寧亞維，周泓鑫，楊 正，馬俊美，劉 茁，張 巖，李 強,

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050000）

近年來，食物過敏性疾病在世界范圍內(nèi)的發(fā)生率呈現(xiàn)上升趨勢，已經(jīng)成為一個公眾性、全球性的健康問題[1]。松仁屬于八大類食物過敏原中的堅果類，堅果是致命性過敏反應(yīng)的最常見原因之一，常常引發(fā)患者出現(xiàn)蕁麻疹、惡心及味覺改變，嚴(yán)重時會出現(xiàn)急性哮喘、過敏性休克[2-4]等過敏性癥狀，患者即使接觸微量松仁也會引起過敏性疾病[5]。由于現(xiàn)階段對于松仁過敏尚無有效治療手段，過敏人群只能依賴食品標(biāo)簽識別避免日常飲食中出現(xiàn)松仁。然而松仁營養(yǎng)素種類豐富，常作為食品原料增加產(chǎn)品營養(yǎng)價值[6]。在食品生產(chǎn)過程中，含松仁的食品與其他食品共用生產(chǎn)線，可能導(dǎo)致交叉污染，但此類隱性過敏原是導(dǎo)致過敏的主要原因。此外，生產(chǎn)過程中包裝錯誤與原料處理不當(dāng)?shù)仍蛞苍黾恿怂扇蔬^敏患者的患病風(fēng)險[7-8]。因此，需要開發(fā)一種高靈敏檢測技術(shù)對食品中的松仁過敏原進行有效監(jiān)管。

目前，食品中過敏原的檢測技術(shù)主要包括基于DNA水平的檢測技術(shù)和基于蛋白質(zhì)水平的檢測技術(shù)兩大類?；贒NA水平檢測技術(shù)有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[9-10]、實時PCR（real-time PCR）[11]以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)[12]；基于蛋白質(zhì)水平的檢測技術(shù)，有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[13-14]、免疫印跡技術(shù)[15]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectromotry，LC-MS/MS）法[16-19]。目前我國針對食品中松仁過敏原檢測的研究較少。國外報道，Garino等[20]通過real-time PCR對復(fù)雜食品中松子過敏原進行特異性檢測。這類基于DNA水平的檢測技術(shù)原理是檢測食品中是否存在過敏原蛋白基因檢測過敏原，但檢測過程是針對編碼目的蛋白的基因序列，因此無法直接判斷過敏原是否存在，并且容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象[21]。Cabanillas等[5]通過ELISA提取了松子中的致敏蛋白Pin p 1，松子過敏原Pin p 1與裸子植物的2S白蛋白具有高度同源性，與被子植物的2S白蛋白具有低同源性，表明松子致敏蛋白Pin p 1特異性較低，因此會影響食品中松子過敏原的檢測準(zhǔn)確度。ELISA是目前應(yīng)用最廣泛的基于蛋白質(zhì)水平的過敏原檢測技術(shù)，具有靈敏性高、特異性強等優(yōu)點。但ELISA只能檢測一種致敏性蛋白質(zhì)，并且若加工過程中出現(xiàn)蛋白質(zhì)變性則會導(dǎo)致抗體無法識別從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此，有必要開發(fā)一種基于食品中松仁過敏原的高效、準(zhǔn)確的快速檢測技術(shù)。

質(zhì)譜技術(shù)具有高通量、高分辨率、高靈敏度等優(yōu)點，不僅可以避免加工過程中蛋白質(zhì)變性而引起的假陽性結(jié)果，而且可以避免同源性蛋白質(zhì)導(dǎo)致的假陽性問題，在食品中過敏原的定量檢測方面具有較高的優(yōu)勢。Sealey-Voyksner等[22]采用LC-MS/MS方法基于松仁過敏原pin 1和pin 2篩選了TLAQSLDVELETAR和DYSSFPLAGPASSSGGGGR兩條特征肽段，實現(xiàn)了定性檢測，但未開發(fā)高靈敏度定量檢測技術(shù)。Lee等[23]基于松仁過敏原以ALPNFGEVSELLEGISR為定量肽段建立了一種LC-MS/MS法檢測餅干中的堅果過敏原，其中松仁過敏原檢出限為10 mg/kg，方法檢出限相對較高。因此，有必要基于LC-MS/MS方法篩查高特異性特征肽段，開發(fā)高靈敏度松仁過敏原檢測技術(shù)。鑒于上述研究背景，本研究擬篩選松仁特異性肽段，建立一種UPLC-MS/MS對常見食品基質(zhì)中的松仁過敏原Pin k 2進行快速檢測，以期對食品中松仁過敏原進行高靈敏度檢測，為我國食品標(biāo)簽真實性檢驗及食品中松仁隱性過敏原的檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松仁、餅干、飲料、巧克力等食品隨機購買于河北石家莊。

三羥甲基氨基甲烷、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、碳酸氫銨、氯化鈣（均為分析純）美國Sigma-Aldrich公司；尿素（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；生物級TPCK-胰蛋白酶 美國SCIEX公司；正己烷、乙腈（均為質(zhì)譜級）美國Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純）天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；所有試劑均使用Watsons蒸餾水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

Easy-nLC 1000-Q-Exactive LCQ液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜、超濾離心管（10k Da）美國Thermo Scientific公司；Qtrap 5500超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀 美國ABSCIEX 公司；1-14K高速冷凍離心機 美國Sigma公司；ULTA-TURRAX分散機、Trayster digital渦旋混勻器 德國IKA公司；SHA-B恒溫振蕩水浴鍋等 常州潤華電器有限公司；離心管 德國Eppendorf公司；低蛋白吸附樣品瓶（250 μL）美國Waters公司；Proteonavi（2.0 mm×150 mm，5 μm）色譜柱 日本資生堂投資有限公司；C18富集柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）、C18分析柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?）北京樂潤峰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

取5 g松仁，加入50 mL水，使用豆?jié){機磨漿5 min，直至松仁顆粒完全溶解。將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水定容，配制成50 mg/mL的松仁標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

稱取1 g經(jīng)過研磨的樣品，加入5 mL正己烷脫脂，旋轉(zhuǎn)混勻15 min，4000×g離心15 min，重復(fù)脫脂操作兩次，脫脂后的樣品用氮氣吹干。后加入4 mL提取緩沖液（含2 mol/L尿素的50 mmol/L Tris溶液），混勻后旋轉(zhuǎn)振蕩提取1 h，6000×g離心20 min。移取500 μL上清液至2 mL離心管中，加入10 μL還原劑（500 mmol/L DTT），混勻后置于60 ℃水浴鍋，振蕩反應(yīng)30 min。將混合物冷卻至室溫后加入30 μL烷基化試劑（500 mmol/L IAA），混勻后暗處反應(yīng)30 min。加入420 μL的酶解緩沖液（500 mmol/L的碳酸氫銨溶液和1 mmol/L的氯化鈣溶液）和30 μL的胰蛋白酶（500 μg/mL）溶液，充分混勻后置于37 ℃水浴鍋孵育過夜。加入10 μL甲酸停止酶解反應(yīng)，將混合物室溫靜置5 min后于12000×g離心8 min，取上清液至10 kDa超濾離心管中，14400×g離心20 min。收集下層濾液利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行分析。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜測定條件

色譜條件：預(yù)柱：C18富集柱（100 μm×4 cm，5 μm，120 ?）；分析柱：C18分析柱（75 μm×15 cm，5 μm，120 ?）；進樣體積2 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B 為0.1%甲酸-乙腈溶液；洗脫程序：0～3 min，97%～93% A、3%～7% B；3～38 min，93%～78% A、7%～22% B；38～48 min，78%～65% A、22%～35% B；48～50 min，65%～10% A、35%～90% B；50～60 min，10% A、90% B；流速300 nL/min。

質(zhì)譜條件：配備蛋白專用Nanospray Flex電離源，采用正離子模式；掃描模式為Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70000；自動增益控制目標(biāo)1×106；掃描范圍m/z350～1800；dd-MS2分辨率17500；自動增益控制目標(biāo)1×105；隔離窗口m/z2.0；第一固定質(zhì)量m/z120.0；碰撞能量27 eV。

1.3.3.2 超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測定條件

色譜條件：采用色譜柱Proteonavi（2.0 mm×150 mm，5 μm）；流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；洗脫程序：0～2 min，90% A、10% B；2～4 min，90%～70% A、10%～30% B；4～7.5 min，70%～60% A、30%～40% B；7.5～9 min，60%～25% A、40%～75% B；9～11 min，25% A、75% B；11～11.01 min，25%～90% A、75%～10% B；11.01～15 min，90% A、10% B；流速300 μL/min；進樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源；正離子掃描模式；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子化電壓4000 V；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子源溫度450 ℃。

1.3.4 方法學(xué)驗證

1.3.4.1 線性關(guān)系、檢出限、定量限

使用空白基質(zhì)提取液將松仁標(biāo)準(zhǔn)儲備液（50 mg/mL）稀釋至質(zhì)量濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/mL的溶液。取500 μL上述溶液至2 mL離心管中，經(jīng)1.3.2節(jié)所述的還原、烷基化和酶解后得到酶解液。向酶解液中加入10 μL甲酸停止消化，然后12000×g離心8 min，取上清液過0.22 μm的羧甲基纖維素濾膜，收集濾液進行UPLCMS/MS分析。

線性方程以松仁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），松仁特征肽段的色譜峰面積作為縱坐標(biāo)（Y）進行計算（4 個平行）。分別以特征肽段獲得3 倍和10 倍信噪比時的松仁質(zhì)量濃度作為檢出限和定量限。

1.3.4.2 加標(biāo)回收率

分別向空白基質(zhì)中添加2、4、20 倍定量限的松仁標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，進行加標(biāo)回收率的測定，每個濃度設(shè)置6 個平行以計算方法精密度。為排除基質(zhì)對松仁特征肽段定量的影響，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線均使用該基質(zhì)所對應(yīng)的不含松仁的空白樣品提取液進行配制。

1.3.4.3 基質(zhì)效應(yīng)

精密移取一定量的松仁標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用不含松仁的餅干、巧克力和飲料空白基質(zhì)提取液梯度稀釋配成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液用于計算基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)按下式計算：

式中：slopematrix為空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；slopestandard為水溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.3.5 實際樣品檢測

固體樣品研磨為粉末后稱取1 g，移取液體樣品500 μL，將上述樣品按照1.3.2節(jié)方法進行前處理后，用標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的松仁含量進行定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

所有實驗均重復(fù)3 次取其平均值，通過Origin軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并對實驗結(jié)果進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征肽段的篩選

特征肽段對液相色譜-質(zhì)譜檢測方法的特異性和靈敏度具有重要影響。松仁過敏原Pin k 2屬于豌豆球蛋白，具有較好的熱穩(wěn)定性[24]，在食品加工過程中不易降解[25-26]。因此本研究針對松仁主要過敏原Pin k 2進行特征肽段篩選。將經(jīng)過酶解凈化后的樣品使用Easy-nLC 1000-Q-Exactive LCQ液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀進行分離分析，隨后結(jié)合Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫以及ProteinPilotTM軟件對得到的質(zhì)譜譜圖進行數(shù)據(jù)處理，得到大量的肽段信息（圖1）。然后按照以下的肽段篩選原則進行特征肽段的篩選：首先是對肽段長度的要求，應(yīng)為8～25 個氨基酸為宜，肽段過短難以滿足特異性要求，過長則容易在前處理過程中斷裂；其次，所選肽段不應(yīng)含修飾位點，也不應(yīng)漏切和錯切的酶切位點，以保證方法的可重復(fù)性；經(jīng)BLAST搜索后具有特異性，以免在其他物種中被檢測到，出現(xiàn)假陽性結(jié)果；在進行定性和定量分析時，具有較高的靈敏度和良好的峰形[27-30]。根據(jù)以上篩選原則，最終篩選了3 條符合條件的松仁特異性肽段，分別為ALPNFGEVSELLEGISR、LEILWFDINTSGNER、NNVLQTLEK。其中NNVLQTLEK肽段為本實驗中首次篩選到的特異性肽段。松仁過敏原與花生過敏原Ara h 3有重合的線性表位[31]，為了保證所篩選的肽段具有特異性，制備了花生、杏仁、核桃、芝麻、葵花籽、開心果和榛子等常見堅果的酶解樣品驗證松仁肽段特異性，結(jié)果顯示，所篩選的3 條松仁肽段均只在松仁酶解樣品中檢測到，而其他堅果酶解樣品均顯示未檢出。說明所篩選肽段具有高度特異性，可用于松仁過敏原檢測方法的開發(fā)。

圖1 Pin k 2的氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequences of Pin k 2

2.2 流動相及質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

在相同的梯度洗脫程序條件下，對比100%水、0.1%甲酸-水和100%乙腈、0.1%甲酸-乙腈分別作為流動相A和流動相B時特征肽段的響應(yīng)值和峰形。結(jié)果表明，以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈分別作為流動相A和流動相B，特征肽段的響應(yīng)值和峰形都更好，明顯改善了拖尾現(xiàn)象，且肽段的穩(wěn)定性較高。加入甲酸可以在一定程度上促進肽類物質(zhì)的電離，從而增強其質(zhì)譜信號，因此后續(xù)研究采用0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈分別作為流動相A和流動相B。

通過ProteinPilotTM得到的數(shù)據(jù)信息中可以得到特異性肽段的母離子和b、y離子參數(shù)，選取響應(yīng)值較高的b、y離子作為子離子。制備高濃度的松仁酶解樣品，通過蠕動泵以5 μL/min的速率直接注入Qtrap 5500質(zhì)譜儀中，以全掃描模式依次確定肽段的精確母離子、子離子以及其他質(zhì)譜參數(shù)，為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，每個肽段選取3 個子離子。優(yōu)化后的去簇電壓、碰撞能量參數(shù)見表1，優(yōu)化后的色譜圖見圖2。

表1 松仁特征肽段的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of characteristic peptides from pine nuts

圖2 松仁3 條特征肽段色譜圖Fig.2 Chromatograms of three characteristic peptides from pine nuts

2.3 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限、定量限

通過對方法線性關(guān)系、檢出限和定量限的測定考察方法的靈敏度和適用的濃度范圍。3 條特征肽段的線性關(guān)系、檢出限和定量限結(jié)果見表2。3 條特征肽段在餅干、巧克力和飲料3 種基質(zhì)中的線性良好，R2均能達到0.99以上。其中NNVLQTLEK在3 條特征肽段中靈敏度最高且穩(wěn)定性好，故選取NNVLQTLEK作為松仁定量分析肽段，其他兩條肽段作為輔助定性肽段。在餅干和巧克力這兩種固體基質(zhì)中，檢出限、定量限分別為1 mg/kg和2.5 mg/kg；在飲料基質(zhì)中，檢出限、定量限分別為0.005 mg/mL和0.01 mg/mL。目前對于松仁過敏原檢測的研究報道較少，Lee等[23]以ALPNFGEVSELLEGISR為定量肽段建立的LC-MS/MS法檢測餅干中的堅果過敏原，其中松仁過敏原檢出限為10 mg/kg。而本研究中篩選到的NNVLQTLEK肽段，檢出限（1 mg/kg）僅為該方法的十分之一，表明本方法可實現(xiàn)松仁過敏原的高靈敏度檢測。

表2 松仁3 條特征肽段的線性關(guān)系、檢出限和定量限（n ＝4）Table 2 Linear relationships,detection limits and quantification limits of three characteristic peptides in pine nuts (n=4)

2.3.2 加標(biāo)回收實驗結(jié)果

為考察方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性，在空白基質(zhì)中添加松仁標(biāo)準(zhǔn)儲備液進行加標(biāo)回收率和精密度的測定。松仁在餅干、巧克力和飲料3 種空白基質(zhì)中的加標(biāo)回收率如表3、4所示，在餅干基質(zhì)中的回收率在88.50%～107.57%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.94%～4.21%；在巧克力基質(zhì)中的回收率在96.60%～104.57%之間，RSD為2.22%～6.08%；在飲料基質(zhì)中的回收率在87.42%～108.20%之間，RSD在1.79%～4.89%之間。上述結(jié)果表明，此方法具有較好的準(zhǔn)確度且重復(fù)性好。

表3 松仁肽段餅干、巧克力基質(zhì)加標(biāo)回收率（n ＝6）Table 3 Recoveries of pine nut peptides from spiked biscuit and chocolate (n=6)

表4 松仁肽段飲料基質(zhì)加標(biāo)回收率（n ＝6）Table 4 Recoveries of pine nut peptides from beverage (n=6)

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

食品基質(zhì)會在一定程度上對目標(biāo)化合物起到促進或抑制作用，為驗證食品基質(zhì)是否對檢測方法有干擾，對定量肽段NNVLQTLEK的基質(zhì)效應(yīng)進行檢測。定量肽段NNVLQTLEK的基質(zhì)效應(yīng)如圖3所示，結(jié)果表明餅干的基質(zhì)效應(yīng)為89.77%，巧克力的基質(zhì)效應(yīng)為91.82%，飲料的基質(zhì)效應(yīng)為96.13%，結(jié)果均小于100%，說明餅干、巧克力、飲料對特征肽段均有不同程度的抑制作用，因此，后續(xù)研究均采用基質(zhì)配標(biāo)定量以補償基質(zhì)效應(yīng)。

圖3 肽段NNVLQTLEK水溶液與相應(yīng)空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of aqueous solution of peptide NNVLQTLEK and blank matrices spiked with peptide NNVLQTLEK

水：Y＝5.28510×105X+4.14375×104（R2＝0.9850）；餅干：Y＝4.74455×105X+3.94923×104（R2＝0.9829）；巧克力：Y＝4.85286×105X+3.40184×104（R2＝0.9893）；飲料：Y＝5.08075×105X+5.35166×104（R2＝0.9841）。

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

為了檢驗方法的適用性，自當(dāng)?shù)厥袌鲭S機購買了飲料、餅干和巧克力等樣品，利用所建立方法對其中的松仁含量進行定量，檢測結(jié)果如表5 所示。10 個餅干樣品中，有3 個樣品（分別為餅干-7、餅干-8以及餅干-9樣品）明確標(biāo)注含有松仁成分，檢測結(jié)果顯示樣品中均檢出松仁成分，含量范圍為（0.088±0.005）～（97.972±0.455）g/kg。其余7 個餅干樣品、6 個飲料樣品和6 個巧克力樣品對于過敏原信息的標(biāo)注均為“可能含有堅果”，但并未寫明具體所含堅果的種類，檢測結(jié)果顯示均未檢測出松仁。上述結(jié)果表明此方法可以應(yīng)用于食品標(biāo)簽準(zhǔn)確性的驗證，同時可以篩查未明確標(biāo)注松仁過敏原的食品中是否含有松仁成分。

表5 市售樣品中松仁含量Table 5 Pine nut contents in commercially available samples

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種UPLC-MS/MS檢測食品中松仁過敏原Pin k 2的方法。通過蛋白質(zhì)組學(xué)與高分辨質(zhì)譜結(jié)合成功篩選到3 條松仁特征肽段，進一步采用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式建立了食品松仁過敏原快速檢測方法。該方法具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢，可為我國食品標(biāo)簽真實性檢驗及食品中隱性過敏原的檢測提供技術(shù)支持。