田 雨，周鵬飛，吳海平

中輕檢驗認證有限公司，北京 100016

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又稱綠膿桿菌，為革蘭氏陰性桿菌，屬于專性需氧非發(fā)酵菌類假單胞菌屬，廣泛分布于自然界的水、土壤、空氣中，存在于人和動物的皮膚、肌體、呼吸道和消化道中。當該菌在特定條件下的數量超過人體正常的穩(wěn)態(tài)調節(jié)范圍時，會引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病，是一種常見的條件致病菌。鑒于銅綠假單胞菌的致病性，我國飲用水標準GB 19298-2014《食品安全國家標準包裝飲用水》和飲用礦泉水標準GB 8537-2018《食品安全國家標準飲用天然礦泉水》對銅綠假單胞菌的限量為每250 mL 水樣中銅綠假單胞菌不得檢出。

目前對飲用水中銅綠假單胞菌的檢測，主要使用GB 8538-2022《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》[1]中的濾膜法（以下簡稱GB 8538-2022 法），即觀察CN 瓊脂平板上生長的可疑菌落的形態(tài)并對其進行生化反應確證，確認該平板上是否存在銅綠假單胞菌陽性菌株。除此之外，一些行業(yè)檢測標準及研究中還兼用其他檢驗方法[2-4]來確認菌株是否為銅綠假單胞菌。其中，細菌生化鑒定系統(tǒng)是常見的菌株鑒定手段，其中常用的鑒定系統(tǒng)包括HK-MID 細菌生化鑒定系統(tǒng)和VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)[5]。與按細菌生化反應來鑒定其種屬的檢驗方法相比，基因測序更為準確[6]。而在以基因測序的方法鑒定銅綠假單胞菌的研究中，除了選擇某段特定基因序列設計的引物進行特異性擴增后再測序外[7]，16S rRNA 基因測序也被廣泛運用[8-9]。在以往應用細菌生化鑒定系統(tǒng)和基因測序等眾多手段檢測銅綠假單胞菌的研究中，大多數研究的重點在于檢驗方法的準確性與時效性，便于選擇更準確、高效的方法來鑒別目標菌株，但對GB 8538-2022 方法在CN 瓊脂平板上分離出的非銅綠假單胞菌的細菌沒有過多深入研究。本研究對采用GB 8538-2022 法在CN 瓊脂平板上生長的10株可疑菌落的菌株進行了檢測，同時采用HK-MID細菌生化鑒定系統(tǒng)、VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)和16S rRNA 基因測序進行了進一步的鑒定研究，最終以16S rRNA 基因測序的結果作為判定依據，來確認菌株的種屬。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用菌株

標準菌株：銅綠假單胞菌ATCC 27853、銅綠假單胞菌CICC 21630，均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；樣品菌株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 均來自飲用水樣品，用GB 8538-2022 法將其從CN 瓊脂平板上分離，目前保藏于國家食品監(jiān)督檢驗中心微生物實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

CN 瓊脂假單胞菌瓊脂基礎培養(yǎng)基、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、乙酰胺肉湯、鈉氏試劑、氧化酶試劑，均購自北京陸橋技術股份有限公司；十六烷三甲基溴化銨瓊脂、乙酰胺瓊脂、SCDLP 液體培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；16S rRNA 基因通用引物27F （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’） 和1492R （5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）：由華大基因合成；PCR 擴增及凝膠電泳所用試劑，均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3 儀器及耗材

WFH-203B 三用紫外分析儀產自上海馳唐電子有限公司；HK-MID 細菌生化鑒定系統(tǒng)：配GN A+B 革蘭氏陰性桿菌鑒定條產自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)：配套革蘭氏陰性細菌鑒定卡（VITEK 2 GN卡）以及生理鹽水和一次性透明塑料試管均產自法國梅里埃公司；DensiCHEK plus 比濁儀產自法國梅里埃公司；BioDrop uLite 超微量核酸蛋白測定儀產自英國柏點公司；TProfessional Trio PCR 儀產自德國耶拿分析儀器股份公司；JY300C 電泳儀及電泳槽產自北京君意東方電泳設備有限公司；QUANTUMST5 全自動凝膠成像系統(tǒng)產自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化

將實驗室保藏的標準菌株及樣品菌株，分別劃線接種于假單胞菌瓊脂基礎培養(yǎng)基/CN 瓊脂、十六烷三甲基溴化銨瓊脂和乙酰胺瓊脂三種不同的培養(yǎng)基平板上，36 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察

觀察三種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，必要時將其置于紫外線下觀察，判斷菌落是否存在熒光。對于三種培養(yǎng)基上生長的疑似菌落，按照GB 8538-2022 法進行生化反應確證試驗。

1.2.3 生化反應確證試驗

產氨試驗：將CN 瓊脂上發(fā)熒光、非藍色且非綠色的菌落，或不發(fā)熒光、紅褐色菌落純培養(yǎng)物接種到乙酰胺液體培養(yǎng)基中，接種乙酰胺肉湯，36 ℃培養(yǎng)24 h 后滴加1～2 滴鈉氏試劑，10 s 內檢查試管的顏色變化，若表現(xiàn)出從黃色到磚紅色的顏色變化，則結果為陽性，否則為陰性。

42 ℃生長試驗：將CN 瓊脂上發(fā)熒光、非藍色且非綠色菌落的純培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)瓊脂平板上，42℃培養(yǎng)48 h，能生長的為陽性結果，否則為陰性。

1.2.4 HK-MID 細菌生化鑒定系統(tǒng)

氧化酶試驗：取2～3 滴氧化酶試劑于無菌平皿內的潔凈濾紙上，用一次性塑料接菌環(huán)挑取培養(yǎng)物涂抹在濾紙上，10 s 內顯示為深藍紫色的為陽性反應。

GN A+B 革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條進行鑒定：挑取單菌落至營養(yǎng)瓊脂平板上，劃線分離，36 ℃培養(yǎng)24 h 后，自營養(yǎng)瓊脂平板上挑取1 個新鮮菌落至5 mL 無菌0.85%的氯化鈉溶液中，混合均勻。將制得的菌懸液滴加至GN A+B 的鑒定試劑條上，36℃培養(yǎng)48 h 后觀察并記錄相關反應，在Microgen ID軟件上讀取鑒定結果。

1.2.5 VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)

將菌液滴加至HK-MID 細菌生化鑒定系統(tǒng)的同時，再從36 ℃培養(yǎng)24 h 的營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單菌落，放入含有3 mL0.9%氯化鈉溶液的一次性透明塑料試管中，制成濁度為0.48～0.61 的均勻菌懸液。將試管放置在VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)的載卡架上，將VITEK 2 GN 卡導管插入菌懸液中。按VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)的操作說明書，對測菌懸液進行充填、裝載，并在VITEK 2 Systems 軟件中進行設定，次日觀察鑒定結果。

1.2.6 16S rRNA 基因測序

自營養(yǎng)瓊脂平板上挑取1 個新鮮菌落至SCDLP 液體培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁。按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書上的操作步驟，提取標準菌株和樣品菌株的DNA。在確認DNA純度和濃度均符合PCR 擴增要求后，使用16S rRNA 基因通用引物27F 和1492R 對菌株的DNA進行PCR 擴增。PCR 反應體系為：引物27F 和1492R 各1 μL，10×Easy Taq Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，High Pure dNTP （2.5mM）2 μL，Bovine Serum Albumin 0.3 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.2 μL，DNA 模板2 μL，DNase/RNase-free Deionized water 16 μL，合計總體積25 μL。PCR 反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，該流程共循環(huán)30 次；最后72 ℃延伸10 min。擴增完成后，用凝膠電泳檢測擴增產物，并將具有16S rRNA 基因片段的目的條帶送至華大基因進行基因測序。

2 結果與分析

2.1 標準菌株及樣品菌株的菌落形態(tài)及初步生化反應確證試驗結果

目前標準方法中銅綠假單胞菌的選擇性培養(yǎng)基主要為CN 瓊脂[1,10]、十六烷三甲基溴化銨瓊脂[11-12]和乙酰胺瓊脂[11]，如果樣品菌株僅能在CN 瓊脂上生長，而不能在十六烷三甲基溴化銨瓊脂、乙酰胺瓊脂培養(yǎng)基上生長，則表明CN 瓊脂的選擇性較差。對10 個樣品菌株及作為陽性對照的2 個銅綠假單胞菌標準菌株的菌落形態(tài)進行觀察及初步生化確證試驗的結果見表1。

表1 標準菌株和樣品菌株的菌落形態(tài)及初步生化試驗結果

由表1 可知，2 個標準菌株和10 個樣品菌株均能在三種培養(yǎng)基上生長，說明本試驗中CN 瓊脂培養(yǎng)基的選擇性較好。其中只有2 個標準菌株和樣品菌株9、10 的菌落形態(tài)符合GB 8538-2022 法中銅綠假單胞菌的特征形態(tài)，結合產氨試驗和42 ℃生長試驗結果，可判定樣品菌株9、10 為銅綠假單胞菌，樣品菌株1～8 中的疑似菌落為非銅綠假單胞菌。

2.2 標準菌株及樣品菌株氧化酶試驗結果

按HK-MID 細菌生化鑒定系統(tǒng)說明書的要求，首先對待測菌株進行氧化酶試驗以確定使用鑒定試劑條的種類。10 個樣品菌株及2 個標準菌株的氧化酶試驗結果見表1。由表1 可知，10 個樣品菌株及2個標準菌株的氧化酶試驗結果均為陽性，因此選擇GN A+B 革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條進行后續(xù)鑒定。

2.3 標準菌株及樣品菌株的PCR 產物凝膠電泳結果

為了知曉PCR 產物是否含有目的基因片段，需要先對其進行凝膠電泳測定，10 個樣品菌株及2 個標準菌株的PCR 產物凝膠電泳結果見圖1。

圖1 標準菌株和樣品菌株PCR 產物的凝膠電泳圖

由圖1 可知，樣品菌株1～10 及2 個標準菌株的PCR 產物在1 500 bp 處均有清晰明亮的條帶，證明已成功擴增出了可用于測序的16S rRNA 基因片段，可進行下一步的基因測序。

2.4 標準菌株及樣品菌株的HK-MID 細菌生化鑒定系統(tǒng)、VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)及16S rRNA 基因測序的鑒定結果對比

為了確認10 個樣品菌株的種屬，運用HK-MID細菌生化鑒定系統(tǒng)、VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)及16S rRNA 基因測序三種不同的微生物鑒定方法，對樣品菌株進行檢測，并以標準菌株ATCC 27853 和CICC 21630 為陽性對照。結果見表2。

表2 標準菌株及樣品菌株的三種鑒定方法鑒定結果對比

由表2 可知，經過上述三種鑒定方法的檢測，標準菌株ATCC 27853、CICC 21630 和樣品菌株9、10均被判定為銅綠假單胞菌，且可能性都在90%以上，結果與GB 8538-2022 法的判定結果一致。說明三種鑒定方法均可用于鑒定飲用水中的銅綠假單胞菌。

然而以16S rRNA 基因測序結果作為最終判定依據進行比較后發(fā)現(xiàn)，HK-MID 細菌生化鑒定系統(tǒng)將樣品菌株1、4～8 共六株菌均被誤判為莫拉氏菌屬（Moraxella.spp）。同時，將屬于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的樣品菌株2、3 誤判為銅綠假單胞菌。造成該現(xiàn)象的原因推測為：廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供的《HK-MID 革蘭氏陰性桿菌生化鑒定系統(tǒng)使用說明書》的數據表中，沒有代爾夫特菌屬（Delftia） 和嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的相關數據，導致樣品菌株1、4～8 被誤判為莫拉氏菌屬。

與HK-MID 細菌生化鑒定系統(tǒng)相比，梅里埃公司的VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)不僅可明確將食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans）、嗜麥芽窄食單胞菌與莫拉氏菌屬區(qū)分開，還正確鑒定出了樣品菌株2、3 為惡臭假單胞菌。對于樣品菌株1，VITEK 2 Compact 的鑒定結果為食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans），而16S rRNA 基因測序的結果顯示該菌種為Delftia sp. WY8、Delftia lacustris 和Delftia tsuruhatensis，雖然菌種不同，但均為代爾夫特菌屬細菌?？梢?，VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)的檢測范圍更加廣泛，鑒定結果也更精準。

2.5 標準菌株及樣品菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

為了更直觀地表達上述細菌之間的親緣關系，首先將2 個標準菌株和10 個樣品菌株用16S rDNA的測序結果在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對，得出了具體的所屬菌種。并采用MEGA 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)其結果，見圖2。

圖2 樣品菌株（sample）和標準菌株（Pseudomonas putida）的系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖2 可以看出，同屬銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的標準菌株ATCC 27853、CICC 21630 和樣品菌株9、10，與同屬惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的樣品菌株2、3 的親緣關系最近，與同屬嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）的樣品菌株4～8 的親緣關系次之，而與代爾夫特菌屬（Delftia）樣品菌株1 的親緣關系最遠。

3 結論與討論

從研究結果可知，由于HK-MID 細菌生化鑒定系統(tǒng)中的GN A+B 革蘭氏陰性桿菌鑒定條的生化反應孔數量較少、判定信息不足、數據庫細菌種類不夠全面等，導致該系統(tǒng)的誤判幾率很大，而VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)包含更多詳細的生化反應信息和精密儀器，其鑒定結果更加精確，可用來進行最終的菌株判定。同時，VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)及16S rRNA 基因測序均可以對疑似菌株進行精確鑒定。

值得注意的是，這些疑似銅綠假單胞菌的菌株中包含食酸代爾夫特菌、惡臭假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌等細菌。其中，食酸代爾夫特菌可能會使免疫力低下的病患產生傷口感染及多種炎癥[13]；惡臭假單胞菌也是條件致病菌[7]，且發(fā)生過醫(yī)院感染的情況[14]；嗜麥芽窄食單胞菌也會引起多種炎癥與感染[15-19]，其中最常見的是血液和呼吸道感染[20-23]，這兩種感染的發(fā)病率和死亡率較高[24-25]。因此，出于對消費者健康和公共衛(wèi)生安全的考慮，在包裝飲用水、礦泉水乃至水源水中，除了銅綠假單胞菌之外，其他條件致病菌（如代爾夫特菌屬、惡臭假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等）也應當受到重視，相關部門適當監(jiān)督并控制這些細菌的造成污染非常有必要。