謝鈴,劉雙平,毛健,3,4*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué)(紹興)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,浙江 紹興,312000)4(國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江 紹興,312000)

黃酒采用的是雙邊發(fā)酵工藝,即邊糖化邊發(fā)酵。該發(fā)酵過程復(fù)雜,不僅產(chǎn)生了乙醇和風(fēng)味物質(zhì),還生成了許多有益的功能性成分,如低聚糖、氨基酸、酚類、活性肽等,具有較好的降膽固醇、降血壓、抗氧化等功效[1]。但是發(fā)酵過程難免也會(huì)產(chǎn)生其他非喜好代謝物質(zhì),例如雜醇、生物胺、嘌呤、氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)等。黃酒中雜醇主要來自發(fā)酵過程中氨基酸降解代謝和糖代謝2種合成途徑,適量的雜醇賦予了黃酒獨(dú)特的醇香和圓潤(rùn)的酒體[2]。但雜醇的含量過高,致醉性越強(qiáng)[3]。黃酒中的生物胺主要來自于浸米和發(fā)酵工序,它是一類低分子含氮有機(jī)堿。過量的生物胺在人體內(nèi)代謝較慢,飲后會(huì)有頭痛、惡心等癥狀,影響人體健康[4]。而嘌呤是一種雜環(huán)芳香有機(jī)化合物,是核酸的重要組成成分。在酒類中普遍存在。含量過高易使體內(nèi)血尿酸升高[5]。氨基甲酸乙酯主要是由乙醇與氨甲?；衔锏姆磻?yīng)產(chǎn)生,巫景銘等[6]研究發(fā)現(xiàn),70%的氨基甲酸乙酯來源于煎酒與陳釀,微量存在于許多發(fā)酵食品和酒精飲料當(dāng)中。

活性炭是一種采用優(yōu)質(zhì)煤、木材、椰殼等為原料,經(jīng)一系列工序精制而成的吸附材料,其內(nèi)部具有晶體結(jié)構(gòu)和孔隙結(jié)構(gòu),外部擁有巨大的比表面積。具有物理和化學(xué)吸附的作用[7]。而酒類活性炭對(duì)酒體可以起到去濁、新酒催陳、去除異味及苦味、提高酒質(zhì)等功能作用。研究表明,活性炭可吸附白酒中的雜醇[2]和啤酒中的嘌呤[5],以及黃酒中的氨基甲酸乙酯[8],對(duì)酒類的后期修飾具有較為顯著的作用。而利用活性炭對(duì)生物胺的吸附研究較少,主要采用生物酶法降解[9]。總體上活性炭應(yīng)用于白酒的工藝較為廣泛,而應(yīng)用于處理黃酒的工藝研究報(bào)道較少。

本研究以提升黃酒品質(zhì)為目的,通過椰殼制成的粉狀酒類活性炭為吸附介質(zhì)靜態(tài)處理黃酒。雖然對(duì)黃酒的色澤和風(fēng)味有所損失,但是吸附了黃酒中異雜味、總酸以及雜醇、生物胺、嘌呤、氨基甲酸乙酯等非喜好代謝物質(zhì),整體提高了黃酒飲用舒適性和健康性。實(shí)驗(yàn)中對(duì)活性炭添加量、吸附溫度及吸附時(shí)間進(jìn)行探究,旨在獲得最佳的處理工藝,對(duì)黃酒工業(yè)化生產(chǎn)過程中品質(zhì)的控制提供技術(shù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紹興古越龍山半干型黃酒;酒類活性炭,平頂山市綠之原活性炭有限公司。

ZXGP-B2080電熱恒溫水浴鍋,上海智城分析儀器制造有限公司;自動(dòng)電位滴定儀,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TRACE 1300氣相色譜儀,配有質(zhì)譜檢測(cè)器,賽默飛世爾科技公司;固相微萃取PA萃取頭,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;高效液相色譜儀A1100,安捷倫科技有限公司;EL3002分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高精度分光測(cè)色儀,美國(guó)HunterLab公司;ZGDCY-12S氮吹儀,上海梓桂儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活性炭吸附工藝

各量取黃酒1 L,加入粉末活性炭配制成0、5、10、15、20、25、50 g/L溶液。在室溫下進(jìn)行靜態(tài)吸附24 h。之后使用布氏漏斗進(jìn)行3次濾膜抽濾。處理后的酒樣立刻進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè),之后放于4 ℃冰箱冷藏。綜合感官評(píng)價(jià),得出活性炭的最適添加量,再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 色度測(cè)定

將黃酒樣品裝入石英比色皿后,使用色度儀進(jìn)行色度測(cè)定,測(cè)試模式為透射,讀數(shù)以色度空間值L*、a*和b*表示,其中L*為明度(色澤的明亮度),a*為紅綠度(正數(shù)為紅色,負(fù)數(shù)為綠色),b*為黃藍(lán)度(正數(shù)為黃色,負(fù)數(shù)為藍(lán)色),重復(fù)3次[10]。

1.2.3 感官評(píng)價(jià)

綜合文獻(xiàn)[11],制定如表1所示評(píng)分表。邀請(qǐng)9位具有多年黃酒品鑒資格人員組成感官小組,對(duì)樣品進(jìn)行隨機(jī)編號(hào),去掉最高分和最低分,取平均分,滿分為100分。

表1 感官評(píng)價(jià)表Table 1 Sensory evaluation

1.2.4 酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮檢測(cè)

酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮檢測(cè)均依據(jù)：GB/T 13662—2018《黃酒》。

1.2.5 關(guān)鍵酯類物質(zhì)檢測(cè)

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(headspace-solid phase micro extraction- gas chromatography- mass spectrometry,HS-SPME-GC/MS)技術(shù),以10 μL 2-辛醇(10 mg/L)作為內(nèi)標(biāo),同時(shí)測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和代表性酯類物質(zhì)成分的峰面積和相對(duì)響應(yīng)值得出含量。具體參見王培璇等[12]的方法。

1.2.6 相關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

雜醇含量的的檢測(cè)參考參見黃桂東等[13]的方法;生物胺檢測(cè)參見國(guó)標(biāo)GB/T5009.208—2016《食品中生物胺含量的測(cè)定》;嘌呤的檢測(cè),采用離子交換固相萃取-反相高效液相色譜法,參見劉鎮(zhèn)等[14];氨基甲酸乙酯的檢測(cè),采用HS-SPME/GC-MS法,參見劉俊等[15]。

1.2.7 工藝優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)1.2.3節(jié)的結(jié)果,篩選出最適的活性炭添加量進(jìn)行下一步工藝優(yōu)化。分別置于不同溫度：4、15、25、35、45、55、65 ℃,不同時(shí)間：3、6、9、12、15、18、21、24 h進(jìn)行吸附。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行檢驗(yàn),將統(tǒng)計(jì)結(jié)果提交進(jìn)行SPSS 25.0方差分析(ANOVA),然后對(duì)概率低于0.05的平均值進(jìn)行比較(Tukey)。使用Origin 2021和Microsoft Excel軟件生成統(tǒng)計(jì)分析和圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 色度評(píng)價(jià)

由表2可知,與未添加活性炭的原酒樣相比,隨著活性炭添加量的增加,酒樣的明亮度逐漸增加,綠色和黃色逐漸減少,說明黃酒逐漸變淺色透明化。可見活性炭的添加對(duì)原酒的色度影響較大,其中對(duì)于黃色影響最大。當(dāng)添加量達(dá)到50 g/L時(shí),黃酒呈現(xiàn)近乎無色透明狀態(tài)。當(dāng)活性炭添加量為5 g/L和10 g/L時(shí),其明度無明顯差異,a*和b*值出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。

表2 色度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Chromaticity evaluation results

2.2 感官評(píng)價(jià)

表3感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明,10 g/L活性炭添加量的酒樣得分比5 g/L活性炭量的酒樣得分略高,吸附了該黃酒輕微的異雜味,例如塑料味、酸嗖味、爛曲味等;酒樣彼此間色度差異不大。因此選擇10 g/L活性炭添加量作為后續(xù)研究對(duì)象進(jìn)行探究。經(jīng)10 g/L活性炭處理后酒樣顏色呈禾稈黃色,香氣濃郁度雖比原酒略有降低,但是削減了黃酒中不愉悅的異雜味,使得原酒中的米香、曲香、醇香與酯香表現(xiàn)得更加純粹,整體評(píng)價(jià)較高。

表3 感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results

2.3 關(guān)鍵酯類物質(zhì)檢測(cè)

對(duì)原酒樣、10 g/L與50 g/L活性炭添加量的酒樣進(jìn)行關(guān)鍵酯類定量的對(duì)比分析,結(jié)果如圖1所示,10 g/L活性炭添加后黃酒的酯類物質(zhì)稍有損失,但是能整體保留80%左右的風(fēng)味物質(zhì)骨架。王國(guó)安[16]使用酒類專用活性炭對(duì)白酒的酒尾進(jìn)行異雜味去除,也發(fā)現(xiàn)還有很多呈味呈香物質(zhì)被保留。而50 g/L活性炭添加量對(duì)黃酒中酯類物質(zhì)吸附過多,其中乳酸乙酯、乙酸乙酯的含量損失最多,且處理后的黃酒風(fēng)味寡淡。

圖1 關(guān)鍵酯類風(fēng)味物質(zhì)雷達(dá)圖

2.4 總酸與氨基酸態(tài)氮檢測(cè)結(jié)果

圖2-a總酸含量以10 g/L的活性炭添加量為臨界點(diǎn),添加量<10 g/L時(shí),總酸含量迅速降低;減少了黃酒酸度過高引起的刺激感?；钚蕴刻砑恿?10 g/L時(shí),總酸過低使得酒體失衡。當(dāng)活性炭添加量為10 g/L時(shí),氨基酸態(tài)氮損失不大,意味著對(duì)黃酒的質(zhì)量等級(jí)影響較小[17]。

a-不同活性炭添加量,室溫下吸附24 h;b-10 g/L活性炭添加量,不同溫度吸附24 h;c-10 g/L活性炭添加量,室溫下吸附不同時(shí)間圖2 單因素試驗(yàn)對(duì)總酸與氨基酸態(tài)氮含量的影響

圖2-b在不同吸附溫度條件下,活性炭吸附溫度在25～45 ℃總酸與氨基酸態(tài)氮維持在平穩(wěn)水平,為合理溫度區(qū)間。但最低溫和高溫吸附處理對(duì)酒樣中總酸吸附無明顯效果,且氨基酸態(tài)氮的損失較大。圖2-c不同吸附時(shí)間顯示,活性炭添加3 h后總酸與氨基酸態(tài)氮的含量幾乎不變。

2.5 雜醇檢測(cè)結(jié)果

圖3-a表明,隨著活性炭用量增加,黃酒中雜醇逐漸下降。添加10 g/L活性炭的黃酒雜醇相對(duì)于原酒樣約降低了75 mg/L;添加50 g/L活性炭的黃酒雜醇含量約降低了266 mg/L,降低幅度巨大。其中對(duì)苯乙醇的吸附量最多,對(duì)正丙醇的吸附量最少。

a-不同活性炭添加量,室溫下吸附24 h;b-10 g/L活性炭添加量,不同溫度吸附24 h;c-10 g/L活性炭添加量,室溫下吸附不同時(shí)間圖3 單因素試驗(yàn)對(duì)雜醇含量的影響

圖3-b表明,當(dāng)吸附溫度升高,黃酒中雜醇含量變化為先降低后升高。以35 ℃為界,4～35 ℃時(shí)活性炭對(duì)于雜醇吸附量逐漸遞增;當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃以上時(shí),溫度增加了分子間的熱運(yùn)動(dòng),活性炭吸附加快的同時(shí)解吸附也變快,雜醇含量略有上升。圖3-c表明,3～6 h后活性炭對(duì)雜醇的吸附即可達(dá)到飽和量。

2.6 生物胺檢測(cè)結(jié)果

如圖4-a所示,隨著活性炭添加量逐漸增大,黃酒中的生物胺幾乎呈線性下降的趨勢(shì),說明活性炭對(duì)生物胺具有明顯吸附作用。當(dāng)活性炭的添加量達(dá)到50 g/L時(shí),總生物胺含量從原來95.59 mg/L降低至51.02 mg/L。該酒樣中酪胺含量較多,活性炭對(duì)其吸附量也最大。對(duì)其他幾種生物胺均為少量吸附。生物胺吸附是由其芳香環(huán)的π系統(tǒng)與碳表面六邊形相互作用引起的[18]。

圖4-b所示,當(dāng)溫度較低時(shí),活性炭對(duì)生物胺的吸附力較小。逐漸升高溫度,活性炭吸附力越強(qiáng),溫度在25 ℃和35 ℃時(shí)吸附最佳,兩者之間無顯著性差異。超過35 ℃之后,可能部分生物胺被解吸附,總生物胺含量反而上升。圖4-c所示,9 h以后10 g/L活性炭添加量達(dá)到吸附最大值,黃酒中的生物胺不再被吸附。

2.7 嘌呤檢測(cè)結(jié)果

圖5-a表明,隨著活性炭添加量逐漸增大,黃酒中總嘌呤含量逐漸降低,整體呈線性下降。當(dāng)活性炭的添加量>15 g/L時(shí),總嘌呤含量急劇下降。達(dá)到50 g/L活性炭添加量時(shí),嘌呤的含量?jī)H為35.31 mg/L。其中該活性炭對(duì)于黃酒中黃嘌呤的吸附量最大。

a-不同活性炭添加量,室溫下吸附24 h;b-10 g/L活性炭添加量,不同溫度吸附24 h;c-10 g/L活性炭添加量,室溫下吸附不同時(shí)間圖5 不同活性炭添加量對(duì)嘌呤含量的影響

圖5-b表明,可以看出當(dāng)溫度較低時(shí),活性炭對(duì)嘌呤的吸附量同樣較低。逐漸升高溫度,活性炭吸附力越強(qiáng)。25 ℃和35 ℃,活性炭吸附效果最佳,說明該溫度區(qū)間比較合適。與王海容等[19]研究活性炭吸附啤酒中嘌呤的研究結(jié)果一致。此時(shí)總嘌呤含量維持在80 mg/L左右,含量比原酒低16 mg/L左右。圖5-c表明,吸附時(shí)間>3 h后對(duì)于嘌呤含量的變化幾乎沒有影響,說明活性炭對(duì)嘌呤的吸附速度較快。

嘌呤是一類帶堿性有2個(gè)相鄰碳氮環(huán)的含氮有機(jī)大分子物質(zhì),含有極性基團(tuán),可被一些吸附劑作用[20]。對(duì)于有機(jī)物而言,其相對(duì)分子質(zhì)量越大、沸點(diǎn)越高,不飽和性越大,則越易被吸附[7]。可見活性炭對(duì)大分子嘌呤類物質(zhì)的吸附較快,效果較好。

2.8 氨基甲酸乙酯檢測(cè)結(jié)果

圖6-a顯示,由于EC的含量相對(duì)較低,5 g/L活性炭添加量對(duì)EC的吸附作用甚微,當(dāng)添加量在10 g/L～20 g/L時(shí)對(duì)EC的吸附效果最為明顯,隨后到達(dá)飽和狀態(tài)。

a-不同活性炭添加量,室溫下吸附24 h;b-10 g/L活性炭添加量,不同溫度吸附24 h;c-10 g/L活性炭添加量,室溫下吸附不同時(shí)間圖6 單因素試驗(yàn)對(duì)氨基甲酸乙酯含量的影響

圖6-b顯示,隨著溫度升高,活性炭對(duì)EC的吸附作用越來越大,黃酒中EC含量幾乎呈線性下降。因此推測(cè)此吸附過程為化學(xué)吸附,為吸熱反應(yīng)。有別于活性炭對(duì)于其他物質(zhì)的物理吸附,為放熱反應(yīng)。溫度升高反而更有利于EC的吸附[15]。PARK等[21]也通過使用活性炭簡(jiǎn)單過濾降低飲料酒中的EC含量。圖6-c顯示,當(dāng)吸附時(shí)間>9 h,EC的含量幾乎不變。

2.9 活性炭過濾最佳處理工藝

根據(jù)表3感官評(píng)價(jià)結(jié)果得出活性炭的最佳添加量為10 g/L;以上不同物質(zhì)的最適吸附溫度不同,綜合考慮選擇吸附溫度為35 ℃;關(guān)系到時(shí)間成本,確定吸附時(shí)間為9 h。表4為原酒樣與最佳工藝處理的前后綜合指標(biāo)對(duì)比情況。

表4 酒樣處理前后綜合指標(biāo)對(duì)比Table 4 Comprehensive comparison parameters of Huangjiu before and after treatment

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)研究表明,黃酒經(jīng)過該活性炭過濾吸附后,其中的總酸、雜醇、生物胺、嘌呤、氨基甲酸乙酯均有不同程度的降低。確定了最佳活性炭使用工藝條件為：10 g/L活性炭添加量,35 ℃吸附溫度,9 h吸附時(shí)間。在此優(yōu)化條件下,各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示,總酸從原來的5.83 g/L降低至4.20 g/L,氨基酸態(tài)氮損失較少?？傠s醇從原來的520.99 mg/L降低至446.88 mg/L,吸附率為14.22%。總生物胺從原來的95.59 mg/L降低至65.86 mg/L,吸附率為31.10%。總嘌呤從原來的103.47 mg/L降低至74.73 mg/L,吸附率為27.78%。氨基甲酸乙酯的含量從原來的203.38 μg/L降低至140.80 μg/L,吸附率為30.77%?；钚蕴刻砑恿繛?0 g/L時(shí),吸附率排序?yàn)樯锇?氨基甲酸乙酯>嘌呤>雜醇。吸附時(shí)間上得出,吸附速率排行為嘌呤>雜醇>生物胺>氨基甲酸乙酯,有可能各物質(zhì)之間存在競(jìng)爭(zhēng)吸附的作用。

本試驗(yàn)開發(fā)了黃酒后期處理過程中添加活性炭的工藝技術(shù)。在盡量保持黃酒色度及原風(fēng)味骨架的前提條件下,簡(jiǎn)單高效地去除了不愉悅的異雜味,降低了黃酒生產(chǎn)過程中不可避免產(chǎn)生的非喜好代謝物質(zhì),提高了黃酒飲用健康性和舒適性。另外亦可以增大活性炭的添加量,把處理后的黃酒作為一種后期調(diào)配基酒使用。