黎世威，白 英

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

開菲爾是一種具有黏性、含有輕度酒精的乳飲料，呈酸性，其使用開菲爾粒作為發(fā)酵劑，通過牛乳發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。開菲爾原產(chǎn)于高加索和中東地區(qū)以及我國西藏或蒙古[1]，由于其有益健康，現(xiàn)已遍布世界各地。開菲爾由牛乳與開菲爾粒中的細(xì)菌（包括乳酸菌和醋酸菌）和酵母共同發(fā)酵而成[2]，乳酸菌分解乳糖產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖，促使酵母菌生長，引起乙醇發(fā)酵，并產(chǎn)生二氧化碳，酵母菌的生長繁殖又能對乳酸菌和醋酸菌的生長起促進(jìn)作用[3]。開菲爾發(fā)酵一般應(yīng)用到牛乳中，也涉及一些其他乳如羊乳、駝乳等。開菲爾粒呈白色至黃白色，形狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則，是像花椰菜一樣的“小花”，由多糖/蛋白質(zhì)基質(zhì)組成，這些胞外多糖被稱為Kefiran，對開菲爾粒結(jié)構(gòu)中微生物具有保護(hù)作用[4]，含有穩(wěn)定和特定的微生物群落，由不同的乳酸、醋酸菌和酵母菌組成，具有復(fù)雜的共生關(guān)系。這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了有機(jī)體生物活性，它們生長、繁殖，并將其特性傳遞給下一代新的開菲爾粒[5]，同時開菲爾粒的微生物區(qū)系相對比較穩(wěn)定，其活性在適宜的培養(yǎng)條件下可以維持較長時間。最開始的開菲爾粒被認(rèn)為是在貯存在由動物皮、腸或膀胱制成的容器中的牛乳中自發(fā)生長的，與特定的微生物種群有關(guān)，由這些微生物種群生產(chǎn)的飲料具有獨(dú)特的感官特性。

開菲爾由于其復(fù)雜的微生物組成及其獨(dú)特的營養(yǎng)價值，引起國內(nèi)外研究者的廣泛研究，從Web of Science上以“kefir”為主題檢索近10 年發(fā)表的研究型文章，共獲得1208 篇，下載含有摘要的文本文件后，用VOSviewer可視化分析軟件進(jìn)行關(guān)鍵詞網(wǎng)絡(luò)圖繪制，通過“密度”視圖（圖1）可以看出，目前對開菲爾的研究熱點(diǎn)主要集中于微生物菌株，尤其是乳酸菌的分離鑒定以及相關(guān)微生物特性的研究。開菲爾的微生物多樣性傳統(tǒng)上是通過培養(yǎng)方法鑒定不同物種來評估的，但此方法不能可靠完整地表征微生物生態(tài)系統(tǒng)，因此目前有研究者通過非培養(yǎng)方法，如變性梯度凝膠電泳和16S rRNA基因等保守基因文庫的構(gòu)建和分析，研究開菲爾及開菲爾粒的微生物組成。這些技術(shù)已經(jīng)檢測到所有常用的培養(yǎng)物種，以及一些以前未檢測到的微生物。通過培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)，乳酸菌已被確定為發(fā)酵產(chǎn)品中的主要成分，這從熱點(diǎn)圖中也可以反映出來。研究表明開菲爾的乳酸菌組成主要包括乳桿菌屬、醋酸桿菌屬、葡糖桿菌屬、芽孢桿菌屬、雙歧桿菌、乳球菌屬、孔鏈球菌屬、腸球菌屬和明串珠菌屬等[6]，酵母菌主要為克魯維酵母屬、假絲酵母屬、酒香酵母屬、畢赤氏酵母屬、釀酒酵母屬和哈薩克斯坦酵母屬[7-8]。然而，由于地域環(huán)境等因素，其微生物組成有著細(xì)微的差異，本文主要就不同地區(qū)開菲爾微生物組成及其發(fā)酵過程中微生物的相互作用等進(jìn)行綜述。

圖1 開菲爾近10 年研究內(nèi)容熱點(diǎn)及交互關(guān)系Fig.1 Interactive relations among hot research topics on kefir in recent ten years

1 開菲爾的微生物區(qū)系

組成開菲爾的微生物種類非常豐富，但幾乎都主要包括乳酸菌、醋酸菌和酵母菌，開菲爾中的優(yōu)勢細(xì)菌和真菌分別為Lactobacillus kefiranofaciens和Kluyveromyces marxianus。在此基礎(chǔ)之上，所處環(huán)境不同也會影響當(dāng)?shù)亻_菲爾微生物區(qū)系的多樣性，因此產(chǎn)生了一些其他地區(qū)來源開菲爾所沒有的特殊菌株，這些相同的特征菌株和特異菌株共同構(gòu)成了多樣的開菲爾微生物區(qū)系。

目前對于開菲爾菌種的研究結(jié)果大多來源于中國和土耳其的不同地區(qū)。國內(nèi)研究人員對西藏地區(qū)的開菲爾粒進(jìn)行了大量研究，Wang Xiaomeng等[9]對來自西藏的兩種不同開菲爾粒K1和K2及其發(fā)酵乳分別進(jìn)行高通量測序，并對擴(kuò)增出的細(xì)菌16S rRNA基因和真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的微生物多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩種開菲爾粒的細(xì)菌和真菌多樣性與其對應(yīng)發(fā)酵乳中細(xì)菌和真菌多樣性差異很大，并且在分類分析中，他們發(fā)現(xiàn)乳桿菌是兩種開菲爾粒中常見的優(yōu)勢菌種（98%），K1中豐度排名前3的物種為L.kefiranofaciens、Bifidobacterium psychraerophilum和Lactobacillus kefiri，而K2中豐度排名前3的物種為L.kefiranofaciens,Acetobacter lovaniensis和Enterococcus durans，其中的真菌主要為K.marxianus和Kazachstania turicensis，K.marxianus在K1發(fā)酵乳中可達(dá)到95.57%，占據(jù)了發(fā)酵乳糖的酵母種群的絕大部分；K.turicensis是K2中最豐富的物種，其在牛乳中培養(yǎng)48 h后，含量降低，此外在K2中還發(fā)現(xiàn)兩種K1中沒有的真菌Cutaneotrichosporon curvatus和C.cutaneum。上述作者研究的兩種開菲爾均出現(xiàn)了L.kefiranofaciens，且均占到了微生物種類的一半以上，這表明L.kefiranofaciens是這兩種開菲爾中的優(yōu)勢菌種。Zeng Xuejun等[10]也研究了3 種西藏開菲爾的微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，通過宏基因組測序得出的數(shù)據(jù)同樣證明了L.kefiranofaciens是這3 種開菲爾的優(yōu)勢菌種，同時在50 種最豐富的菌株中，45 種是3 種開菲爾粒共有的，可以認(rèn)為三者的優(yōu)勢微生物區(qū)系組成相近，此外3 種開菲爾中均含有一定量的糞腸球菌。Wang Xingxing等[11]研究了西藏地區(qū)開菲爾在自然培養(yǎng)和無菌培養(yǎng)兩種培養(yǎng)條件下的優(yōu)勢菌種，分析結(jié)果表明，無論培養(yǎng)條件和時間如何，L.kefiranofaciens都是其所研究的西藏地區(qū)開菲爾中唯一的穩(wěn)定的優(yōu)勢菌種。此外，將兩種開菲爾用戊二醛固定后在掃描電子顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)L.kefiranofaciens在開菲爾粒內(nèi)外部結(jié)構(gòu)中存在著不同形態(tài)，結(jié)構(gòu)外部的L.kefiranofaciens長約3.0 μm，內(nèi)部的長度為10.0 μm。Wang Shengyao等[12]的研究結(jié)果相同，利用掃描電子顯微鏡觀察開菲爾內(nèi)外部結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)L.kefiranofaciens內(nèi)部的長度長于外部（圖2），這可能是因?yàn)閮?nèi)部顆粒中的細(xì)胞可利用的營養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量有限，進(jìn)而導(dǎo)致顆粒不同部位的細(xì)胞生長階段有所差異。通常情況下，同一種菌株細(xì)胞更大通常是接近衰亡狀態(tài)的典型特征，內(nèi)部細(xì)菌由于生長環(huán)境限制，提前進(jìn)入衰亡階段。Tong Guangsen等[13]同樣在研究西藏地區(qū)的開菲爾時指出，發(fā)酵乳微生物群落的主導(dǎo)優(yōu)勢菌也為L.kefiranofaciens，此外Acetobacter syzygii和Lactococcus lactis也是其中的優(yōu)勢菌種，此外，還在發(fā)酵乳中觀測到Lactobacillus lactis、Leuconostoc pseudomesenteroides、Bacillus sporothermodurans、Lactobacillus parakefiri和Lactobacillus plantarum等，而其中核心真菌區(qū)系主要由K.marxianus、K.unispora和S.cerevisiae組成。發(fā)酵乳中分離出的真菌株K.unispora、P.fermentans、T.delbrueckii和S.cerevisiae等均為乳糖陰性，此類真菌需要依靠發(fā)酵乳中由其他微生物代謝產(chǎn)生的半乳糖和葡萄糖生長繁殖[14]。Wang Jiangyue等[15]從新疆地區(qū)開菲爾中分離出發(fā)酵所用的優(yōu)質(zhì)乳酸菌，共22 株Lactobacillus kefir、3 株L.pseudomesenteroides和2 株Leuconostoc mesenteroides，其中優(yōu)勢菌為L.kefiri，雖然與上述研究不同，其優(yōu)勢細(xì)菌并非L.kefiranofaciens，但L.kefiri也能代謝出合成開菲爾粒所需的胞外多糖。與以上國內(nèi)研究相類似，土耳其研究者Ilikkan等[16]對當(dāng)?shù)貎煞N開菲爾細(xì)菌和真菌的多樣性進(jìn)行了研究，16S rDNA和26S rDNA測序結(jié)果表示，其中一種優(yōu)勢菌為L.kefiranofaciens，另一種為Bifidobacterium longum，此外兩者均包含的菌株包括L.lactis和Lactobacillus helveticus等，而Nalbantoglu[17]和Yusuf[18]等的研究均證明其所研究的土耳其地區(qū)開菲爾優(yōu)勢細(xì)菌為L.kefiranofaciens。Bicer等[19]對土耳其當(dāng)?shù)? 種開菲爾進(jìn)行了微生物區(qū)系研究，發(fā)現(xiàn)在屬水平上主要為乳桿菌、乳球菌、鏈球菌、腸球菌、明串珠菌、乳桿菌、漫游球菌、不動桿菌、假單胞菌、梭菌、四球菌、果桿菌、腸球菌等。與此相似，馬來西亞的Zamberi等[20]、希臘的Kalamaki等[21]的研究結(jié)果也證明了其中的優(yōu)勢細(xì)菌為L.kefiranofaciens。然而，Yegin等[22]在對土耳其科尼亞地區(qū)的開菲爾進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他地區(qū)的開菲爾有顯著差異，宏基因組測序結(jié)果雖未檢測到L.kefiranofaciens，但最優(yōu)勢的菌屬仍為乳桿菌屬，其次為酒球菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬等，部分參考文獻(xiàn)所示國家和地區(qū)開菲爾優(yōu)勢菌種統(tǒng)計見表1。

表1 部分國家和地區(qū)開菲爾優(yōu)勢菌種Table 1 Dominant strains in kefir grains from some countries and regions

圖2 開菲爾的微觀結(jié)構(gòu)[12]Fig.2 Microstructure of kefir[12]

綜上所述，一般情況下，即使是不同地區(qū)的開菲爾，也大都含有L.kefiranofaciens和K.marxianus，這兩種菌株應(yīng)該分別為開菲爾發(fā)酵乳優(yōu)勢細(xì)菌和優(yōu)勢真菌，同時也是開菲爾的特征菌株。此外，在屬水平上一般含有乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬、醋酸桿菌屬、克魯維酵母屬、釀酒酵母屬、假絲酵母屬等[23-25]。L.kefiranofaciens負(fù)責(zé)生產(chǎn)Kefiran，這是一種水溶性多糖，是開菲爾粒的基本和關(guān)鍵成分，其具有很強(qiáng)的共聚集能力，能夠讓菌株聚集到一起[26]。而K.marxianus則是因?yàn)樗哂薪湍妇儆械睦萌樘前l(fā)酵能力，在開菲爾發(fā)酵乳中能夠正常生長繁殖，代謝產(chǎn)生細(xì)菌需要的維生素、氨基酸和其他基本生長因子[27]，為乳酸菌生長創(chuàng)造適宜的環(huán)境。L.kefiranofaciens和Saccharomyces turicensis具有較強(qiáng)的自聚集能力，并且開菲爾乳桿菌表現(xiàn)出顯著的生物膜形成特性，當(dāng)Turisensis和開菲爾乳酸菌菌株L.kefiranofaciens、L.kefiri共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)顯著的共聚集能力[12]，因此推斷L.kefiranofaciens和K.marxianus、K.turicensis與開菲爾粒形成有較大關(guān)聯(lián)。

2 開菲爾發(fā)酵乳的特性

2.1 開菲爾的益生性和功能性

開菲爾有著復(fù)雜的微生物區(qū)系，其中存在著一些表現(xiàn)出良好益生性的細(xì)菌和真菌，這些微生物可進(jìn)入腸道對人體腸道菌群產(chǎn)生影響[28-29]，表現(xiàn)出抗病原菌活性[30-31]和抗氧化活性[32]，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，為抵抗病原體和癌變提供了基礎(chǔ)。此外，這些微生物的初級代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物也表現(xiàn)出良好的功能性，對機(jī)體具有積極影響，是潛在的生物醫(yī)藥成分。

Walsh等[33]通過宏基因組測序在開菲爾微生物中檢測到與益生菌功能相關(guān)的基因，這些基因?qū)σ嫔誀畹恼{(diào)控是其呈現(xiàn)出益生性的基礎(chǔ)。Talib等[34]從開菲爾中分離出乳桿菌Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus paracasei和L.plantarum，這些乳桿菌在低pH值下的存活率很高，pH值為3和4時分別能達(dá)到（98.0±3.3）%和（96.1±1.7）%，在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%和0.5%時存活率分別可達(dá)到（96.89±0.02）%和（96.84±0.02）%，對膽鹽有著較高的耐受能力，同時對腸細(xì)胞顯示出較高的黏附能力（（96.3±0.01）%），沒有溶血活性，對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基表現(xiàn)出良好的清除活性，因此，開菲爾中的乳桿菌有作為益生菌食品和飲料的巨大潛力。在動物實(shí)驗(yàn)中，開菲爾被證明能夠緩解肥胖、2型糖尿病、血脂異常和非酒精性脂肪性肝病，這可能是通過調(diào)節(jié)宿主脂肪生成、脂質(zhì)氧化和減少全身炎癥實(shí)現(xiàn)的[35]，Bourrie等[36]研究證明開菲爾中的微生物能夠降低肝臟中編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶、過氧化物酶體增殖物激活受體γ和CD36中膽固醇和脂質(zhì)代謝的基因的表達(dá)，從而調(diào)控肥胖病癥。Zeng Xuejun等[37]使用從開菲爾中分離得到的L.kefiranofaciens和Saccharomyces cerevisiae對直腸癌模型小鼠進(jìn)行治療，結(jié)果顯示這兩種微生物對小鼠的微生物腸道菌群有著積極調(diào)節(jié)作用，降低了促炎細(xì)胞因子和癌細(xì)胞增殖指標(biāo)的表達(dá)，直腸癌得到緩解。

開菲爾的生物活性肽和代謝產(chǎn)物可作為有益健康的成分，對某些病毒有拮抗作用，并且可作為血友病患者骨質(zhì)疏松癥的補(bǔ)充治療[38]，孫敏等[39]從西藏開菲爾中分離篩選出一株干酪乳桿菌，該菌株可代謝產(chǎn)生抗菌肽，對大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923的生長具有良好的抑制作用。其抗菌機(jī)制主要包括破壞致病菌細(xì)胞膜、裂解細(xì)胞、降解核酸、抑制蛋白質(zhì)合成[40]。Wang Hao等[41]研究了來自中、美、徳三國的3 種開菲爾的蛋白圖譜，發(fā)現(xiàn)它們相似度較高，同時細(xì)菌多樣性具有很高的相似性，其中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白是潛在的抗高血壓物質(zhì)。Hurtado-Romero等[42]研究了從墨西哥開菲爾中分離出的乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、克魯維酵母等菌種的聚合能力、抗菌活性、藥物敏感性和體外胃腸道消化耐藥性，結(jié)果表明該益生菌的性能優(yōu)于市面上的益生菌，此外，這些細(xì)菌都有著不錯的γ-氨基丁酸生成能力，其中產(chǎn)量最高的是乳雙歧桿菌，可達(dá)到1.66 mmol/L。

開菲爾作為一個天然菌種庫，其中存在豐富的益生菌，同時其中的微生物還能產(chǎn)生具有良好功能性的代謝產(chǎn)物，這些都與開菲爾的微生物多樣性密切相關(guān)。

2.2 形成的風(fēng)味物質(zhì)

發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)來源主要包括乳本身的成分、微生物代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)以及加工過程中產(chǎn)生的物質(zhì)等[43-44]，而開菲爾風(fēng)味差異則主要來自于其中微生物的差異，不同乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)有著較大差異，且不同微生物之間的相互作用同樣會使發(fā)酵乳的風(fēng)味成分發(fā)生變化，進(jìn)而可以通過改變其中微生物的種類和數(shù)量來達(dá)到改變風(fēng)味成分的目的。

風(fēng)味物質(zhì)一般包括兩類，呈滋味和呈氣味的物質(zhì)，前者性質(zhì)一般比較穩(wěn)定，后者則一般為一些揮發(fā)性成分。開菲爾發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)的化學(xué)分類一般為糖、羧酸、醇、醛、酮、酯等成分[45]，其中糖包括原料乳中的乳糖、乳酸菌分解乳糖后得到的單糖，而細(xì)菌生成的胞外多糖由于分子質(zhì)量較大，一般不會對風(fēng)味有著直接貢獻(xiàn)，但胞外多糖對發(fā)酵乳的穩(wěn)定作用和增稠作用會使得發(fā)酵乳的口感得到提升[46]；羧酸則是脂肪酸水解、生化代謝過程和細(xì)菌代謝的結(jié)果[47]，在開菲爾中主要體現(xiàn)為乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸、醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的醋酸、丁酸等，但丁酸的氣味一般被認(rèn)為是令人不愉快的；醇類主要為酵母菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生的乙醇和乙醛通過乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化乙醇；醛、酮則是乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)，其中乙醛則被認(rèn)為是酸奶的特征風(fēng)味物質(zhì)[48]；酯類來源于有機(jī)酸和醇的反應(yīng)，多為乳酸酯、乙酸酯、丁酸脂等。微生物類群與風(fēng)味之間存在因果關(guān)系，添加L.kefiranofaciens增加了酯和酮的水平，而添加Leuconostoc mesteroides增加了乙酸和2,3-丁二酮的水平[33]。開菲爾在不同乳中發(fā)酵也有著顯著的風(fēng)味差異，例如在羊乳和牛乳中發(fā)酵產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)成分具有區(qū)別，羊乳樣品的乙酸平均含量顯著高于牛乳樣品，牛乳中不含檸檬酸，丙酮酸含量顯著高于羊乳，其余的揮發(fā)性成分無顯著差異，這可能是因?yàn)樵涎蛉楹团Ｈ橹械某煞植町?，?dǎo)致發(fā)酵后產(chǎn)生的代謝物水平也有所差異[49]。Guo Ting等[50]研究了新疆3 個開菲爾樣品，除上述風(fēng)味物質(zhì)以外，還包括烯烴和丁基羥基甲苯；用藏式開菲爾發(fā)酵的切達(dá)干酪中，酯類和醇類的數(shù)量較大，含量較多，風(fēng)味較強(qiáng)，其中的酯類呈現(xiàn)出水果香氣[51]。Hao Xiaona等[52]從開菲爾中分離出來的益生菌L.plantarum1-2形成了4 種獨(dú)特?fù)]發(fā)性成分，包括乙苯、十二烷、己醇和丙酮，與普遍情況下的成分有著較大差異。

開菲爾發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)同樣擁有一個相對穩(wěn)定的體系，包括糖、羧酸、醇、醛、酮、酯等，但受不同開菲爾中的不同菌種的影響，代謝物有著不同程度的差異，也體現(xiàn)出在共性中有著個體性差異的風(fēng)味成分。同時，伴隨著發(fā)酵過程中菌種的演替，開菲爾的揮發(fā)性風(fēng)味成分也處于一個動態(tài)變化過程中[53]，并且二者之間有著較為密切的關(guān)聯(lián)性[54]。

3 開菲爾中的菌落演替和相互作用

3.1 開菲爾發(fā)酵過程中的菌落演替

開菲爾是一個不同微生物群的獨(dú)特共生組合，其中微生物群的微小變化可能導(dǎo)致開菲爾產(chǎn)品的物理化學(xué)、流變學(xué)、感官和營養(yǎng)特性的顯著變化[55]，同時，即使是相同的開菲爾在不同條件下發(fā)酵，由于率先生長的優(yōu)勢菌株對后生長的菌株會產(chǎn)生不同的影響，發(fā)酵之后也會呈現(xiàn)出不同的效果[56]，帶來發(fā)酵過程中微生物群落的差異[57]。因此，研究開菲爾發(fā)酵過程中的菌落演替有利于了解其中潛在的菌種間相互作用、不同時間點(diǎn)下的優(yōu)勢菌，并可在相應(yīng)的時間點(diǎn)獲取所需要的代謝產(chǎn)物。

馬龍等[43]對新疆地區(qū)的開菲爾在25 ℃的發(fā)酵過程（每24 h取樣，共120 h）進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示在發(fā)酵過程中乳桿菌屬在48 h時豐度達(dá)到最大，而鏈球菌屬和芽孢桿菌屬在整個發(fā)酵過程中豐度呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢，在48 h達(dá)到最低，此外還有著少量乳球菌屬和葡萄球菌屬，以及微量嗜血桿菌屬和奈瑟氏菌屬，均隨著發(fā)酵進(jìn)行而降低，與其他開菲爾的發(fā)酵不同的是，此開菲爾中并沒有檢出大量的醋酸菌和酵母，二者幾乎不存在于發(fā)酵乳中，而在真菌豐度變化中，不同發(fā)酵時期有著不同霉菌存在，且真菌菌屬豐度占比呈逐漸減少趨勢。之后，在同樣條件下研究發(fā)酵過程中酵母菌落變化規(guī)律，證實(shí)了在發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量一直減少，72 h時達(dá)到最少，此時出現(xiàn)的真菌多為霉菌[58]。同樣以新疆地區(qū)開菲爾為研究對象，史大偉等[59]研究了發(fā)酵過程中細(xì)菌豐度變化，開菲爾發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性隨著發(fā)酵進(jìn)行而降低，然后達(dá)到穩(wěn)態(tài)，在屬水平上，0 h時相對豐度大于1%的屬有8 種，包括腸桿菌屬、蛭弧菌屬、嗜甲基菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、羅爾斯頓菌屬、彎曲桿菌屬、食酸菌屬、苯細(xì)菌屬，這些菌屬一般都少見于開菲爾中，可能是牛乳中的原始菌種；24 h時芽孢桿菌屬和腸桿菌屬達(dá)到最大，二者相對豐度達(dá)到了98%以上，其他菌屬非常少；48 h時主要為氣單胞菌屬、嗜熱桿菌屬和鏈球菌屬；72 h時主要為芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和氣單胞菌屬；96 h主要為芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和鏈球菌屬。王毛毛等[60]研究了開菲爾在整個發(fā)酵過程中的菌屬變化，隨著發(fā)酵的開始，牛乳中原始菌群豐度降低，乳桿菌屬和醋酸桿菌屬的相對豐度快速升高，發(fā)酵前期乳桿菌屬為優(yōu)勢菌，占據(jù)發(fā)酵的主導(dǎo)地位，相對豐度可占到92%以上，但隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，醋酸桿菌的相對豐度增加，使得醋酸桿菌的相對豐度在1%～8%之間，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵初期乳桿菌因?yàn)閰捬醢l(fā)酵生長較快，但隨著發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵乳中醇類的積累和供氧量的增加導(dǎo)致乳桿菌的生長受到抑制，而酵母和醋酸菌則受環(huán)境變化影響較小。Blasche等[61]研究了德國開菲爾在90 h內(nèi)的微生物生長狀態(tài)，認(rèn)為發(fā)酵過程根據(jù)優(yōu)勢微生物變化可分為6 個階段，第1階段以L.kefiranofaciens為主導(dǎo)，第2和第3階段則是乳酸乳桿菌和乳酸桿菌的快速生長，在第4階段時L.kefiranofaciens達(dá)到穩(wěn)定期，L.kefir則開始出現(xiàn)，到達(dá)第5階段時，幾乎所有物種的增長都停止，到達(dá)最后一個階段時，僅有Acetobacter fabarum和Lactobacillus kefiri大量生長。Walsh等[33]的研究也驗(yàn)證了這個結(jié)論，證明在發(fā)酵早期階段L.kefiranofaciens是穩(wěn)定的優(yōu)勢菌種，而在后期兩者卻存在差異，在他的研究中，后期優(yōu)勢菌種體現(xiàn)為明串珠菌屬。

綜合以上研究可以發(fā)現(xiàn)，由于不同地區(qū)開菲爾中微生物區(qū)系相差較大，菌落演替目前尚無具體可循規(guī)律，但其核心均為乳桿菌屬的菌種，而產(chǎn)生開菲爾多糖、促使開菲爾粒形成的L.kefiranofaciens可能是演替中頻繁出現(xiàn)的乳桿菌屬中的關(guān)鍵菌種。因此可以推斷，開菲爾粒的形成需要L.kefiranofaciens作為主導(dǎo)，以產(chǎn)生所需的胞外多糖Kefiran[26]。同時，由于L.kefiranofaciens、Lactobacillus kefiri和酵母較強(qiáng)的共聚集作用，使得開菲爾粒的形成始于L.kefiranofaciens和酵母的共聚集而形成小的顆粒[12]，然后開菲爾中的微生物和其他活性物質(zhì)與小顆粒發(fā)生黏附或聚集，最終形成開菲爾粒。此外，開菲爾中微生物營養(yǎng)素消耗、代謝產(chǎn)物積累以及整個生命活動過程對發(fā)酵環(huán)境產(chǎn)生的影響會對其他菌的生命活動產(chǎn)生影響，并且此種影響交互發(fā)生，進(jìn)而對開菲爾菌落演替產(chǎn)生影響。

3.2 開菲爾微生物相互作用

開菲爾中存在著豐富的細(xì)菌、真菌，這些微生物之間存在著穩(wěn)定的相互作用，一般包括菌種間的共生、拮抗作用。共生作用一般體現(xiàn)為各自的代謝物會對其他菌株的生命活動產(chǎn)生正面影響，例如乳酸菌可分解乳糖產(chǎn)生半乳糖和葡萄糖，以供酵母利用，酵母則為細(xì)菌提供生長因子等，以及生產(chǎn)出開菲爾粒形成所必須的胞外多糖[24]，從而使得微生物聚集絡(luò)合。張培等[56]發(fā)現(xiàn)從開菲爾中分離的乳酸菌和酵母菌共培養(yǎng)對各自細(xì)胞損傷有修復(fù)作用，對熱壓力和pH值壓力的應(yīng)答均有著顯著促進(jìn)作用，但共培養(yǎng)對同為開菲爾中優(yōu)勢乳酸菌的嗜熱鏈球菌和酵母菌的破損修復(fù)作用不顯著。鞏小芬[62]對分離出的明串珠菌、干酪乳桿菌、開菲爾乳桿菌和酵母菌進(jìn)行了抑菌圈拮抗實(shí)驗(yàn)，指出四者之間均無拮抗性，并且體現(xiàn)出良好的相互作用，乳酸菌與酵母菌接種比例為5∶1的復(fù)合發(fā)酵乳的凝乳時間從8～9 h縮短至6 h，并且獲得了更為良好的感官和風(fēng)味。Golowczyc等[63]對從開菲爾中分離出的20 株L.kefiri和Saccharomyces lipolytica進(jìn)行了聚集實(shí)驗(yàn)和血液凝集實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示其中6 株能與S.lipolytica發(fā)生共聚集作用，純化的L.kefiri的S層蛋白有較強(qiáng)的凝血能力，表明細(xì)菌表面蛋白的凝集素樣活性介導(dǎo)了其與酵母細(xì)胞的聚集，同時細(xì)菌表面的由多糖和蛋白質(zhì)形成的糖蛋白也是微生物間信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵，這可能與生物膜和開菲爾粒胞外基質(zhì)的形成有著極大的關(guān)聯(lián)。

如圖3所示，拮抗作用主要體現(xiàn)為代謝物的積累對微生物的生長產(chǎn)生影響。例如酵母和醋酸菌發(fā)酵積累乙醇、乙酸等，乙醇和乙酸濃度不斷增加會對細(xì)菌的生長繁殖產(chǎn)生抑制作用[60]，Lo等[64]以乳酸為唯一碳源培養(yǎng)K.marxianus，在不同的pH值條件下確定乳酸培養(yǎng)物中的最佳生長和釋放蛋白，并且發(fā)現(xiàn)通過高效液相色譜二級質(zhì)譜聯(lián)用鑒定的蛋白與三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，其研究結(jié)果表明，乳酸可誘導(dǎo)K.marxianus的生長和自溶，釋放蛋白質(zhì)和肽。因此在開菲爾中，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，乳酸菌代謝過程中不斷積累的乳酸會使得酵母菌發(fā)生自溶。

圖3 開菲爾中乳酸菌、酵母菌和醋酸菌之間的相互作用Fig.3 Interaction between lactic acid bacteria,yeast and acetic acid bacteria in kefir

3.3 生物膜形成

細(xì)菌生物膜是包裹在由胞外多糖、蛋白質(zhì)和DNA組成的細(xì)胞外聚合物質(zhì)中的結(jié)構(gòu)化細(xì)胞群落[65]。生物膜的一個主要特征是形成了細(xì)胞外多糖基質(zhì)，這有助于提高微生物對抗抗生素和酶的能力[66]，并且開菲爾表面具有非晶態(tài)特征，較粗糙的表面使其具有良好黏附性[67]。Wang Xiaomeng等[9]評估了開菲爾粒增殖速率、開菲爾胞外多糖的結(jié)構(gòu)特征，并通過使用Syto9綠色熒光核酸染料、碘化丙啶、異硫氰基熒光素標(biāo)記的刀豆球蛋白等染料對開菲爾發(fā)酵過程中的死、活細(xì)胞和胞外多糖進(jìn)行染色，進(jìn)一步驗(yàn)證了生物膜的形成，認(rèn)為生物膜主要是靠胞外多糖和開菲爾中細(xì)胞交疊形成的結(jié)構(gòu)，確定了乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖和生物膜對開菲爾粒形成有著直接影響。生物膜基本骨架是由多種胞外多糖組成的三維結(jié)構(gòu)，對細(xì)菌在固體表面的黏附以及細(xì)胞內(nèi)的聚集起關(guān)鍵作用，并且生物膜的黏著性在很大程度上受胞外多糖含量影響。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果[68]表明，開菲爾胞外多糖與乳蛋白存在相互作用，在中性水相介質(zhì)中，Kefiran與乳清蛋白的相互作用導(dǎo)致粒徑增大以及電位絕對值減小，而在發(fā)酵乳體系中，Kefiran使得發(fā)酵乳粒徑增大，Zeta電位絕對值降低，熒光強(qiáng)度減小，其微觀結(jié)構(gòu)為片狀結(jié)構(gòu)，表面形成了部分網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，黏彈性顯著增加。Han Xue等[69]證明了活菌數(shù)與生物膜的形成無直接關(guān)系，主要依賴于微生物代謝積累到胞外的生物大分子，認(rèn)為開菲爾生物膜的形成主要與K.marxianus有關(guān)，該酵母具有極強(qiáng)的疏水性和共聚集能力，使其具有強(qiáng)大的生物膜形成性能。與其研究結(jié)果相似，筆者所在實(shí)驗(yàn)室從開菲爾發(fā)酵乳及開菲爾粒中分離出的開菲爾胞外多糖的微觀結(jié)構(gòu)明顯不同，且來自開菲爾粒的胞外多糖由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其具有較強(qiáng)絮凝活性[70]。此外，由于開菲爾粒及開菲爾發(fā)酵乳中微生物的種類不同，所產(chǎn)胞外多糖的結(jié)構(gòu)及功能也不同，這一點(diǎn)可從本研究團(tuán)隊(duì)前期對乳酸菌胞外多糖的研究結(jié)果[71-72]中得到證實(shí)。

此外，Dong Jian等[73]還驗(yàn)證了醋酸菌也能在發(fā)酵過程中產(chǎn)生生物膜，這可能是開菲爾形成的關(guān)鍵，見圖4。與其他研究人員類似，Dong Jian等[73]也認(rèn)為開菲爾粒的形成分為兩個階段，第一階段是生物膜形成，在酵母的共聚集作用下，乳酸菌、醋酸菌和酵母菌結(jié)合到一起，黏附在醋酸菌產(chǎn)生的生物膜上，進(jìn)而形成開菲爾基質(zhì)生物膜；第二階段為開菲爾粒形成，開菲爾基質(zhì)生物膜形成后由于胞外多糖的作用折疊成封閉的囊泡結(jié)構(gòu)，最終形成開菲爾粒，但不同之處在于他們認(rèn)為生物膜的形成是以醋酸菌作為主導(dǎo)。總之，生物膜的形成源自于微生物代謝物和微生物之間以及微生物與微生物之間的相互作用，同時也是開菲爾粒形成的基礎(chǔ)。

圖4 開菲爾粒的形成機(jī)制與過程[73]Fig.4 Formation mechanism and process of kefir grains[73]

4 結(jié)語

綜上所述，開菲爾的微生物多樣性體現(xiàn)為不同開菲爾之間存在著同一性菌種和差異性菌種，這些開菲爾中的微生物在發(fā)酵乳中體現(xiàn)出豐富的功能性，積累的代謝產(chǎn)物具有良好風(fēng)味，同時其分泌的生物大分子物質(zhì)和微生物之間聚集形成生物膜。目前，對開菲爾的研究已經(jīng)在各個領(lǐng)域里展開，在益生性和功能性方面有著巨大的研究潛力。除此之外，還包括豐富的風(fēng)味成分和有益代謝物，這一切都源于開菲爾復(fù)雜的微生物區(qū)系和其中微生物與微生物及發(fā)酵環(huán)境之間的動態(tài)影響。已有很多學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)對開菲爾體系研究作出推論和驗(yàn)證，但這個復(fù)雜的共生體系和開菲爾粒形成的具體機(jī)理仍需要進(jìn)一步探究，同時開菲爾是一個豐富的菌種庫，從中篩選出生產(chǎn)所需要的菌株，研究其功能特性，仍然是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本研究團(tuán)隊(duì)目前正在針對內(nèi)蒙古不同地區(qū)開菲爾粒中微生物進(jìn)行分離鑒定，同時對其相互作用進(jìn)行研究，以期為揭示開菲爾粒的形成機(jī)理提供一定的研究基礎(chǔ)。