段 珂， 段作營， 金 堅

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）家族屬于TGF-β 超家族，是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的細(xì)胞外信號多肽，可誘導(dǎo)骨髓充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[1]。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白10 是BMPs 家族中的一員，其表達(dá)被限制在心肌細(xì)胞中，在胚胎心臟發(fā)育和心肌修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[2]，在臨床上具有治療心力衰竭和降低腫瘤治療藥物造成的心臟毒性的潛力[3-4]。

天然BMP10 分子由424 個氨基酸殘基組成，全長單體蛋白質(zhì)由信號肽（signal peptide）、前導(dǎo)肽（propeptide）和成熟肽（mature chain）3 部分組成[5]。1~21 位氨基酸為信號肽，22~316 位氨基酸為前導(dǎo)肽，317~424 位氨基酸為成熟肽，在前導(dǎo)肽與成熟肽連接處313~316 位氨基酸處有一個Furin 特異性識別位點(diǎn)RIRR↓316，在67 位和131 位氨基酸處存在兩個蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)[6]。

作者所在研究團(tuán)隊(duì)前期在CHO 細(xì)胞中隨機(jī)整合并成功表達(dá)BMP10， 發(fā)現(xiàn)BMP10 前體蛋白proBMP10 （含前導(dǎo)肽和成熟肽） 而不是成熟肽rhBMP10 可能在藥物應(yīng)用方面更有優(yōu)勢[7]。 但由于Furin 的存在，造成表達(dá)產(chǎn)物不均一，給后續(xù)成藥造成一定困難。 據(jù)文獻(xiàn)報道，在Furin 的特異性識別位點(diǎn)（313~316 位氨基酸，RIRR↓316） 中，313 位與316位的精氨酸是發(fā)生切割的必要氨基酸[8]。 為了得到不被Furin 切割的單一形態(tài)的proBMP10，并在盡可能不改變蛋白質(zhì)性質(zhì)的情況下，考慮用同為堿性氨基酸的賴氨酸在這兩個位點(diǎn)對proBMP10 進(jìn)行突變，突變體1（proBMP10-1）將313 位的精氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔≧313K），突變體2（proBMP10-2）將316位的精氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔≧316K）。

由傳統(tǒng)的隨機(jī)整合方法所得到的重組CHO 細(xì)胞，由于基因組的固有不穩(wěn)定性、整合位點(diǎn)的不穩(wěn)定性及細(xì)胞凋亡等因素的影響會造成外源蛋白質(zhì)表達(dá)的不穩(wěn)定性[9-10]。因此，本研究中采用作者所在研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的抗凋亡IE3 細(xì)胞株（CHO-K1-BAK-/BAX-雙敲除細(xì)胞）， 并采用CRISPR/Cas9 技術(shù)[11-12]，在作者所在研究團(tuán)隊(duì)篩選并已驗(yàn)證可穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)[13]，定點(diǎn)整合proBMP10及其突變體proBMP10-1 和proBMP10-2 的基因，以期得到表達(dá)產(chǎn)物單一、 表達(dá)穩(wěn)定、 有活性的proBMP10。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞

大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、EGFP 質(zhì)粒、IE3細(xì)胞株（CHO-K1-BAK-/BAX-雙敲除細(xì)胞）由作者所在研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建并保存；pUC57/proBMP10、pUC57/proBMP10-1、pUC57/proBMP10-2 由南京金斯瑞公司合成；Psk-U6-gRNA 和Cas9-DTU 質(zhì)粒由復(fù)旦大學(xué)盧大儒教授惠贈；proBMP10 活性測定細(xì)胞P19 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院心血管疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶（KpnⅠ、SmaI）和T4 DNA 連接酶： 賽默飛公司；DMEM-F12 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）：美國Gibco 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒： 上海生工生物工程有限公司；引物合成和測序由金唯智公司完成；anti-BMP10 propeptide 抗體、rhBMP10 標(biāo)準(zhǔn)品：R&D 公司； 其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.3 proBMP10 及其突變體重組IE3 細(xì)胞株的構(gòu)建

1.3.1 設(shè)計思路重組IE3 細(xì)胞株采用定點(diǎn)整合的方法進(jìn)行構(gòu)建， 整合位點(diǎn)是CHO 細(xì)胞基因組中NW_003626341.1 內(nèi)第1 689 堿基（上下游1 614~1 763 堿基內(nèi)）處[13]。 位于同源臂內(nèi)的EGFP 和Puro為正選標(biāo)記，mCherry 為反選標(biāo)記，發(fā)生定點(diǎn)整合的細(xì)胞株在含嘌呤霉素的壓篩培養(yǎng)基中表現(xiàn)為只發(fā)綠光[13]。 供體片段定點(diǎn)整合方法如圖1 所示。

圖1 供體片段定點(diǎn)整合方法示意圖Fig. 1 Illustration of donor fragment site-specific integration

1.3.2 引物設(shè)計及合成proBMP10 及其突變體PCR 引物序列見表1。 其中：FL-5′和FL-3′的下劃波浪線部分為KpnⅠ和SmaⅠ的酶切位點(diǎn)；MID-5′和MID-3′為his-tag 和腸激酶識別位點(diǎn)引物， 下劃線部分為his-tag 和腸激酶堿基序列。5′arm-F 和5′arm-R 用來驗(yàn)證5′arm 的定點(diǎn)整合，3′arm-F 和3′arm-R 引物用來驗(yàn)證3′arm 的定點(diǎn)整合。 引物均由金唯智公司合成。

表1 proBMP10 及其突變體PCR 引物Table 1 Primers for amplification of proBMP10 protein and its mutants by PCR

1.3.3 供體質(zhì)粒的構(gòu)建以pUC57/proBMP10、pUC57/proBMP10-1、pUC57/proBMP10-2 質(zhì)粒為模板， 分別以FL-5′和MID-3′、FL-3′和MID-5′為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[14]。 割膠回收后再以回收液為模板，F(xiàn)L-3′和FL-5′為引物，再次進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[14]?；厥找汉虴GFP 質(zhì)粒分別用KpnⅠ和SmaⅠ進(jìn)行酶切，割膠回收后加入T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliDH5α，涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，第2 天挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR 鑒定，并送金唯智公司進(jìn)行測序。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將上述得到的3 個供體質(zhì)粒分別與Psk-U6-gRNA 質(zhì)粒及Cas9-DTU 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染IE3 細(xì)胞株 （供體質(zhì)粒、Psk-U6-gRNA 質(zhì)粒、Cas9-DTU 質(zhì)粒的質(zhì)量比為1.8∶1.8∶1.0）[13]。 轉(zhuǎn)染之后的10 d 內(nèi)，壓篩擴(kuò)培抗藥細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞克隆的篩選

待細(xì)胞池中細(xì)胞長到合適狀態(tài)時，用流式細(xì)胞儀挑選只發(fā)綠光不發(fā)紅光的單克隆細(xì)胞至96 孔板中， 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d，擴(kuò)培至24 孔板中，等到細(xì)胞匯合度達(dá)到80% 時更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h， 取上清液進(jìn)行Dot blot 檢測。 選取表達(dá)目的蛋白質(zhì)的陽性孔提取基因組， 分別以5′arm-F 和5′arm-R、3′arm-F和3′arm-R 為引物，進(jìn)行PCR 定點(diǎn)整合驗(yàn)證，并選取相對分子質(zhì)量正確的條帶測序驗(yàn)證[13]。 選取Dot blot 驗(yàn)證和PCR 驗(yàn)證都正確的單克隆，取上清液進(jìn)行Western blot 檢測。 具體方法為：經(jīng)120 g/L SDSPAGE 分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至NC 膜上，以50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉2 h；TBST 漂洗3 次， 加入anti-BMP10 propeptide 抗體（1∶1 000 稀釋），室溫孵育4 h；TBST 漂洗3 次，加入山羊抗小鼠二抗（1∶2 000稀釋），室溫孵育2 h；ECL 顯色成像[14]。

將篩選出的高表達(dá)克隆株擴(kuò)培至6 孔板中，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d 后，用PBS 清洗擴(kuò)培至T25 培養(yǎng)瓶中，待到細(xì)胞匯合度達(dá)到90% 時擴(kuò)培細(xì)胞至T75 培養(yǎng)瓶中，最后進(jìn)行懸浮馴化，挑選表達(dá)量最高的細(xì)胞株，分別命名為IE3-proBMP10、IE3-proBMP10-1、IE3-proBMP10-2。

1.5 目的蛋白質(zhì)的初步純化與Furin 酶切驗(yàn)證

由于在構(gòu)建proBMP10 及其突變體時， 在全長單體蛋白質(zhì)的信號肽與前導(dǎo)肽之間， 即proBMP10分子的N 端，添加了his-tag 和腸激酶識別位點(diǎn)，因此，采用鎳柱對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行初步純化。

高表達(dá)細(xì)胞株IE3-proBMP10、IE3-proBMP10-1、IE3-proBMP10-2 分別經(jīng)3 L 搖瓶流加表達(dá)8 d，收集培養(yǎng)液。 經(jīng)1 000g離心10 min 后保留上清液，上清液經(jīng)8 000g離心40 min 后先經(jīng)0.45 μm 濾膜再經(jīng)0.22 μm 濾膜抽濾，過鎳柱純化。 以A 液（500 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、25 mmol/L 咪唑，pH 8.0）平衡柱子，收集流穿液；用上一步抽濾液上樣，最后直接以B 液（500 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、200 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗脫，收集洗脫峰處洗脫液， 經(jīng)SDS-PAGE 和Western blot 檢測，取蛋白質(zhì)液加入腸激酶，于37 ℃酶切12 h 后加入Furin 酶切1 h，進(jìn)行Western blot 檢測。

1.6 目的蛋白質(zhì)的活性檢測

BMP10 與受體結(jié)合后， 會使細(xì)胞內(nèi)的Smad 6基因表達(dá)水平上升，因此采用qPCR 法檢測Smad 6表達(dá)情況作為proBMP10-2 活性的指標(biāo)[15]。 采用不添加任何因子的培養(yǎng)基作為陰性對照，rhBMP10 標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照， 考慮到rhBMP10 和proBMP10-2分子大小的差異 （后者相對分子質(zhì)量5.8×104約為前者1.3×104的4.5 倍）， 為保證反應(yīng)體系中具有比較一致的物質(zhì)的量濃度， 在測定時，rhBMP10 的質(zhì)量濃度為100 μg/L，proBMP10-2 質(zhì)量濃度為450 μg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

在含100 μg/mL 氨芐青霉素的3 個LB 固體培養(yǎng)平板上各隨機(jī)挑選10 個克隆，經(jīng)菌落PCR 鑒定，EGFP -proBMP10 的7、8、10 號克隆，EGFP -proBMP10-1 的8、9、10 號克隆，EGFP-proBMP10-2的11、13、14、 15 號克隆在約1 300 bp 處可見陽性條帶（見圖2）。

圖2 EGFP-proBMP10 及其突變體的菌落PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis diagram of EGFP-proBMP10 and its mutant colony PCR

分別從EGFP-proBMP10 的7 號克隆、EGFPproBMP10-1 的9 號克隆、EGFP-proBMP10-2 的11號克隆提取質(zhì)粒， 并進(jìn)行酶切鑒定， 在約1 300 bp處均可見特異性條帶（見圖3）。 對這3 個質(zhì)粒進(jìn)一步測序驗(yàn)證， 結(jié)果與設(shè)計的基因序列比對結(jié)果一致，表明3 種重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 質(zhì)粒EGFP-proBMP10 及其突變體酶切鑒定電泳圖Fig. 3 Electrophoresis diagram of plasmid EGFP -proBMP10 and its mutants by restriction digestion

2.2 細(xì)胞克隆的篩選

根據(jù)敲入整合策略，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分選只發(fā)綠光的細(xì)胞， 培養(yǎng)10 d 后轉(zhuǎn)移至24 孔板， 取不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)Dot blot篩選出proBMP10 及其突變體的表達(dá)株， 提取單克隆細(xì)胞基因組進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果如圖4 所示。 結(jié)果顯示，proBMP10 的1 號和3 號克隆、proBMP10-1的4 號和5 號克隆以及proBMP10-2 的10 號克隆的5′端PCR 產(chǎn)物和3′端PCR 產(chǎn)物都同時出現(xiàn)了大小符合預(yù)期 （5′端約2 800 bp；3′端約3 200 bp）的DNA 條帶。通常當(dāng)5′端和3′端引物同時擴(kuò)增出大小符合預(yù)期的片段，就基本可以認(rèn)為目的基因定點(diǎn)整合成功。對這5 株單克隆細(xì)胞株P(guān)CR 驗(yàn)證產(chǎn)物進(jìn)行測序， 結(jié)果表明在NW_003626341.1 內(nèi)第1 689 堿基處成功敲入了含proBMP10 及其突變體編碼基因的DNA 片段，得到了定點(diǎn)整合的表達(dá)proBMP10 及其突變體的重組CHO-K1-IE3 工程細(xì)胞株。

圖4 proBMP10 及其突變體基因定點(diǎn)整合驗(yàn)證結(jié)果Fig. 4 Verification of site-specific integration of proBMP10 and its mutant genes

取這5 株重組細(xì)胞克隆株的無血清貼壁培養(yǎng)上清液進(jìn)行Western blot 分析， 在相對分子質(zhì)量約5.8×104處均可見明顯條帶（見圖5），表明定點(diǎn)敲入的proBMP10 及其突變體基因成功表達(dá)。 目的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量理論值為4.8×104，但電泳條帶顯示位置在相對分子質(zhì)量5.8×104， 這與天然合成的proBMP10 電泳時呈現(xiàn)的分子大小是一致的[8]。 由于proBMP10 在67 位和131 位氨基酸處存在兩個蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)， 推測它們在CHO 細(xì)胞中表達(dá)時可能發(fā)生了糖基化。 此外，從圖5 中可以看出，在貼壁培養(yǎng)條件下， 無論proBMP10 還是其突變體，在Western blot 鑒定時都只在相對分子質(zhì)量5.8×104處存在單一條帶，未觀察到Furin 酶切所形成的條帶。

圖5 重組CHO 單克隆細(xì)胞株貼壁培養(yǎng)上清液的Western blot 鑒定Fig. 5 Western blot identification of adherent culture supernatant of recombined CHO cells

2.3 proBMP10 及其突變體的初步純化及Furin酶切鑒定

經(jīng)過懸浮馴化篩選出3 株高表達(dá)細(xì)胞株，分別命名為IE3-proBMP10、IE3-proBMP10-1、IE3-proBMP10-2。 在CD 培養(yǎng)基中流加表達(dá)8 d，取發(fā)酵上清液進(jìn)行鎳柱純化，將發(fā)酵上清液、流穿液、洗脫液分別進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果見圖6。 結(jié)果顯示，3 株細(xì)胞株的發(fā)酵上清液過鎳柱后基本實(shí)現(xiàn)了純化。IE3-proBMP10 和IE3-proBMP10-1 的鎳柱洗脫液除了在相對分子質(zhì)量5.8×104處出現(xiàn)了明顯條帶之外， 在相對分子質(zhì)量4.5×104處也出現(xiàn)了可見條帶，而IE3-proBMP10-2 只在相對分子質(zhì)量5.8×104處有可見條帶。

圖6 重組細(xì)胞流加培養(yǎng)液鎳柱純化的SDS-PAGE 分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of recombinant cells with added culture medium purified by nickel column chromatography

對上述電泳結(jié)果同時進(jìn)行Western blot 鑒定，結(jié)果如圖7 所示。 可以看出，IE3-proBMP10、IE3-proBMP10-1 目的蛋白質(zhì)鎳柱純化產(chǎn)物分別在相對分子質(zhì)量5.8×104和4.5×104處可見2 個條帶，而IE3-proBMP10-2 目的蛋白質(zhì)鎳柱純化產(chǎn)物在相對分子質(zhì)量5.8×104可見單一條帶。 表明IE3-proBMP10 和IE3-proBMP10-1 所表達(dá)的目的蛋白質(zhì)有可能被Furin 酶切，而IE3-proBMP10-2 突變株表達(dá)的目的蛋白質(zhì)則可能不再被Furin 酶切。

圖7 目的蛋白質(zhì)鎳柱純化產(chǎn)物的Western blot 分析Fig. 7 Western blot analysis of purified target proteins by nickel column

為了進(jìn)一步驗(yàn)證， 進(jìn)行了Furin 體外酶切實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果如圖8 所示。 Furin 酶切后，anti-BMP10 propeptide 抗體的雜交結(jié)果顯示，proBMP10 和proBMP10-1 在相對分子質(zhì)量5.8×104的條帶基本消失， 而在相對分子質(zhì)量4.5×104處的條帶得到了加強(qiáng)。 表明proBMP10-1 的確和proBMP10 一樣，仍可以被Furin 酶切，proBMP10 分子上313 位的精氨酸不是Furin 酶切必需的， 將其替代為賴氨酸并不能阻止切割的發(fā)生。 而proBMP10-2 仍在相對分子質(zhì)量5.8×104處出現(xiàn)單一條帶， 未在相對分子質(zhì)量4.5×104處出現(xiàn)Furin 切割典型條帶， 表明proBMP10-2 突變體不再被Furin 識別和切割，proBMP10 分子上316 位的精氨酸是Furin 酶切必需的。

圖8 目的蛋白質(zhì)酶切后的Western blot 分析Fig. 8 Western blot analysis of target proteins after digestion

2.4 目的蛋白質(zhì)的活性

為了驗(yàn)證不能被Furin 酶切的proBMP10-2 突變體是否仍具有生物活性，采用qPCR 檢測Smad 6相對表達(dá)量，結(jié)果如圖9 所示。結(jié)果表明，proBMP10-2經(jīng)腸激酶酶切前后， 都具有一定的活性，Smad 6表達(dá)量分別為陰性對照的6.3 倍和6.2 倍， 與相同濃度下的rhBMP10 標(biāo)準(zhǔn)品活性相當(dāng)。 表明proBMP10-2具有生物活性，且his-tag-DDDDK 標(biāo)簽的存在對其活性無明顯影響。

圖9 proBMP10-2 的活性檢測Fig. 9 Determination of activity of proBMP10-2

3 結(jié) 語

本研究中構(gòu)建了proBMP10 Furin 酶切位點(diǎn)的突變體proBMP10-1（R313K）和proBMP10-2（R316K）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將proBMP10 分子中313位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼岵⒉荒茏柚笷urin 對proBMP10 的酶切，而將proBMP10 分子中316 位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼釀t可以阻止Furin 對proBMP10的酶切。 活性測定結(jié)果表明，改造后的proBMP10-2仍具有生物活性， 這有效避免了proBMP10 表達(dá)產(chǎn)物不均一的問題，為其成藥提供了一條新思路。

應(yīng)用作者所在研究團(tuán)隊(duì)建立的CHO 定點(diǎn)整合表達(dá)體系，在抗凋亡的IE3 細(xì)胞株（CHO-K1-BAK-/BAX-雙敲除細(xì)胞）中，篩選得到了目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株IE3-BMP10、IE3-BMP10-1 和IE3-BMP10-2，縮短了重組細(xì)胞株的構(gòu)建流程，驗(yàn)證了作者所在研究團(tuán)隊(duì)建立的定點(diǎn)整合體系的有效性。