傅小玲， 張 聰， 叢 夢， 萬如風(fēng)， 李偉麗， 吳 韜

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

郫縣豆瓣醬是我國著名的傳統(tǒng)調(diào)味品，其在不同發(fā)酵時期具有顯著不同的香氣特征[1]。 豆瓣醬中香氣物質(zhì)一部分來自原料，另一部分則由豆瓣醬中蛋白質(zhì)類成分在微生物發(fā)酵過程中生成[2]。 目前市場上郫縣豆瓣醬的品質(zhì)參差不齊，以次充好的現(xiàn)象時有發(fā)生，因此有必要根據(jù)不同發(fā)酵時期的香氣物質(zhì)差異，采用儀器分析手段對郫縣豆瓣醬進(jìn)行快速分級。 傳統(tǒng)的香氣物質(zhì)檢測方法主要采用氣相質(zhì)譜技術(shù)，以評估發(fā)酵時間對郫縣豆瓣醬香氣的影響[3-6]。然而，在氣相色譜分離過程中，存在著樣品預(yù)處理步驟煩瑣、 色譜柱老化和分離時間較長等弊端，不適合進(jìn)行香氣物質(zhì)的高通量快速鑒定。

流過式介質(zhì)電離質(zhì)譜（SICRIT-MS）是一種高通量質(zhì)譜檢測技術(shù)，結(jié)構(gòu)如圖1 所示。 它利用電極放電瞬間激發(fā)和電離質(zhì)譜入口端的氣態(tài)化學(xué)物質(zhì)，來實(shí)時識別流入的化學(xué)成分， 極大地簡化了分析步驟，縮短了檢測時間。 該技術(shù)的優(yōu)勢還包括可以同時電離中弱極性、非極性的痕量及超痕量的靶向或非靶向標(biāo)志物分子，大大提升樣品分子檢測覆蓋率[7]。

圖1 SICRIT-MS 結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Structural diagram of SICRIT-MS

作者以不同發(fā)酵時期的郫縣豆瓣醬為樣本模型，采用SICRIT-MS 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，并利用代謝組學(xué)手段對不同發(fā)酵時期的郫縣豆瓣醬特征香氣物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析[8]，期望建立一種快速、高效、準(zhǔn)確地評價郫縣豆瓣醬品質(zhì)的方法，為實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)、智能和客觀的品質(zhì)判定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料豆瓣醬 （原料時期）、 曲瓣子 （曲瓣子時期）、后發(fā)酵（3、6、12 個月）樣品：成都市旺豐食品有限責(zé)任公司；高純氦氣（純度99.99%）、高純氮?dú)猓兌?9.99%）：成都龍?zhí)┕I(yè)氣體有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SICRIT?SC-20 離子源： 德國Plasmion 公司；AB SCIEX 3500 三重四級桿質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司；2020 NX GC-MS 儀：日本島津公司；SPME 手動進(jìn)樣手柄： 上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；HHS-21-4 電熱恒溫水浴鍋： 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備及前處理將不同發(fā)酵時期豆瓣醬樣品，經(jīng)凍干，打磨成粉，于-18 ℃保藏。測試時稱取適量凍干粉末樣品于EP 管中。

1.3.2 SICRIT-MS 分析SICRIT-MS 分析系統(tǒng)是由一個SICRIT 離子源串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀組成。 將裝有樣品的EP 管打開，放置于SICRIT 離子源入口端3 s 進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。 SICRIT 條件：放電高壓1 500 V。 質(zhì)譜條件：正、負(fù)離子模式，去簇電壓（declustering potential，DP）40 V，碰撞能量（CE）10 V。 每個樣品進(jìn)行5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用Marker View 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對齊、保留時間校正和峰面積提取。 在強(qiáng)度閾值為50、相對分子質(zhì)量偏差為0.01、 保留時間為0.2 s 的條件下收集峰值。 以NIST17 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行輔助定性分析，確定成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式及名稱。 處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析,進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（PCA）和有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。 將處理后的數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），同時滿足P＜0.05 和VIP＞1.0 的化合物為不同樣本的差異代謝化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 SICRIT-MS 的參數(shù)優(yōu)化

當(dāng)揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)過介質(zhì)通路時，高壓放電產(chǎn)生的分子離子會瞬間被質(zhì)譜檢測[9]。 為了提高檢測靈敏度，需要對質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。由于DP 會顯著影響化合物電離效率[10]，因此通過測量樣品在正、負(fù)離子兩種模式下一級離子的響應(yīng)強(qiáng)度來評價DP 對樣品檢測的影響。圖2（a）為樣品在正離子模式下一級離子的響應(yīng)強(qiáng)度，DP 在20~40 V 時呈現(xiàn)上升趨勢，DP為40 V 時，響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最高；DP 大于40 V 后呈現(xiàn)下降趨勢。圖2（b）為樣品在負(fù)離子模式下一級離子的響應(yīng)強(qiáng)度，DP 為20~30 V 時呈現(xiàn)上升趨勢；DP為30~40 V 時變化不明顯，趨于穩(wěn)定狀態(tài)；DP 為40~60 V 時呈現(xiàn)下降趨勢，且在DP 大于40 V 后離子響應(yīng)強(qiáng)度迅速下降。 在正、負(fù)離子模式下一級離子的響應(yīng)強(qiáng)度均在DP 為40 V 時最佳。 因此，選擇40 V 作為最佳的去簇電壓。

圖2 SICRIT-MS 測定豆瓣醬方法優(yōu)化Fig. 2 Optimization of method for determination of broad-bean paste by SICRIT-MS

2.2 香氣物質(zhì)的主成分分析

主成分分析（PCA）是一種常見的數(shù)據(jù)分析方式[11]，把多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化成少數(shù)綜合指標(biāo)的一種多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法[12]。 如圖3 所示，PC1、PC2 和PC3 分別代表3 個主成分，不同顏色散點(diǎn)表示不同發(fā)酵時期豆瓣醬。 從圖中可以看，主成分分別解釋了正離子模式和負(fù)離子模式下總變異的64.6%和73.7%。 在正離子模式3D-PCA 得分圖中可以看到原料豆瓣醬和曲瓣子較接近（見圖3（a）），說明兩者在揮發(fā)性物質(zhì)上有一定相似性。 后發(fā)酵12 個月樣品則與3 個月以及6 個月樣品有明顯的區(qū)分， 后發(fā)酵12 個月樣品揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生了顯著變化。 從負(fù)離子模式3D-PCA 得分圖中可以看到（見圖3（b）），原料豆瓣醬與曲瓣子沒有顯著的區(qū)分，說明在這兩個發(fā)酵時期的豆瓣醬中揮發(fā)性物質(zhì)有一定的相似性。 后發(fā)酵3、6、12 個月樣品有明顯的分離， 其中后發(fā)酵12 個月樣品依然區(qū)分明顯。

圖3 SICRIT-MS 正、 負(fù)離子模式下豆瓣醬樣品的3DPCA 得分圖Fig. 3 PCA score of broad-bean paste samples under positive and negative ion modes of SICRIT-MS

本實(shí)驗(yàn)中，ESI－數(shù)據(jù)生成的PCA 模型的質(zhì)量（R2=0.834，Q2=0.587） 要優(yōu)于ESI+（R2=0.735，Q2=0.462）。 根據(jù)正、負(fù)離子模式下PCA 得分圖可以看出豆瓣醬在發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵時間的延長其揮發(fā)性物質(zhì)有明顯的變化，通過后期的不斷發(fā)酵才形成了豆瓣醬的獨(dú)特風(fēng)味。

2.3 SICRIT-MS 鑒定豆瓣醬的差異特征化合物

使用正交偏最小二乘判別分析 （OPLS-DA）生成S-plot 圖，對數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步挖掘[13]。在建立模型時預(yù)先提供了豆瓣醬的分組信息，充分提取豆瓣醬在5 個發(fā)酵時期樣本間的差異信息，能夠更加有效降低組內(nèi)個體差異對模型的影響，有利于排除在發(fā)酵過程中由無關(guān)變量引起的組間差異放大，同時增強(qiáng)模型的解釋能力。

通過SICRIT-MS 數(shù)據(jù)獲得的OPLS-DA 得分圖如圖4 所示。 在OPLS-DA 中，3 個主成分分別解釋了正離子模式和負(fù)離子模式下總變異的64.8%和73.7%。

圖4 SICRIT-MS 正、負(fù)離子模式下豆瓣醬樣品的OPLSDA 得分圖Fig. 4 OPLS-DA score of broad-bean paste samples under positive and negative ion modes of SICRIT-MS

通過參數(shù)指標(biāo)對模型質(zhì)量進(jìn)行評估，ESI+模式下R2y（cum）=0.957，ESI-模式下R2y（cum）=0.934，以及ESI+模式下Q2（cum）=0.925，ESI-模式下Q2（cum）=0.896， 說明在兩種采集模式下所得數(shù)據(jù)建立的OPLS-DA 模型都擬合了較多的信息， 具有良好的預(yù)測能力，且Q2均大于0.850，進(jìn)一步說明了模型的可靠性與預(yù)測性。

為了更加有效地防止發(fā)生過度擬合的情況，運(yùn)用置換檢驗(yàn)來驗(yàn)證模型的有效性[14]。 圖5 為200 次循環(huán)迭代置換檢驗(yàn)的結(jié)果。 通過原始模型與置換檢驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，ESI+模式下，Q2=-0.424，ESI－模式下，Q2=-0.407， 最右側(cè)Q2大于左側(cè)任何一個y變量隨機(jī)排列模型的Q2，并且在y軸上的截距小于0，則認(rèn)為模型質(zhì)量較好，沒有出現(xiàn)過擬合情況[15]。Q2的回歸直線與y軸的交點(diǎn)在負(fù)半軸，可以說明建立的OPLS-DA 模型是穩(wěn)健可靠的。

圖5 OPLS-DA 模型的200 次循環(huán)迭代置換檢驗(yàn)結(jié)果Fig. 5 Results of 200 cyclic permutation tests of OPLSDA model

為了研究不同發(fā)酵時期豆瓣醬的差異性，對其進(jìn)行特征化合物的篩選與鑒定，這是本研究的重要環(huán)節(jié)之一。上述實(shí)驗(yàn)中通過SICRIT-MS 獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)OPLS-DA 后，樣本得到很好區(qū)分，模型具有良好的可靠性與預(yù)測性。 采用S-plot 圖選擇差異變量，以VIP 值大于1.0 為標(biāo)準(zhǔn)，選擇對模型有較大影響的變量[16]，并以P＜0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異變量[17-18]，對差異變量的均值進(jìn)行t檢驗(yàn)。 VIP 值即空間投影重要性或者差異權(quán)重貢獻(xiàn)值，它反映了每個變量對豆瓣醬發(fā)酵樣本分類判別的影響，以及對模型解釋的貢獻(xiàn)度。通常認(rèn)為數(shù)值大于1.0 時，變量對組間分離具有顯著貢獻(xiàn)。 進(jìn)一步對VIP 值大于1.0 的變量進(jìn)行方差分析（ANOVA），采用最小差異（LSD）方法確定樣本均值之間的差異。 最終在正離子模式下篩選出18 個差異碎片離子， 在負(fù)離子模式下篩選出11 個差異碎片離子，結(jié)果見表1。

表1 基于SICRIT-MS 正、負(fù)離子模式下差異碎片離子篩選結(jié)果Table 1 Screening results of differential compounds in positive and negative ion modes based on SICRIT-MS

2.4 豆瓣醬SICRIT-MS 差異碎片離子聚類分析

聚類分析是一種無監(jiān)督模式的識別方法[19]，可以驗(yàn)證數(shù)據(jù)的有效性，輔助建立預(yù)測模型，有利于進(jìn)一步了解豆瓣醬在發(fā)酵過程和不同發(fā)酵時期揮發(fā)性風(fēng)味化合物的變化。 將SICRIT-MS 在正、負(fù)離子測定模式下所得碎片離子的相對分子質(zhì)量與GC-MS 建立的數(shù)據(jù)譜庫進(jìn)行比對，輔助SICRIT-MS對不同發(fā)酵時期豆瓣醬的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性。正、負(fù)離子模式下差異碎片離子的聚類分析結(jié)果如圖6 所示。

圖6 SICRIT-MS 正、負(fù)離子模式下豆瓣醬樣品的聚類分析熱投射圖Fig. 6 Thermal projection diagram of cluster analysis of broad-bean paste samples under positive and negative ion modes of SICRIT-MS

通過對5 個發(fā)酵時期豆瓣醬的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測， 測定出的揮發(fā)性呈香物質(zhì)主要為醇類、醛類、酯類、酸類、酚類、酮類、烴類及芳香烴類。 豆瓣醬在發(fā)酵過程中，由于蛋白酶的水解作用，使得游離氨基酸增加， 其中羰基和游離的氨基酸發(fā)生Maillard 以及Streeker 反應(yīng)[20]，形成了酯類、醛類、酚類、醇類等揮發(fā)性物質(zhì)[21-23]。 酯類、醇類在正離子模式下更易得到H+形成[M+H]+，因此，在正離子模式下能得到更豐富的化合物信息[24]。

在正離子模式下，選取豆瓣醬在發(fā)酵過程中可初步檢測到的相對含量變化較為突出的18 個差異碎片離子，進(jìn)行聚類分析。3-苯丙酸-2-苯乙基酯和己醛兩種物質(zhì)隨著發(fā)酵時間延長， 相對含量減少。己酸乙酯和芳樟醇兩種物質(zhì)相對含量在曲瓣子時期最多，再隨著發(fā)酵時間增加而消失，可將己酸乙酯為曲瓣子時期特征香氣物質(zhì)。 大部分乙酯含果味和甜味，有助于豆瓣醬中風(fēng)味的形成[25]。豆瓣醬后發(fā)酵3 個月時期特征香氣物質(zhì)為（4S）-4-甲基-1-己醇和癸酸乙酯。 苯乙醛和正戊酸乙酯為豆瓣醬后發(fā)酵6 個月時期特征香氣物質(zhì)。 2-苯基-2-丁烯醛和丙酸-2-苯乙酯相對含量隨著發(fā)酵時間延長而增多，在豆瓣醬后發(fā)酵12 個月時期最多。 乙酸三聯(lián)酯只在原料豆瓣醬和曲瓣子中檢測出，可作為區(qū)分后發(fā)酵豆瓣醬的特征性風(fēng)味物質(zhì)。 在正離子模式下，可以通過以上較明顯的揮發(fā)性物質(zhì)的檢測來判斷豆瓣醬發(fā)酵的階段，從而判斷豆瓣醬的最佳發(fā)酵時間。 在不同發(fā)酵時期檢測到的最突出物質(zhì)是提供豆瓣醬當(dāng)前時期的主要風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)在其他豆瓣醬發(fā)酵時期的相對含量均處于穩(wěn)定狀態(tài)，無明顯的變化。

在負(fù)離子模式下，選取豆瓣醬在發(fā)酵過程中可初步檢測到的相對含量變化較為顯著的11 個差異碎片離子進(jìn)行聚類分析。 其中，對二甲苯是原料豆瓣醬中的特征性風(fēng)味物質(zhì)。 而在曲瓣子時期，3-辛烯-2-酮是主要香氣成分， 此外芳樟醇的相對含量也較高。 芳樟醇既有紫丁香、鈴蘭花香，又有果香氣息[26]，為豆瓣醬發(fā)酵時香氣形成提供了一定的貢獻(xiàn)。醇類化合物都具有特殊香氣， 且芳香閾值較低，對其他成分具有促進(jìn)作用[27]。隨著發(fā)酵時間延長，豆瓣醬后發(fā)酵3 個月時甲基丙烯酸異戊酯、己酸乙酯相對含量增加。 豆瓣醬后發(fā)酵6 個月時產(chǎn)生新物質(zhì)1，1-二乙氧基-3-甲基丁烷。 豆瓣醬后發(fā)酵12 個月時異戊酸異丁酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚和苯乙酸乙酯生成， 作為后發(fā)酵12 個月時期豆瓣醬的特征性風(fēng)味物質(zhì)。 在豆瓣醬發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類、酚類等化合物也是豆瓣醬不可或缺的風(fēng)味物質(zhì)，起到調(diào)節(jié)風(fēng)味的作用，而酸類、酚類化合物在負(fù)離子模式下更易失去H+離子形成[M-H]-[28]。

在豆瓣醬發(fā)酵的5 個時期，酯類化合物的種類最多，作為豆瓣醬的主要呈香物質(zhì)，酸和醇的酯化反應(yīng)是形成酯的主要反應(yīng)[29]。 醛類和酮類化合物都是羰基類的化合物， 由醇氧化和酸還原得到的，屬于不穩(wěn)定的化合物， 在豆瓣醬發(fā)酵過程中種類少，但提供了豆瓣醬花果香的獨(dú)特風(fēng)味[30]。 烴類化合物主要由烯烴類化合物組成， 同時含有少量的烷烴，烴類化合物大多數(shù)不具備香味， 風(fēng)味閾值較高，對豆瓣醬的風(fēng)味貢獻(xiàn)較少。 豆瓣醬中的烯烴類化合物，風(fēng)味閾值較高，對豆瓣醬的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。 芳香烴類化合物種類最少，但其因?yàn)槌饰堕撝递^小[31]，本身可能具有發(fā)酵豆制品的獨(dú)特風(fēng)味，對豆瓣醬的醇厚風(fēng)味的形成有直接的影響[32]。

3 結(jié) 語

本研究中首次成功將SICRIT-MS 技術(shù)與代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)立了一種快速評估郫縣豆瓣醬發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)的方法，在質(zhì)譜正離子模式下篩選出18 個差異成分， 在負(fù)離子模式下篩選出11個差異成分，為郫縣豆瓣醬的發(fā)酵和數(shù)字化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。