（石虎）配方顆粒的化學等效性研究提供數(shù)據(jù)支持。

在方法開發(fā)上，由于吳茱萸（石虎）所含化學成分較多，并以生物堿類、檸檬苦素類占比最高。針對吳茱萸含量測定與指紋圖譜方法，前期相關的文獻方法[6,26-29]對其進行了分別的開發(fā)，但耗時較長，未見有基于UPLC 技術的吳茱萸定量指紋圖譜方法建立。因此，本研究通過對供試品溶液制備方法、液相分析方法等的全面考察，以吳茱萸（石虎）為對象，建立了基于UPLC 技術的吳茱萸（石虎）標準湯劑的定量指紋圖譜方法。與現(xiàn)狀相比，本研究所建立的方法，可通過一臺儀器、一次分析同時實現(xiàn)吳茱萸（石虎）標準湯劑的特征圖譜和含量測定的檢測，減少了乙腈等流動相的使用量，降低了檢測成本，并能有效減少測定時間、提高工作效率。并通過方法學考察后，表明該方法精密度好、重復性和重現(xiàn)性高。

3.1 關于飲片和標準湯劑供試品溶液制備方法

本研究前期參考吳茱萸（吳茱萸）配方顆粒標準[16]、《香港中藥材標準》吳茱萸[30]，考察了吳茱萸（石虎）飲片指紋圖譜的提取方式（超聲、回流）和提取溶劑（水、甲醇）對實驗結果的影響。結果表明，吳茱萸配方顆粒標準中回流提取的指紋圖譜色譜峰數(shù)量較多，且采用甲醇作提取溶劑時指紋圖譜的色譜峰數(shù)量也較多，因此，最終確定了吳茱萸（石虎）飲片指紋圖譜的提取方法。

隨后，以指紋圖譜色譜峰數(shù)量及色譜峰比例、定量成分的提取效率為評價指標，比較不同的提取溶劑（稀乙醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇）、提取時間（20、30、40、60 min）、提取體積（料液比為1∶25、1∶50、1∶100）條件下吳茱萸（石虎）標準湯劑定量指紋圖譜的提取效果。最終確定提取溶劑為甲醇、提取時間為20 min、提取體積為料液比1∶50 作為吳茱萸（石虎）標準湯劑定量指紋圖譜的提取條件。

3.2 關于色譜條件的選擇

吳茱萸（石虎）標準湯劑中的含量測定指標成分為檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿，最大紫外吸收波長分別為206、213、226、344 nm，因此考察203、215、225、254、280、330、360 nm 等波長對吳茱萸（石虎）標準湯劑定量指紋圖譜的影響。結果顯示，檸檬苦素在254～330 nm 波長下無吸收，203、215、225 nm 波長下3 個成分的定量結果無較大差異，在254 nm 下的指紋圖譜中色譜峰的個數(shù)及響應均勻性較好。綜合考慮，選擇在215 nm 作為吳茱萸（石虎）標準湯劑含量測定的檢測波長，254 nm 作為指紋圖譜的檢測波長。此外，在系統(tǒng)考察了梯度、色譜柱、流動相體系、柱溫、體積流量等條件后，最終確定了本實驗所采用的色譜條件。

本研究建立了一種吳茱萸（石虎）標準湯劑的UPLC 定量指紋圖譜方法，并結合UPLC-QE-Plus-MS/MS 技術，對在對照指紋圖譜中標定的25 個共有峰進行分析及鑒定，共鑒定5 個生物堿類化合物、12 個有機酸類化合物、7 個黃酮類化合物、1 個檸檬苦素類化合物。并通過峰個數(shù)傳遞、指紋圖譜相似度；檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿3 個具有活性的定量成分含量及轉移率；以及出膏率等指標；綜合測定并闡述了吳茱萸（石虎）飲片到標準湯劑的量值傳遞規(guī)律。該方法具有簡單、高效、可靠的優(yōu)點，可同時對吳茱萸（石虎）飲片與標準湯劑進行定性與定量分析，研究結果可為后續(xù)吳茱萸（石虎）配方顆粒的制備工藝及質量研究奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突