王書(shū)娟，胡軍華 ，姚 雪 ，汪盛華 ，周恩麗 ，章晨峰 ，于桂芳 *，王振中, *

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

3.中藥制藥過(guò)程控制與智能制造技術(shù)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001

砷（As）元素屬于類(lèi)金屬元素，其化合物的種類(lèi)在自然界中繁多，不同種類(lèi)的砷化合物具有不同的形態(tài)、價(jià)態(tài)[1-2]。目前，常見(jiàn)的砷化合物主要有亞砷酸［arsenious acid，As(III)］、砷酸［arsenic acid，As(Ⅴ)］、一甲基砷（monomethylarsenic，MMA）、二甲基砷（dimethylarsenic，DMA）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）、砷膽堿（arsenocholine，AsC）6 種[3-4]。毒理學(xué)研究表明，不同形態(tài)、價(jià)態(tài)的砷化合物的毒性不同。通常無(wú)機(jī)砷（inorganic arsenic，iAs）有劇毒，其中As(Ⅲ)的毒性是As(Ⅴ)的60 倍，有機(jī)砷（MMA 和DMA）的毒性中等，而AsB 和AsC 則被認(rèn)為是無(wú)毒的[5-7]。目前，常見(jiàn)的砷形態(tài)分析的方法主要有高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用技術(shù)（HPLC-AFS）、高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光度法（HPLC-HG-AFS）、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（HPLC-ICP-MS）等[8-12]。與其他分析方法相比，利用HPLC-ICP-MS 技術(shù)進(jìn)行砷化合物的分析，能夠避免光譜和基底的干擾，靈敏度高、專(zhuān)屬性、精密度較好，分析速度快，操作簡(jiǎn)便，具有明顯的優(yōu)勢(shì)[13-15]。

散寒化濕顆粒（Sanhan Huashi Granules，SHG）是由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司根據(jù)《中藥注冊(cè)分類(lèi)及申報(bào)資料要求》中3.2 類(lèi)注冊(cè)要求和疫情期間臨床上實(shí)際使用藥物的生產(chǎn)工藝所研發(fā)上市的顆粒劑[16]。該方主要由麻黃、厚樸、煨草果、地龍等20味中藥組成，具有散寒化濕、祛毒通絡(luò)、宣肺透邪等功效，其臨床療效顯著，安全性良好[17-18]。該處方藥味中地龍為常用的動(dòng)物藥，在中藥復(fù)方中具有不可替代的作用[19]，但其重金屬及有害元素含量超標(biāo)的問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，特別是砷元素超標(biāo)的情況[20-23]，其臨床使用的安全性問(wèn)題一直是備受關(guān)注，也在一定程度上對(duì)地龍藥材及其復(fù)方制劑的應(yīng)用和推廣造成影響。截至目前，關(guān)于SHG 中總砷和砷形態(tài)的含量及其限度的制定等研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)采用ICP-MS 對(duì)地龍藥材、飲片、地龍飲片提取液、SHG 中的總砷含量進(jìn)行測(cè)定分析，再采用HPLC-ICP-MS 對(duì)其中6 種不同形態(tài)、價(jià)態(tài)的砷含量進(jìn)行測(cè)定，探究其傳遞規(guī)律；同時(shí)對(duì)多批次SHG 制劑及不同產(chǎn)地的地龍藥材進(jìn)行分析，以期初步建立地龍藥材的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，從源頭上控制藥材質(zhì)量，確保SHG 的安全性，同時(shí)為地龍藥材的評(píng)價(jià)積累數(shù)據(jù)，也為其他含有地龍藥味的中藥復(fù)方制劑的風(fēng)險(xiǎn)防控提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Flexar 型高效液相色譜儀、NexION 300X 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)Perkin Elmer 公司；ETHOS UP 型微波消解儀，北京安南科技有限公司；Mettler Toledo AL204 型電子分析天平，德國(guó)梅特勒公司；Milli-Q Academic 型超純水儀，美國(guó)密理博公司；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市康華電子儀器制造廠；VB24 UP 型趕酸器，北京萊伯泰科有限公司；TDL-5-A 型低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器；KDM 型電熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)所用玻璃儀器均用20%硝酸溶液浸泡24 h 以上，并用超純水沖洗干凈，晾干備用。

1.2 材料

1.2.1 試劑 胃蛋白酶（批號(hào)220909）、碳酸銨（批號(hào)20200326）、無(wú)水乙醇（批號(hào)20220803）均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（批號(hào)11071120645）、磷酸氫二銨（批號(hào)11072920722）均購(gòu)自于南京化學(xué)試劑有限公司；硝酸UP 級(jí)（電子級(jí)硝酸，金屬雜質(zhì)含量小于10 ng/L），蘇州晶瑞化學(xué)試劑有限公司；水為超純水；硝酸人工胃液（按照《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則2322 配制）；GraphPad Prism 軟件，Version 8.0，美國(guó)GraphPad Software 公司；SIMCA 軟件，Version 14.1，瑞典MKS Umetrics 公司。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.000 mg/mL，批號(hào)GSB04-1715-2004）、As 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.000 mg/mL，批號(hào)GSB04-1714-2004），Ge單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.000 mg/mL，批號(hào)GSB04-1728-2004）均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；亞砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［批號(hào)GBW0866，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以砷（As）計(jì)為（75.7±1.2）μg/g］、砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［批號(hào)GBW0866，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（17.5±0.4）μg/g］、一甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［批號(hào)GBW08668，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以砷（As）計(jì)為（25.1±0.8）μg/g］、二甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［批號(hào)GBW08669，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以砷（As）計(jì)為（52.9±1.8）μg/g］、砷甜菜堿溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［批號(hào)GBW08670，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以砷（As）計(jì)為（38.8±0.1）μg/g］、砷膽堿溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［批號(hào)GBW08671，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以砷（As）計(jì)為（28.0±1.1）μg/g］均購(gòu)自于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；調(diào)諧液（含Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U，質(zhì)量濃度均為1 μg/L，Lot38-31GSX1）購(gòu)自美國(guó)Perkin Elmer 公司。

1.2.3 樣品

（1）傳遞規(guī)律研究用樣品。對(duì)應(yīng)關(guān)系1：地龍藥材（批號(hào)Y2101023）、地龍飲片（批號(hào)YP2104025）、缺地龍SHG 陰性樣品（SHG-陰性）、SHG（批號(hào)210401、210402、210403）。對(duì)應(yīng)關(guān)系2：地龍飲片（批號(hào)YP2211066）、缺地龍SHG 陰性樣品（SHG-陰性）、SHG（批號(hào)221203）。地龍樣品分別來(lái)自于廣東、廣西，均為鉅蚓科環(huán)毛蚓屬動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)。

（2）多批次SHG。共28 批，批號(hào)分別為210401、210402、210403、221202、221203、221204、221205、221206、221207、221208、221209、221210、221211、221212、221213、221215、221216、221217、221233、221234、221235、221236、221237、221238、221240、221241、221242、221243，編號(hào)分別為SHG1～SHG28，均購(gòu)自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司。

（3）多批次地龍藥材。共24 批，均購(gòu)自于中藥材市場(chǎng)，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室（中藥資源與栽培技術(shù)中心）主任谷巍教授鑒定，結(jié)果分別為鉅蚓科環(huán)毛蚓屬動(dòng)物參環(huán)毛蚓P.aspergillum(E.Perrier)、通俗環(huán)毛蚓P.vulgarisChen、威廉環(huán)毛蚓P.guillelmi(Michaelsen)的干燥體，習(xí)稱(chēng)“廣地龍”或“滬地龍”，具體信息見(jiàn)表1。

表1 地龍藥材至制劑的總砷及砷形態(tài)測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of total arsenic and arsenic speciation from Pheretima herbs to preparations

表1 地龍樣品信息Table 1 Information of Pheretima samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 ICP-MS 條件 總砷測(cè)定時(shí)采用碰撞反應(yīng)池模式，等離子氣體流量16.0 L/min，霧化器流量0.94 L/min，輔助氣流量1.2 L/min，射頻功率1 600 W，脈沖階段電壓1 300 V，模擬階段電壓?2 200 V，蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速為20 r/min，載氣為高純液氬，跳峰采集模式，測(cè)定時(shí)選取74Ge 為內(nèi)標(biāo)；砷形態(tài)測(cè)定時(shí)，ICP-MS 與HPLC 通過(guò)數(shù)據(jù)線連接傳遞信號(hào)，ICPMS 采集模式為時(shí)間分辨模式（time resolved mode，TRA），檢測(cè)質(zhì)量數(shù)m/z為75（As），其他采集條件同總砷測(cè)定模式。

2.1.2 HPLC 條件 Hamilton PRP-X100（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為1.5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液（A）-100 mmol/L 碳酸銨溶液（B）；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為20 μL；梯度洗脫：0～2 min，10%～12% B；2～4 min，12%～100% B；4～9 min，100% B～10% B；9～10 min，10% B。在選定的條件下，6 種砷形態(tài)、價(jià)態(tài)的色譜圖、SHG、地龍藥材及SHG 地龍陰性典型樣品圖見(jiàn)圖1。

圖1 砷元素形態(tài)測(cè)定圖譜和典型樣品圖Fig.1 Determination of arsenic form and typical sample

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 總砷測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密吸取As 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用5%硝酸稀釋?zhuān)瞥珊闉?0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取該儲(chǔ)備液適量，用5%硝酸稀釋制成含砷元素分別為5、20、50、100、200、250 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 形態(tài)砷測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別精密稱(chēng)取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsC、AsB 對(duì)照品適量，加0.02 mol/L 乙二胺四醋酸二鈉溶液制成各含2.0 μg/mL（以As 計(jì)）的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加入0.02 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉溶液制成各含1、5、20、50、100、200 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取浸膏的制備 精密稱(chēng)取混合均勻的地龍飲片（過(guò)三號(hào)篩，批號(hào)YP2104025、YP2211066）約4 g，精密加入水50 mL，加熱回流提取2 h，濃縮成浸膏（密度1.10 g/cm3），待用。

2.3.2 總砷測(cè)定供試品溶液 精密稱(chēng)取混合均勻的樣品（過(guò)三號(hào)篩）約0.5 g 于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸10 mL，混勻，待氣泡散盡，置預(yù)先設(shè)置好參數(shù)的微波消解儀中（消解功率為1 500 W，在20 min 內(nèi)升溫至190 ℃，消解40 min），消解完全后放置室溫，取出，待蒸氣散盡后，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 聚丙烯量瓶中，用水洗滌消解罐2～3 次，洗液與消解液合并，加水定容至刻度線，搖勻即可。如果測(cè)定提取浸膏中的總砷，則精密稱(chēng)取提取浸膏適量于聚四氟乙烯消解罐中，自“加入硝酸10 mL”起，保持相同操作。同法制備試劑空白溶液。

2.3.3 形態(tài)砷測(cè)定供試品溶液 精密稱(chēng)取混合均勻的樣品（過(guò)3 號(hào)篩）約0.2 g 于50 mL 離心管中，精密加入硝酸人工胃液10 mL，40 ℃水浴震蕩8 h，待冷卻至室溫后，微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。如果測(cè)定提取浸膏中的砷形態(tài)，則精密稱(chēng)取提取浸膏適量于50 mL 離心管中，自“加入硝酸人工胃液10 mL”起，保持相同操作。同法制備空白溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍考察 采用HPLC-ICP-MS，分別精密吸取配制好的6 種砷形態(tài)化合物質(zhì)量濃度為1、5、20、50、100、200 ng/mL 的溶液各20 μL 進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果分別為AsCY＝3 137.229 9X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；AsBY＝3 823.738 9X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；As(III)Y＝2 841.969 3X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；DMAY＝4 077.541 7X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；MMAY＝4 054.937 0X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL；As(V)Y＝4 217.265 7X，r＝0.999 9，線性范圍1～200 ng/mL。結(jié)果顯示，各成分在1～200 ng/mL 線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取地龍樣品1 份（S15），按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算AsB、As(III)、MMA、As(Ⅴ)峰面積的RSD 分別為2.11%、0.87%、2.37%、1.62%，符合微量元素分析的要求，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取地龍樣品1 份（S15），按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到AsB、As(III)、MMA、As(Ⅴ)峰面積的RSD 分別為3.81%、5.68%、6.82%、3.26%，符合微量元素分析的要求，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取地龍樣品的供試品溶液（S15）6 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，計(jì)算得到AsB、As(III)、MMA、As(Ⅴ)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的均值分別為0.22、1.60、1.24 μg/g，RSD 分別為6.06%、5.79%、13.96%、7.06%，符合微量元素分析的要求，表明重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取適量重復(fù)性試驗(yàn)樣品（S15）6 份置50 mL 離心管中，分別加入混合對(duì)照品溶液（1 μg/mL）1 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，AsC、AsB、As(III)、DMA、MMA、As(Ⅴ)的平均加樣回收率分別為111.61%、103.78%、96.08%、94.15%、94.77%、79.20%，其RSD 分別為5.4%、6.9%、7.2%、8.0%、6.9%、7.8%，符合微量元素分析的要求，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

2.5.1 傳遞規(guī)律研究 通過(guò)對(duì)研究傳遞規(guī)律批的地龍藥材、地龍飲片、飲片提取液、SHG 中的樣品進(jìn)行處理。采用ICP-MS 對(duì)上述樣品進(jìn)行總砷含量的測(cè)定，并采用HPLC-ICP-MS 對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的砷形態(tài)及價(jià)態(tài)分析，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由結(jié)果可以看出，地龍藥材、飲片、提取液及SHG 在傳遞過(guò)程中總砷含量呈遞減趨勢(shì)，其中，總砷在對(duì)應(yīng)關(guān)系1 中各物料的轉(zhuǎn)移率（即藥材→飲片→提取液→SHG）分別為85.58%、78.95%、76.97%；基于制劑處方，藥材到制劑中的平均轉(zhuǎn)移率為52.00%，飲片到制劑中的平均轉(zhuǎn)移率為60.81%；總砷在對(duì)應(yīng)關(guān)系2 中各物料的轉(zhuǎn)移率（即飲片→提取液→SHG）分別為76.11%、80.60%，飲片到制劑中的轉(zhuǎn)移率為64.79%。SHG 陰性樣品中檢出極少量的砷，且采用同一批地龍制備的3 批制劑中6 種砷形態(tài)含量以及總砷含量相近，可推測(cè)SHG 中的砷幾乎均來(lái)自地龍藥材，地龍對(duì)SHG 的砷含量起決定性作用。

2.5.2 地龍藥材與SHG 的多批次測(cè)定 采用“2.3”項(xiàng)下方法，對(duì)市售地龍藥材及多批次的SHG 進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2、3。結(jié)果顯示，24 批次地龍藥材中總砷含量在3.96～24.55 mg/kg，平均值為12.31 mg/kg，反映出不同產(chǎn)地的地龍藥材中總砷含量差異較大，且均高于《中國(guó)藥典》2020 年版植物類(lèi)“重金屬及有害元素一致性限量”指導(dǎo)值（砷不得過(guò)2 mg/kg）[4]，游離的無(wú)機(jī)砷（inorganic arsenic，iAs）含量較高，占總砷含量的90%以上，且其形態(tài)與總砷含量之間并非呈現(xiàn)簡(jiǎn)單的正相關(guān)，因此有必要對(duì)多批次地龍作進(jìn)一步的分析，探究不同產(chǎn)地對(duì)地龍中砷含量的影響，以便更加方便直觀對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，從源頭上保障制劑的安全性。28 批SHG 中的總砷含量在0.84～2.21 mg/kg，平均值為1.60 mg/kg，游離的iAs 占檢出總量的89.2%～97.2%，其中As(III)最高檢出量為1.61 mg/kg，As(Ⅴ)最高為0.68 mg/kg，iAs 總量平均值為0.55 mg/kg，檢出少量的AsC、AsB、MMA，而DMA 大多未檢出。

表2 地龍中總砷和砷形態(tài)測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of total As and arsenic speciation in Pheretima

表3 SHG 中總砷和砷形態(tài)測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of total As and arsenic speciation in SHG

聚類(lèi)分析（hierarchical clustering analysis，HCA）是用于中藥化學(xué)成分與物料性質(zhì)等歸類(lèi)的一種常用方法[24-26]。為進(jìn)一步闡明地龍藥材中無(wú)機(jī)砷的分布特征，采用SIMCA 軟件對(duì)24 批地龍藥材中總砷與5 種主要砷形態(tài)、價(jià)態(tài)含量進(jìn)行聚類(lèi)分析（DMA 均未檢出）。結(jié)果（圖2）顯示，S7 與S8 聚為一類(lèi)；S22～S24 聚為一類(lèi)；S5～S6、S14～S16 與S19 聚為一類(lèi)；S1～S4、S9～S13、S17～S18 與S20～S21聚為一類(lèi)。結(jié)果顯示，除來(lái)自湖北的3 批藥材聚為一類(lèi)外，其他產(chǎn)地地龍藥材中總砷形態(tài)化合物存在一定的交互現(xiàn)象，說(shuō)明地龍藥材中普遍存在這5 種砷化合物，其在質(zhì)量傳遞過(guò)程中的變化影響可做進(jìn)一步分析。

圖2 多批次地龍藥材總砷與砷形態(tài)聚類(lèi)分析Fig.2 Cluster analysis of total arsenic and arsenic form in many batches of Pheretima herbs

主成分分析法（principal component analysis，PCA）是基于數(shù)學(xué)降維思路對(duì)原來(lái)變量重新組合成幾個(gè)能反映多數(shù)變量信息、對(duì)復(fù)雜因子下的變量進(jìn)行簡(jiǎn)單化的統(tǒng)計(jì)方法[27-28]，也是藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要手段之一。研究中采用SIMCA 軟件，對(duì)24 批地龍藥材中5 種主要砷化合物含量，進(jìn)行主成分信息提取分析。由提取到的信息（表4）可知，主成分1（PC1）與主成分2（PC2）方差貢獻(xiàn)率分別為45.98%、25.89%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)71.87%，可以解釋大部分變量對(duì)模型的影響。為進(jìn)一步分析各形態(tài)元素間的相互關(guān)系，對(duì)構(gòu)成PC1 與PC2 的5 種化合物形態(tài)做相關(guān)性分析。

表4 PCA 數(shù)學(xué)模型的提取信息Table 4 Extraction information of PCA mathematical model

由GraphPad Prism 軟件繪制得到的二維矩陣熱點(diǎn)圖（圖3）結(jié)果可知，As(Ⅲ)與MMA、As(Ⅴ)呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；MMA 與As(Ⅴ)呈顯著相關(guān)（P＜0.05）。可以發(fā)現(xiàn)，As(III)、MMA 與As(Ⅴ) 3 種形態(tài)化合物間相互關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，同時(shí)As(Ⅴ)受其他2 種化合物影響，反映出As(Ⅴ)是地龍藥材重金屬中起主要影響作用的砷化合物，也是質(zhì)量控制過(guò)程中需重點(diǎn)關(guān)注的檢測(cè)指標(biāo)。

圖3 多批次地龍藥材中5 種砷元素間二維矩陣熱點(diǎn)圖Fig.3 Two-dimensional matrix hot spot map of five arsenic elements in multiple batches of Pheretima herbs

3 討論

3.1 供試品制備方法優(yōu)化

砷形態(tài)化合物的提取應(yīng)該在不使原有形態(tài)發(fā)生改變和互相轉(zhuǎn)化的前提下進(jìn)行。目前砷形態(tài)化合物的提取方法種類(lèi)繁多，如水提取、稀硝酸提取、酶解析提取、乙酸提取等[29]。本實(shí)驗(yàn)選用硝酸人工胃液提取，通過(guò)仿生手段模擬胃腸環(huán)境，以期得到的成分更接近人體真實(shí)情況；同時(shí)參考《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則2322 中汞、砷元素形態(tài)及價(jià)態(tài)中供試品溶液的制備方法[4]，在此基礎(chǔ)上對(duì)供試品處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，考察了水浴加熱與水浴震蕩2種提取方式，并對(duì)提取時(shí)間、靜置時(shí)間進(jìn)行篩選，通過(guò)比較6 種不同砷形態(tài)、價(jià)態(tài)的化合物的含量及總量。結(jié)果表明，選擇水浴加熱時(shí)，20 h 提取的效果更充分；提取方式為水浴震蕩時(shí)，8 h 提取的較為充分；同時(shí)比較水浴加熱20 h 與水浴震蕩8 h 的提取效果，發(fā)現(xiàn)兩者效果相當(dāng)；是否需靜置2 h 的結(jié)果顯示影響較小。綜上，在達(dá)到相同的提取效果的前提下，選擇硝酸人工胃液為溶劑，水浴震蕩8 h 后直接離心能夠有效縮短提取時(shí)間，故采用該優(yōu)化后的方法。

3.2 色譜條件的選擇

基于美國(guó)Perkin Elmer 公司液相儀器的碳酸鹽體系特性，選用Hamilton，PRP-X100 陰離子交換色譜柱；與0.025 mmol/L 的磷酸二氫銨（氨水調(diào)節(jié)pH值至8.0）-水對(duì)比，1.5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液-100 mmol/L 碳酸銨溶液作為流動(dòng)相，不需調(diào)節(jié)pH 值，操作較為方便，色譜圖基線噪音較小，基線較為平穩(wěn)；且碳酸銨系統(tǒng)進(jìn)入ICP-MS 后，被分解成易揮發(fā)的氣體，能夠有效減少鹽的殘留，減輕對(duì)采樣錐的污染，進(jìn)而選擇1.5 mmol/L 磷酸氫二銨溶液和100 mmol/L 碳酸銨溶液作為流動(dòng)相。

3.3 建立地龍藥材與SHG 的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)

《中國(guó)藥典》2020 年版一部中地龍重金屬檢查項(xiàng)下，規(guī)定用通則0821 第二法檢查，含重金屬不得過(guò)30 mg/kg。該法是通過(guò)供試品溶液與硫代乙酰胺作用顯色，再與一定量的標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液同樣處理后的顏色進(jìn)行比較[30]。此法是一種半定量分析方法，僅憑肉眼判斷重金屬的含量是否超標(biāo)，準(zhǔn)確度有限，更無(wú)法分析其中含有的化合物形態(tài)。因此，有必要采用更精確的檢測(cè)方法對(duì)地龍以及復(fù)方制劑中的砷總量及價(jià)態(tài)進(jìn)行研究，以確保用藥安全與藥品的質(zhì)量可控。根據(jù)本課題組積累的多批次地龍藥材重金屬含量測(cè)定結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[20-23]，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)市售地龍總砷含量普遍偏高?？紤]地龍市場(chǎng)供應(yīng)的實(shí)際情況以及動(dòng)物藥療效的不可替代性等因素，同時(shí)參考臨床批制劑所用地龍藥材中總砷的含量情況（11.78 mg/kg），暫擬定地龍藥材中As的限度為15.00 mg/kg。結(jié)合量-值傳遞規(guī)律及制劑處方，得出SHG 中總砷的限度為2.25 mg/kg，換算公式如下：SHG 中的總砷含量＝地龍藥材中砷轉(zhuǎn)移的量＋SHG 陰性樣品砷含量＝15.00 mg/kg×250 g×52.00%/1.000 kg＋0.30 mg/kg＝2.25 mg/kg（250 g 為SHG 中地龍藥材在制劑中的處方量，1.000 kg為SHG工藝生產(chǎn)時(shí)最后的制得量）。

因此，暫擬定SHG 中總砷的限度為2.50 mg/kg，又因藥材及制劑中均以毒性較大的無(wú)機(jī)砷為主，所以暫不擬定砷形態(tài)及價(jià)態(tài)限度。

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)基于HPLC-ICP-MS 法首次對(duì)地龍藥材及SHG 中的總砷及砷形態(tài)進(jìn)行分析研究，反映了地龍藥材到SHG 制劑中的量-值傳遞規(guī)律，并對(duì)其中的地龍藥材及SHG 制定初步的總砷含量限度，以期科學(xué)評(píng)價(jià)地龍藥材及SHG 的安全性。鑒于目前課題進(jìn)展與后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排，該總砷含量值只是目前暫定的參考值，后期還將對(duì)其進(jìn)行蓄積性研究，分析其吸收排泄規(guī)律，以期建立更加準(zhǔn)確的地龍藥材總砷的安全值，為SHG 的安全性提供保障；同時(shí)建議盡快建立地龍等動(dòng)物藥及相關(guān)制劑中高毒形態(tài)與高含量（如iAs）的重金屬形態(tài)限量標(biāo)準(zhǔn)，以期保障動(dòng)物藥及相關(guān)制劑的安全性，進(jìn)而促進(jìn)中藥的可持續(xù)發(fā)展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突