胡莉萍， 孫 鋒， 張均葉， 朱 松， 李 玥*

（1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 億滋食品企業(yè)管理（上海）有限公司，江蘇 蘇州 215126）

發(fā)酵餅干（fermented cracker）是以小麥粉、水為主要原料，加入酵母或（和）乳酸菌，再加入其他輔料，經(jīng)過拌粉、成型、烘烤等操作工藝加工制作而成的產(chǎn)品[1]。 有學者研究表明，經(jīng)酵母發(fā)酵后可以提高餅干的淀粉消化性，有利于人體對淀粉等物質(zhì)的消化吸收[2]。 此外，閆博文等的研究發(fā)現(xiàn)復合乳酸菌和酵母共同發(fā)酵會明顯提高餅干的功能營養(yǎng)特性，同時能賦予面制品獨特的風味[3]。 Chang 等研究表明，發(fā)酵面團在不同發(fā)酵時間段有不同的揮發(fā)性風味物質(zhì)，且發(fā)酵面團中風味物質(zhì)含量和種類明顯高于未發(fā)酵面團[4]。 有學者通過研究乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)特性得出，發(fā)酵后饅頭的硬度有所降低、體積有所增加，風味品質(zhì)的評價結果明顯高于未加乳酸菌發(fā)酵饅頭[5]。

蛋白質(zhì)作為食品體系中的大分子物質(zhì)之一，與人們?nèi)粘５纳攀诚⑾⑾嚓P。 隨著人們生活水平的提高，大家日益關注食品的品質(zhì)和營養(yǎng)特性[6]。 食物中蛋白質(zhì)的質(zhì)和量、蛋白質(zhì)體外消化率的高低、各種氨基酸的組成與比例等都與人體的健康息息相關，蛋白質(zhì)指標的評價對于高品質(zhì)健康食物的研究與開發(fā)具有重要的指導意義[7]。Xing 等研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌和酵母在面團中共同作用不僅可以促進菌株之間的代謝，提高乳酸菌的產(chǎn)酸和酵母的產(chǎn)氣能力，而且乳酸菌在發(fā)酵過程中會逐漸降低面制品的pH，進而提高面粉中菌株自身的蛋白酶活性，促進大分子蛋白質(zhì)的降解[8]。 因此，乳酸菌發(fā)酵對終產(chǎn)品的蛋白質(zhì)體外消化率、氨基酸組成及質(zhì)構和風味的影響值得深入研究。

作者分別采用兩株乳酸菌制備發(fā)酵餅干，以市售梳打餅干和酵母單獨發(fā)酵餅干作為對照，探究乳酸菌發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)消化性，分析不同發(fā)酵餅干中蛋白質(zhì)營養(yǎng)指標以及餅干品質(zhì)特性的變化情況，為開發(fā)高品質(zhì)餅干產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母、小麥粉、全麥粉、起酥油、鹽、膨松劑、奶粉：億滋食品企業(yè)管理（上海）有限公司；市售梳打餅干：歐尚超市；DN-1（植物乳桿菌）乳酸菌粉：丹尼斯克公司；JN-1（副干酪乳桿菌）：中國中西部重慶市沙坪壩區(qū)的泡菜中分離得到； 胰酶 （P7545，8×USP）、胃蛋白酶（P7000，≥2.5×105U/g）：美國Sigma公司；鹽酸、硫酸、三氯乙酸（TCA）、硫酸銅、氫氧化鈉（粒狀）、氯化鈣、硫酸鉀：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ARM-01 型全齒輪傳動攪拌機： 福建德霸食品機械有限公司；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器： 鞏義市俞華儀器有限公司；TD6 型低速離心機： 湖南赫西儀器裝備有限公司；EL20 型pH 計、AL204 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TA-XT2i 型物性測試儀：英國Stable Micro Systems 公司；焙烤設備（打孔板）：億滋食品企業(yè)管理（上海）有限公司特殊定制；KDN-103F 型凱氏定氮儀：上海纖檢有限公司；GC-2010PLUS 型氣相色譜儀：日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵餅干的制備發(fā)酵餅干的配方如表1所示。 按照表中的制作配方，將酸面團所需各原料按照其比例稱量好，其中，預先將酵母或者乳酸菌放在溫水中融化，起酥油融化至液態(tài)。

表1 發(fā)酵餅干的配方表Table 1 Recipe of fermented crackers

乳酸菌發(fā)酵餅干的制作步驟：將小麥粉、奶粉、酵母、乳酸菌、無菌水一起加入到ARM-01 型全齒輪傳動攪拌機中，在一定速度下攪拌4 min，待攪拌機停止后，將攪拌機及攪拌缸上黏著的面團用刮板刮下，將攪拌完成的發(fā)酵面團置于35 ℃、相對濕度80%的發(fā)酵箱中發(fā)酵19 h。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵好的酸面團和剩余小麥粉、全麥粉、起酥油、膨松劑、鹽一起放入攪拌機中，攪拌混合4 min，在溫度30 ℃、相對濕度80%下繼續(xù)發(fā)酵4 h，得到主面團。 待主面團發(fā)酵結束后，用壓片機反復壓至最終厚度為1 mm，用模具分割成5 cm×5 cm 的面片，之后放在上火250 ℃、 下火250 ℃的焙烤箱中烘烤6 min，冷卻后得到發(fā)酵餅干的成品（兩種乳酸菌發(fā)酵餅干分別稱為DN-1 餅干、 JN-1 餅干）。

酵母單獨發(fā)酵餅干的制作步驟同乳酸菌發(fā)酵餅干，但配方略有不同。 其中，酸面團配方中不加乳酸菌，主面團配方中膨松劑的質(zhì)量為4.5 g（酵母單獨發(fā)酵餅干稱為Control 餅干）。

1.3.2 發(fā)酵餅干蛋白質(zhì)體外消化率的測定總蛋白質(zhì)質(zhì)量的測定參考《食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）進行[9]。

蛋白質(zhì)體外消化率的測定參照Minekus 等建立的靜態(tài)體外消化模擬方法[10]，并略有改動。 將1.000 g的固體樣品放在帶蓋的樣品瓶中，并加入轉子和4 mL去離子水， 在37 ℃的恒溫水浴鍋中保溫3 min 后，將5 mL 的混合好的液體樣品與4 mL 模擬胃液流體（SGF）混合，其中SGF 中包含3 mL 胃蛋白酶溶液 （質(zhì)量濃度為7 mg/mL， 酶活力2.5×105U/g）、0.25 μL 0.3 mol/L 的氯化鈣溶液，再用1 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3.0。將混合后的樣品補加水至總體積10 mL，在37 ℃恒溫水浴鍋中混合2 h 并不斷攪拌，在胃消化階段120 min 時間點取樣后，沸水浴滅酶。之后， 將10 mL 混合好的液體樣品與8 mL 的模擬腸液流體（SIF）混合，其中SIF 中包含2 mL 胰酶溶液 （質(zhì)量濃度為8 mg/mL， 酶活力8×USP）、20 μL 0.3 mol/L 的氯化鈣溶液， 再用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0。將混合后的樣品補加去離子水至總體積20 mL，在37 ℃恒溫水浴鍋中混合2 h 并不斷攪拌，在腸消化階段120 min 時間點取樣后，沸水浴滅酶。 將取出后的胃消化液和腸消化液樣品，加入等體積的三氯乙酸 （TCA） 溶液 （體積分數(shù)為30%）， 靜置至室溫， 在4 500 r/min 下離心20 min后棄去上清液，用凱氏定氮法測定沉淀中未被降解的大分子蛋白質(zhì)質(zhì)量。 蛋白質(zhì)體外消化率為特定時間點生成的游離氨基酸和小分子可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量與原餅干樣品中總蛋白質(zhì)質(zhì)量的比值， 按照下式（1）計算。

式中：DP為發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)體外消化率，%；mT為發(fā)酵餅干樣品總蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；mC為發(fā)酵餅干樣品在胃腸消化階段未被消化的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg。

1.3.3 蛋白質(zhì)組分的營養(yǎng)指標估算參照文獻[11]中的方法，對酸水解后餅干樣品中的氨基酸進行蛋白質(zhì)組分營養(yǎng)指標估算。 主要有：必需氨基酸質(zhì)量分數(shù)（EAA）、必需氨基酸與總氨基酸的質(zhì)量比（E/T）、氨基酸評分（AAS，指被測樣品蛋白質(zhì)中氨基酸含量與參考樣品蛋白質(zhì)中氨基酸含量之比）、 生物價（BV，指測試的蛋白質(zhì)可利用部分）、預測的蛋白質(zhì)功效比（PER）、蛋白質(zhì)體外消化率校正后的氨基酸評分（PDCAAS， 指氨基酸評分與蛋白質(zhì)體外消化率的乘積）。

1.3.4 乳酸菌發(fā)酵餅干的品質(zhì)評價參考文獻[12]中的測定方法，并略有改動。 對最終發(fā)酵餅干樣品的堆積高度和堆積質(zhì)量、比容、餅干的硬度和脆性、pH 等進行研究， 對餅干各方面的品質(zhì)進行客觀的評價。 首先使用游標卡尺，隨機取5 片發(fā)酵餅干樣品，并對其堆積高度進行疊加測量，然后將堆垛的餅干順時針旋轉90°，按順序依次旋轉4 條邊，最終結果取4 次測定的平均值。 同時，使用游標卡尺隨機對5 片發(fā)酵餅干的長、寬、高進行測定，每組樣品測定3 次，最終結果取其測定的平均值，使用以下式（2）計算餅干的比容。

式中：v為樣品的比容，cm3/g；V為樣品的體積，cm3；m為樣品的質(zhì)量，g。

使用TA-XT2i 型物性測試儀對乳酸菌發(fā)酵餅干的硬度、脆性進行測定。 取形狀完整的一塊餅干作為待測樣品放置在實驗支架上， 測試開始時，型號為TA-43R 的金屬刀片（厚度為3 mm）垂直從餅干正中切過直至餅干斷裂。 切刀上行速度、測試速度和下行速度分別為2.0、3.0、2.0 mm/s， 測試距離和接觸力分別為5.0 mm 和5 g。 每組樣品測定3次，結果取平均值。

1.3.5 乳酸菌發(fā)酵餅干的風味物質(zhì)測定采用GC-2010PLUS 型氣相色譜儀測定并分析4 種發(fā)酵餅干樣品的風味物質(zhì)成分。 將餅干粉碎后， 取約2.5 g 的餅干粉末， 放置在20 mL 的棕色進樣瓶中，擰緊蓋子后插入已老化的75 μm Car/PDMS 萃取頭，60 ℃頂空萃取40 min，進行GC-MS 分析。

檢測條件[13]：DB-5MS 毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，1 μm）；載氣為氦氣，以10 mL/min 恒流1 min 后分流，分流體積比10∶1。 升溫程序：40 ℃恒溫2 min，以6 ℃/min 的速率升溫至160 ℃后保溫2 min， 再以10 ℃/min 的速率升溫至230 ℃后保溫10 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 8 分析作圖，SPSS 22 軟件處理并分析數(shù)據(jù)，Duncan’s tests 進行方差分析（顯著性分析）。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵餅干蛋白質(zhì)體外消化率的研究

蛋白質(zhì)體外消化率與蛋白質(zhì)進入體內(nèi)被人體消化吸收的程度密切相關。 一般來說，蛋白質(zhì)體外消化率越高，說明蛋白質(zhì)越易被腸胃利用[14]。 由圖1可以看出，乳酸菌發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)體外消化率在消化過程中變化情況一致。 在模擬人體的胃消化階段，因為低pH 條件和胃蛋白酶的作用，消化過程中的大分子蛋白質(zhì)被切斷， 變成分子鏈較短的肽段，提高蛋白質(zhì)消化。 但是，隨著水解產(chǎn)物的增多，會影響消化的速率， 因此在模擬人體的胃消化階段，蛋白質(zhì)體外消化率有所升高但升高的不明顯。 在模擬人體的腸消化階段，加入胰酶后，因為胰酶的水解作用，蛋白質(zhì)被降解為相對分子質(zhì)量較小的多肽或者氨基酸，進一步提高腸消化階段的蛋白質(zhì)體外消化率[15]。

圖1 不同消化階段下發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)體外消化率情況Fig. 1 In vitro digestibility of protein in fermented crackers at different digestion stages

在模擬胃消化階段， 消化120 min 后，Control餅干的蛋白質(zhì)體外消化率為16%，兩種乳酸菌發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)體外消化率約為17%，市售梳打餅干的蛋白質(zhì)體外消化率為16%。 該結果顯示Control餅干和市售梳打餅干在胃消化階段的蛋白質(zhì)體外消化率相近，但略低于乳酸菌發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)體外消化率。 在模擬腸消化階段，消化120 min 后，與Control 餅干和市售梳打餅干相比，DN-1 餅干的蛋白質(zhì)體外消化率最高， 蛋白質(zhì)體外消化率分別由81%、80%顯著提高至86%， 而JN-1 餅干的蛋白體外消化率為84%， 相比于Control 餅干也有明顯提高。 由此可以看出經(jīng)乳酸菌酸面團發(fā)酵后可以顯著提高發(fā)酵餅干在胃腸消化階段的蛋白質(zhì)體外消化率。 原因可能是乳酸菌酸面團在發(fā)酵過程中，面團中的乳酸菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)激活了菌株自身和面粉中的蛋白酶類，蛋白酶將小麥粉中的蛋白質(zhì)降解為小分子肽， 小分子肽進一步被降解為氨基酸，使其更容易被機體消化[16]。 該結果與閆博文等的研究結果[3]一致，相比于酵母發(fā)酵產(chǎn)品，加入乳酸菌發(fā)酵后會顯著提高餅干在胃腸消化階段的蛋白質(zhì)體外消化率。

2.2 發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)組分營養(yǎng)指標估算

食物中蛋白質(zhì)的含量、氨基酸模式、必需氨基酸組成和含量等方面均存在差異，機體對不同種類蛋白質(zhì)的利用也有所差異。 食品中蛋白質(zhì)組分營養(yǎng)指標估算對食品營養(yǎng)價值的評價、膳食指導、新食品資源的開發(fā)等具有重要作用。 表2 為4 種發(fā)酵餅干的營養(yǎng)指標估算結果，發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)組分營養(yǎng)指標估算主要包括： 必需氨基酸質(zhì)量分數(shù)（EAA）、必需氨基酸與總氨基酸的質(zhì)量比（E/T）、生物價（BV）、預測的蛋白質(zhì)功效比（PER）、氨基酸評分（AAS）、蛋白質(zhì)體外消化率校正后的氨基酸評分（PDCAAS）。 與Control 餅干相比，加入乳酸菌發(fā)酵后，多種營養(yǎng)指標差異不顯著。 盡管餅干中加入的菌株和發(fā)酵工藝有所差異，但其配料和蛋白質(zhì)組分相同，因此，蛋白質(zhì)組分營養(yǎng)指標估算結果無顯著變化。 與市售梳打餅干相比，Control 餅干、DN-1 餅干、 JN-1 餅干的多數(shù)營養(yǎng)指標估算結果均有一定程度的提高。

表2 4 種發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)組分營養(yǎng)指標估算Table 2 Evaluation of nutritional indexes of protein components in four fermented crackers

2.3 發(fā)酵餅干的品質(zhì)評價

發(fā)酵餅干會因發(fā)酵過程中菌株對面團的作用差異而產(chǎn)生不同的品質(zhì)特性，4 種發(fā)酵餅干品質(zhì)評價的測定結果如表3 所示。 由表可知，與Control 餅干相比，DN-1 餅干、 JN-1 餅干的堆積質(zhì)量、堆積高度、比容均有所降低，可能是因為乳酸菌在面團發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，有機酸會作用于面團網(wǎng)絡結構，引起面團網(wǎng)絡結構的塌陷，使面團的筋力減弱[17]；也有可能是因為乳酸菌與酵母的協(xié)同作用產(chǎn)生更多的二氧化碳氣體，使發(fā)酵面團的密度降低[18]。此外，乳酸菌發(fā)酵餅干的硬度和脆性也均有顯著的降低，且4 種發(fā)酵餅干的pH 均在7 左右。

表3 4 種發(fā)酵餅干的品質(zhì)評價結果Table 3 Results of quality evaluation of four fermented crackers

2.4 乳酸菌發(fā)酵餅干的風味物質(zhì)研究

在4 種發(fā)酵餅干中，一共檢測到100 余種風味物質(zhì)，這些風味物質(zhì)主要有烷烴類、醛類、酯類、酮類、酸類、醇類和其他。 風味物質(zhì)主要來源于原料自身、菌株發(fā)酵過程中的代謝物、焙烤過程中發(fā)生的美拉德反應以及脂質(zhì)氧化等[19]。 4 種發(fā)酵餅干的風味物質(zhì)如表4 所示，與Control 餅干相比，加入乳酸菌發(fā)酵后，酯類和酸類物質(zhì)的相對含量和種類均有所增加，這些風味物質(zhì)可以增加產(chǎn)品香氣。

表4 4 種發(fā)酵餅干的不同風味物質(zhì)統(tǒng)計Table 4 Statistics of different volatile flavor compounds in four fermented crackers

醇類物質(zhì)是餅干風味的主要來源之一，在面團發(fā)酵過程中酵母和乳酸菌會通過代謝作用產(chǎn)生不同種類的醇類化合物，其中主要以正己醇、1-辛烯-3-醇、3,5-辛二烯-2-醇、 正丁醇和苯乙醇等為主。與Control 餅干和市售梳打餅干相比，DN-1 菌株發(fā)酵后其餅干中的醇類物質(zhì)在相對含量和種類上均有明顯的增加（P<0.05）；與Control 餅干相比，JN-1餅干中的醇類物質(zhì)在相對含量上有所減少，但其醇類物質(zhì)的種類有所增加，可能是不同的乳酸菌或者來源不同的同種乳酸菌的代謝途徑有所不同引起的[20]。

醛類物質(zhì)主要包括正辛醛、壬醛、反式-2-壬烯醛、苯甲醛等，檢測到的酮類、酸類物質(zhì)種類較多，而相對含量相對較低。 4 種發(fā)酵餅干中酮類、醛類、酸類物質(zhì)在相對含量方面均存在差異， 其中，DN-1餅干、 JN-1 餅干中酸類物質(zhì)的相對含量分別為5.02%、5.10%，明顯高于Control 餅干和市售梳打餅干，該結果與Seitz 的研究結果[21]相似，主要是乳酸菌在面團發(fā)酵過程中產(chǎn)酸造成的。

酯類對產(chǎn)品風味影響明顯，主要因為酯類物質(zhì)有較低的閾值[22]。 4 種發(fā)酵餅干中共檢測出40 種酯類化合物，Control 餅干和市售梳打餅干中分別有22、11 種酯類物質(zhì)，相對含量分別為3.19%、3.00%。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，DN-1 餅干、 JN-1 餅干分別增加至26、32 種， 相對含量分別為13.88%、14.40%。 其中，在酵母單獨發(fā)酵餅干中，具有白蘭地酒香味的辛酸乙酯的相對含量為0.2%， 而在DN-1 餅干、JN-1 餅干中分別為0.2%、0.3%。在不同菌株發(fā)酵的樣品中還檢測到內(nèi)酯類化合物， 其中，γ-丁內(nèi)酯的形成主要是微生物的代謝作用產(chǎn)生了谷氨酸，并繼續(xù)進行氧化脫氨反應產(chǎn)生2-氧戊二酸，經(jīng)過脫羧還原反應后，最后環(huán)化生成γ-丁內(nèi)酯[23]。 酯類物質(zhì)的相對含量在乳酸菌發(fā)酵餅干中較高，可賦予產(chǎn)品濃郁的香氣。

烷烴類物質(zhì)的閾值較高，對餅干的風味貢獻值低，而且多數(shù)烷烴類物質(zhì)缺少生物活性，從結果來看，Control 餅干的烷烴類物質(zhì)相對含量有所增加，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，餅干中烷烴類物質(zhì)的相對含量均出現(xiàn)明顯下降的趨勢。 其他類物質(zhì)包含不飽和烴類、呋喃等風味物質(zhì)，相比Control 餅干和市售梳打餅干，在DN-1 餅干、 JN-1 餅干中這些風味物質(zhì)的相對含量均有所降低。

3 結 語

作者以乳酸菌發(fā)酵制備的餅干為研究對象，探究兩株不同的乳酸菌對餅干蛋白質(zhì)體外消化率和品質(zhì)特性的影響。 研究結果表明，與Control 餅干相比，乳酸菌發(fā)酵后餅干的蛋白質(zhì)體外消化率均有顯著提高，其中在模擬腸消化階段，DN-1 菌株發(fā)酵餅干的蛋白質(zhì)體外消化率達到最高。 同時，與市售梳打餅干相比，3 種發(fā)酵餅干 （Control 餅干、DN-1 餅干、JN-1 餅干） 的蛋白質(zhì)體外消化率均有明顯的增加。 此外，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，發(fā)酵餅干的風味品質(zhì)有所改善，可賦予發(fā)酵餅干更好的感官特性。