張靖偉， 姜 旋， 朱升龍， 陳永泉*，

（1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

炎癥性腸?。↖BD）是一種慢性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn’s disease，CD）[1]。 目前除通過全結(jié)直腸切除術(shù)外，IBD還無法被治愈[2]。 IBD 的顯著特征是病情反復(fù)，經(jīng)治療緩解后，仍需進(jìn)行長期維持治療[3]。 在這期間，除了利用常規(guī)藥物進(jìn)行緩解外，額外營養(yǎng)支持有利于改善患者營養(yǎng)狀況，提高患者治療效果[4]。

研究表明， 一些營養(yǎng)素如可溶性膳食纖維、維生素D、鋅，可以有效緩解結(jié)腸炎的癥狀，并且顯著降低疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[5]。 然而，另外一些營養(yǎng)素如脂肪酸，特別是n-3 多不飽和脂肪酸對IBD 的作用尚不明確[6]。 在一項(xiàng)為期兩年的前瞻性研究中，接受了n-3 多不飽和脂肪酸補(bǔ)充的IBD 患者在研究起始的2~3 個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)了疾病的緩解， 但隨后的觀察結(jié)果表明n-3 多不飽和脂肪酸的補(bǔ)充并沒有持續(xù)性地發(fā)揮緩解疾病的作用[7]。 在另一項(xiàng)人群研究中，IBD患者接受由3 種n-3 多不飽和脂肪酸混合的補(bǔ)充劑，之后的研究結(jié)果卻顯示接受混合補(bǔ)充劑的患者疾病復(fù)發(fā)率顯著高于對照組患者[8]。 此外，歐洲ESPEN 炎癥性腸病臨床營養(yǎng)指南中也指出，不推薦處在疾病緩解期的IBD 患者額外補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸[9]。

n-3 多不飽和脂肪酸可以通過結(jié)合細(xì)胞膜表面受體來充當(dāng)信號分子在體內(nèi)發(fā)揮調(diào)控生理功能的作用[10]。 游離脂肪酸受體4（free fatty acid receptor 4，F(xiàn)FAR4）是一種n-3 多不飽和脂肪酸受體，它高表達(dá)于腸道，參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)控，如促進(jìn)胰島素分泌、降血糖、促進(jìn)腸道激素分泌和脂肪細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)食欲和調(diào)節(jié)炎癥等[11]。大量研究表明FFAR4 介導(dǎo)了n-3 多不飽和脂肪酸的炎癥調(diào)控作用[12]。 然而人類遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，部分人群攜帶FFAR4基因R270H 突變，這種突變使FFAR4 對n-3多不飽和脂肪酸的響應(yīng)出現(xiàn)顯著下降[13]。 這些研究表明n-3 多不飽和脂肪酸對IBD 作用的不確定性，可能是部分患者攜帶FFAR4基因的失活突變所致。

因此，為了探明n-3 多不飽和脂肪酸在IBD 治療中不確定結(jié)果是否與FFAR4基因的缺失有關(guān)，分別對野生型 （WT） 小鼠和FFAR4基因缺失（FFAR4KO） 小鼠進(jìn)行8 周的富含n-3 多不飽和脂肪酸的魚油灌胃，然后再進(jìn)行結(jié)腸炎造模。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 在同時(shí)補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸的情況下，相較于WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠的結(jié)腸炎更加嚴(yán)重。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚油 （含質(zhì)量分?jǐn)?shù)70% EPA、 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%DHA）：四川德陽華太生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司；腸炎級葡聚糖硫酸鈉（DSS）：MP Biomedicals 公司；糞便隱血試劑盒、MPO 活性檢測試劑盒： 南京建成生物工程研究所有限公司；蘇木精-伊紅染色液：南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司；阿利新藍(lán)-核固紅染色液：生工生物工程（上海） 股份有限公司；RNA 提取試劑盒、SYBR Green mix：翌圣生物科技（上海）股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

WT 與FFAR4KO 健康雄性SPF 級別C57BL/6J小鼠在江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行繁育 （ 動物實(shí)驗(yàn)倫理審查編號為 JN No.20171030c0110506）。 飼養(yǎng)溫度20~26 ℃，相對濕度40%~70%；光照早上8 點(diǎn)開啟，晚上8 點(diǎn)關(guān)閉；常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

徠卡病理切片機(jī)：徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；賽默飛Multiskan Go 酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；eppendorf 低溫高速離心機(jī)：艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司；PCR 儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）儀：羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組及造模實(shí)驗(yàn)采用10 周齡小鼠，分別將8 只WT 小鼠和FFAR4KO 小鼠分籠， 每4只一籠。對每只小鼠進(jìn)行每2 d 一次的魚油灌胃，每只灌胃量為200 μL，持續(xù)8 周。待灌胃結(jié)束，用小鼠飲用水將DSS 配制成質(zhì)量濃度為2.5 g/dL 的溶液，讓小鼠自由飲用。 造模第1 天，記錄小鼠各項(xiàng)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行DSS 造模，每2 d 進(jìn)行DSS 溶液更換，持續(xù)造模至第7 天，第8 天進(jìn)行小鼠各項(xiàng)數(shù)據(jù)記錄。 同時(shí)在DSS 造模期間，繼續(xù)對小鼠進(jìn)行魚油灌胃。

1.3.2 數(shù)據(jù)記錄和組織樣本制備在DSS 造模期間，每日記錄小鼠體質(zhì)量、小鼠便血情況和糞便性狀。 用疾病活動指數(shù)（DAI）對小鼠結(jié)腸炎疾病程度進(jìn)行評分， 評分參照Murthy 等的評分系統(tǒng)[14]，DAI為小鼠體質(zhì)量變化分?jǐn)?shù)、便血分?jǐn)?shù)和大便性狀分?jǐn)?shù)之和。 待造模結(jié)束，乙醚麻醉小鼠后用斷頸法處死小鼠，取出小鼠結(jié)腸和脾臟，量取結(jié)腸長度，稱取脾臟質(zhì)量。 將遠(yuǎn)端結(jié)腸分為3 份，分別用于檢測MPO活性、炎癥因子mRNA 水平和病理切片。

1.3.3 結(jié)腸MPO 活性檢測結(jié)腸MPO 活性檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 炎癥因子mRNA 的檢測按照RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行小鼠結(jié)腸RNA 提取， 再根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行mRNA 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 采用實(shí)時(shí)定量PCR （qPCR） 檢測小鼠結(jié)腸炎癥因子mRNA 水平，PCR 程序如下：95 ℃變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，30 s 的變性和退火進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。 引物序列如表1 所示。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.3.5 結(jié)腸組織病理切片觀察和HE 染色將小鼠結(jié)腸浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中36~48 h 進(jìn)行固定。 然后， 將結(jié)腸組織依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、80%、90%乙醇溶液脫水（各30 min），再依次放入體積分?jǐn)?shù)95%、100%乙醇溶液中脫水2 次，每次20 min。脫水結(jié)束后，將結(jié)腸組織浸入二甲苯中2 次，每次15 min。 透明結(jié)束后，將結(jié)腸組織浸入60 ℃石蠟中2 次，每次60 min。 浸蠟結(jié)束后，用徠卡病理切片機(jī)進(jìn)行組織切片。 HE 染色前，將切片于60 ℃烘烤30 min。 待烤片結(jié)束，切片經(jīng)2 次二甲苯脫蠟（各5 min）， 然后依次放入體積分?jǐn)?shù)100%、95%、90%、80%、70%乙醇溶液中（各3~5 min），再放入水中3 min。 切片脫蠟復(fù)水結(jié)束，將切片放入蘇木精染色液中20 s，后放入自來水中返藍(lán)30 min。 待返藍(lán)結(jié)束，將切片放入體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇溶液中分化5 s，洗去過多的顏色，將切片用自來水返藍(lán)30 min，然后將切片依次快速浸入伊紅染色液、 體積分?jǐn)?shù)95%乙醇Ⅰ和Ⅱ、 體積分?jǐn)?shù)70%乙醇中， 并快速拿出，然后浸入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇中50 s、無水乙醇中2 min。 最后將切片浸入二甲苯中2 次（各3 min），進(jìn)行封片。 阿利新藍(lán)染色步驟根據(jù)試劑說明書進(jìn)行操作。 將HE 染色切片放于顯微鏡下進(jìn)行觀察組織損傷程度，采用Dieleman 等的評分系統(tǒng)[15]對結(jié)腸組織切片進(jìn)行組織損傷評分。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，組間比較采用LSD 法T檢驗(yàn)（*為P<0.05，** 為P<0.01，*** 為P<0.001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠體質(zhì)量的影響

由于腸道存在炎癥等情況，活動期結(jié)腸炎小鼠的體質(zhì)量會逐步減輕。 小鼠接受DSS 飲水后，膳食中添加n-3 多不飽和脂肪酸并每日對小鼠體質(zhì)量進(jìn)行記錄。如圖1 所示，觀察到造模的前7 d 中，WT小鼠和FFAR4KO 小鼠的體質(zhì)量之間并未出現(xiàn)顯著差異，但該段時(shí)間內(nèi)，相比WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠的平均丟失體質(zhì)量更大。 在造模的第7 天，F(xiàn)FAR4KO 小鼠體質(zhì)量相較于造模第1 天， 出現(xiàn)了明顯下降。 在造模的第8 天，兩組小鼠體質(zhì)量間出現(xiàn)了顯著的差異，F(xiàn)FAR4KO 小鼠體質(zhì)量顯著低于WT 小鼠。

圖1 膳食中n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠體質(zhì)量變化的影響Fig. 1 Effects of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on body weight of FFAR4KO mice

2.2 n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠DAI的影響

在活動期結(jié)腸炎期間， 小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、便稀、便血等表現(xiàn)，通過DAI 綜合上述指標(biāo)，評估小鼠在結(jié)腸炎造模期間疾病程度，DAI 越大，小鼠疾病程度越厲害。 觀察到在造模的第5 天，F(xiàn)FAR4KO 小鼠普遍出現(xiàn)了肉眼可見血便， 并在隨后的幾天內(nèi)，迅速出現(xiàn)稀便。 而同時(shí)間的WT 小鼠在第5 天偶有肉眼可見血便， 且在隨后的幾天內(nèi)病情發(fā)展緩慢。如圖2 所示，造模的第6 天，兩組小鼠DAI 出現(xiàn)了顯著的差異，F(xiàn)FAR4KO 小鼠的DAI 開始迅速上升。此結(jié)果從疾病癥狀方面表明，在同時(shí)補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸的情況下，相較WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠在結(jié)腸炎期間表現(xiàn)為更嚴(yán)重的疾病程度。

圖2 膳食中n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠DAI的影響Fig. 2 Effects of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on DAI of FFAR4KO mice

2.3 n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠結(jié)腸長度的影響

小鼠腸道經(jīng)DSS 造模以后會出現(xiàn)潰瘍等腸道損傷現(xiàn)象， 嚴(yán)重時(shí)會造成小鼠結(jié)腸長度的縮短。FFAR4KO 小鼠在同時(shí)接受DSS 刺激和n-3 多不飽和脂肪酸灌胃后， 其腸道長度在5.0~6.3 cm， 相較WT 小鼠，出現(xiàn)了結(jié)腸長度顯著的縮短（見圖3）。 此結(jié)果表明，在同時(shí)補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸的情況下，相較WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠在結(jié)腸炎期間腸道存在更嚴(yán)重的損傷。

圖3 膳食中n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠結(jié)腸長度的影響Fig. 3 Effects of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on colon length of FFAR4KO mice

2.4 n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠脾臟質(zhì)量的影響

結(jié)腸炎誘發(fā)體內(nèi)免疫反應(yīng)，由此造成的一種腸外表現(xiàn)為脾臟質(zhì)量增大。FFAR4KO 小鼠在同時(shí)接受DSS 刺激和n-3 多不飽和脂肪酸灌胃后，其脾臟質(zhì)量在0.19~0.25 g，與WT 小鼠相比，質(zhì)量顯著增加（見圖4）。此結(jié)果表明，在同時(shí)補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸的情況下，相較WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠在結(jié)腸炎期間，體內(nèi)存在更嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。

圖4 膳食中n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠脾臟質(zhì)量的影響Fig. 4 Effects of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on spleen weight of FFAR4KO mice

2.5 n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠結(jié)腸MPO 活性的影響

MPO 富含于中性粒細(xì)胞中，炎癥過程中，粒細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位并且聚集。 腸道MPO 活性可以表征炎癥的疾病程度。 如圖5 所示，F(xiàn)FAR4KO 小鼠結(jié)腸MPO 活性出現(xiàn)了顯著上升。 此結(jié)果表明，在同時(shí)補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸的情況下， 相較WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠在結(jié)腸炎期間，其腸道內(nèi)存在更嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。

圖5 膳食中n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠結(jié)腸MPO 活性的影響Fig. 5 Effects of dietary n-3 polyunsaturated fatty acidson the colonic MPO activity of FFAR4KO mice

2.6 n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠結(jié)腸炎癥因子mRNA 水平的影響

結(jié)腸炎病程中產(chǎn)生的許多細(xì)胞因子可以作為炎癥程度的評判指標(biāo)。 如圖6 所示，經(jīng)qPCR 檢測，F(xiàn)FAR4KO 小鼠結(jié)腸中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1 的基因表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著上升，而兩組間IL-10 的基因表達(dá)水平并未有顯著差異。 此結(jié)果從分子水平上表明，在同時(shí)補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸的情況下， 相較WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠在結(jié)腸炎期間，其腸道內(nèi)存在更嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。

圖6 膳食中n-3 多不飽和脂肪酸對FFAR4KO 小鼠結(jié)腸炎癥因子mRNA 水平的影響Fig. 6 Effects of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on mRNA levels of colonic inflammatory factors of FFAR4KO mice

2.7 小鼠腸道病理切片觀察及評分

如圖7 所示，HE 染色切片可以看出，WT 小鼠結(jié)腸黏膜層出現(xiàn)了部分炎癥細(xì)胞浸潤的情況，隱窩和腺體結(jié)構(gòu)的完整性和排列較為正常。 而FFAR4KO 小鼠的腸道黏膜層破壞較為嚴(yán)重， 具體表現(xiàn)為隱窩和腺體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，取而代替的是大量炎癥細(xì)胞浸潤。 AB 染色（阿利新藍(lán)-核固紅染色）可以將腸道腺體細(xì)胞中的黏液染成藍(lán)色，其余細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)染成紅色。 在AB 染色下可以更清楚地觀察到，相較WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠的腸道腺體結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重。對HE 染色切片進(jìn)行評分，根據(jù)結(jié)果可以看出FFAR4KO 小鼠的結(jié)腸切片評分更高。 此結(jié)果表明，在同時(shí)補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸的情況下， 相較WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠在結(jié)腸炎期間，其腸道內(nèi)存在更嚴(yán)重的黏膜損傷和炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。

圖7 小鼠結(jié)腸組織病理切片和評分Fig. 7 Histopathological sections and scores of mice colon

3 結(jié) 語

大量臨床研究表明，n-3 多不飽和脂肪酸具有出色的抗炎作用，在代謝性疾病、心血管類疾病的輔助治療中得到了合理的應(yīng)用[16]。 營養(yǎng)干預(yù)是IBD治療過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)， 但目前在臨床中，并不推薦IBD 患者額外補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸[9]，其原因并未見報(bào)道。 本文中，作者利用WT 小鼠和FFAR4KO 小鼠初步研究了在FFAR4基因存在與否的情況下n-3 多不飽和脂肪酸補(bǔ)充對結(jié)腸炎進(jìn)程的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于WT 小鼠，在結(jié)腸炎造模的同時(shí)，應(yīng)用富含n-3 多不飽和脂肪酸的魚油灌胃FFAR4KO 小鼠，會造成更為嚴(yán)重的結(jié)腸炎。經(jīng)過n-3 多不飽和脂肪酸干預(yù)的FFAR4KO 小鼠表現(xiàn)出更早的體質(zhì)量丟失， 更高的DAI。 此外FFAR4KO 小鼠的結(jié)腸長度顯著小于WT 小鼠，脾臟質(zhì)量顯著大于WT 小鼠。 小鼠結(jié)腸生化指標(biāo)和分子指標(biāo)檢測結(jié)果也表明FFAR4KO 小鼠結(jié)腸表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的炎癥。 觀察小鼠結(jié)腸組織病理切片可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FAR4KO 小鼠結(jié)腸黏膜中出現(xiàn)更多的炎癥細(xì)胞浸潤，隱窩和腺體結(jié)構(gòu)完整更差，破壞更為嚴(yán)重，具有更高的切片評分。

FFAR4 是一種長鏈多不飽和脂肪酸受體，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員，它在腸道高表達(dá)[17]。大量的研究表明，F(xiàn)FAR4 在體內(nèi)具有維持代謝穩(wěn)態(tài)和抑制炎癥的作用[18]。 Oh 等首先發(fā)現(xiàn)FFAR4 可以作為一種n-3 多不飽和脂肪酸受體來調(diào)控體內(nèi)代謝穩(wěn)態(tài)和炎癥[4]。 當(dāng)用n-3 多不飽和脂肪酸或者FFAR4的合成激動劑刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 后，細(xì)胞會表現(xiàn)出抗炎的M2 表型，但將FFAR4基因沉默后，n-3 多不飽和脂肪酸或FFAR4 的激動劑就不能表現(xiàn)出抗炎的表型。Ichimura 等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，相較于WT 小鼠，F(xiàn)FAR4KO 小鼠更容易表現(xiàn)出肥胖和高血糖的表型，當(dāng)用高脂飲食飼喂小鼠時(shí)，這種差異更加明顯，F(xiàn)FAR4KO 小鼠極易發(fā)展出肥胖和Ⅰ型糖尿病的表型[13]。更重要的是，研究者還發(fā)現(xiàn)在肥胖人群中存在著FFAR4基因的R270H 突變， 此突變大大增加了這類人群的肥胖發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。 鑒于此，作者猜測部分IBD 患者人群中可能同樣存在FFAR4的突變，補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸無益于這類患者的疾病緩解。 在此實(shí)驗(yàn)中，作者證明了相較于WT 小鼠， 額外補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸的FFAR4KO 小鼠會發(fā)展成為更嚴(yán)重的結(jié)腸炎。 同時(shí)此結(jié)果也表明，n-3 多不飽和脂肪酸可以通過FFAR4 起到緩解結(jié)腸炎的作用。 然而，n-3 多不飽和脂肪酸介入FFAR4KO 小鼠結(jié)腸炎的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，相較WT 小鼠，額外補(bǔ)充n-3 多不飽和脂肪酸會加重FFAR4KO 小鼠結(jié)腸炎。 此結(jié)果對n-3 多不飽和脂肪酸施用在臨床試驗(yàn)當(dāng)中的結(jié)果給出了一種可能的解釋， 并且此結(jié)果對未來IBD精細(xì)化營養(yǎng)干預(yù)提供了一定的參考依據(jù)。