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        綿羊源溶血性曼氏桿菌A2型的分離鑒定及耐藥性分析

        2024-02-06 09:58:58梁纖纖鄭啟銘李曉卓馮繼紅劉文鍇韓翔舒阿卜杜熱合曼努爾麥麥提蘇戰(zhàn)強(qiáng)
        草食家畜 2024年1期
        關(guān)鍵詞:肉湯溶血性肺臟

        梁纖纖,鄭啟銘,李曉卓,馮繼紅,李 月,劉文鍇,韓翔舒,阿卜杜熱合曼·努爾麥麥提,蘇戰(zhàn)強(qiáng)*,夏 俊*

        (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830000;2.新疆昌吉呼圖壁縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,新疆 昌吉 831100;3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心,烏魯木齊 830000;4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(省部共建),烏魯木齊 830000;5.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832061)

        溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica,MH)是巴氏桿菌科曼氏桿菌屬的革蘭氏陰性菌,寄生在反芻動(dòng)物的上呼吸道中,能夠?qū)е聞?dòng)物肺炎乃至死亡,屬于條件性致病菌,宿主常常在斷奶、惡劣天氣、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激情況下發(fā)病[1]。MH共分12個(gè)血清型,臨床分離株主要以A1、A2、A6為主[2],A1通常在牛呼吸道檢出,而A2、A6為感染羊的主要血清型[3]。由MH引起的牛、羊等反芻動(dòng)物的呼吸道疾病具有較高發(fā)病率和死亡率,給我國(guó)乃至全世界的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響[4]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于溶血性曼氏桿菌病的報(bào)道較多,也有學(xué)者進(jìn)行關(guān)于MH 的滅活疫苗的研究,但由于各血清型之間交叉免疫保護(hù)性較低,疫苗的免疫譜窄,疫苗保護(hù)效果不理想,目前該病仍缺乏有效的防治手段[5,6]。本研究采集病死綿羊肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、病原學(xué)研究、小鼠致病性分析和藥敏試驗(yàn),為后續(xù)MH的實(shí)驗(yàn)室診斷及疫苗的研發(fā)提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 樣品來(lái)源

        阿勒泰地區(qū)某羊場(chǎng)部分羊只出現(xiàn)咳嗽氣喘、精神萎靡、體溫升高等臨床癥狀,病死羊只剖檢可見(jiàn)肺臟嚴(yán)重充血。送檢病死綿羊肺臟組織4份。

        1.1.2 主要材料

        馬丁肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自索萊寶科技有限公司;DL2000核酸Marker購(gòu)自賽國(guó)生物科技有限公司;藥敏片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

        1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

        18~22 g健康雌性BALB/c小鼠12只,購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防與控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化

        在超凈工作臺(tái)中嚴(yán)格無(wú)菌操作,將肺臟組織接種于馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)后挑取半透明狀單菌落再次接種于馬丁肉湯液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)16~18 h,觀察生長(zhǎng)情況,并將純化培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢觀察其形態(tài)。

        1.2.2 PCR鑒定及血清型鑒定

        使用文獻(xiàn)建立的MH特異性[7]PCR 方法進(jìn)行鑒定,經(jīng)鑒定后采用KLIMA等[8]建立的MH A1、A2和A6 血清型特異PCR 方法,對(duì)MH 血清型進(jìn)行鑒定,引物序列如表1。反應(yīng)體系為常規(guī)50 μL,瞬離后混合均勻置于PCR 擴(kuò)增儀中,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃循環(huán)變性30 s,退火溫度為58 ℃復(fù)性20 s,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán),72 ℃終延伸5 min,最后于4 ℃保存。配制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,參照DNA 2000 Marker,判斷產(chǎn)物的序列大小是否與目標(biāo)值一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果于NCBI進(jìn)行BLAST。

        表1 引物序列

        1.2.3 藥敏試驗(yàn)

        采用K-B 紙片法檢測(cè)MH 分離株對(duì)20 種抗菌藥物包括青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、阿奇霉素、林可霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、多黏菌素B、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明進(jìn)行敏感性測(cè)定。吸取200 μL細(xì)菌純培養(yǎng)物,均勻涂布于馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基上,吸收5 min 后,將藥敏片等距貼于培養(yǎng)基上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后判定結(jié)果,藥敏結(jié)果判定按CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

        1.2.4 小鼠致病性試驗(yàn)

        使用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)得該分離株的含菌量為1.664×109CFU,將12只小鼠隨機(jī)分為兩組,A組每只腹腔注射0.2 mL 分離株純培養(yǎng)物,B 組每只腹腔注射相同劑量的無(wú)菌PBS。觀察小鼠精神狀態(tài),如出現(xiàn)死亡,立即剖檢觀察肺臟病理變化,并采集死亡小鼠心血及肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化

        將肺臟組織接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)后,可見(jiàn)露滴狀、表面光滑、邊緣整齊、呈正圓形的半透明菌落,挑取單菌落接種馬丁肉湯液體培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)后,進(jìn)行革蘭染色,鏡檢可見(jiàn)短桿狀、粉紅色兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌。見(jiàn)圖1,圖2。

        圖1 馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

        圖2 革蘭氏染色鏡檢(物鏡100×)

        2.2 PCR鑒定及血清型鑒定

        細(xì)菌純培養(yǎng)物經(jīng)MH 特異性PCR 擴(kuò)增后獲得約206 bp 大小目的條帶,見(jiàn)圖3,再進(jìn)行血清型鑒定,得到約106 bp大小目的條帶,見(jiàn)圖4,與血清A2型目的條帶大小相符,因此判定該分離株為A2型菌株。

        圖3 分離株特異性PCR鑒定結(jié)果

        圖4 分離株血清型PCR鑒定結(jié)果

        2.3 致病性試驗(yàn)

        試驗(yàn)組6 只小鼠注射菌液6 h 后開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡,眼部分泌紅黃色炎性物質(zhì),排黃色混濁尿液,隨后幾小時(shí)內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)死亡,15 h內(nèi)全部死亡。對(duì)照組小鼠24 h內(nèi)全部存活,無(wú)異常表現(xiàn)。將死亡小鼠剖檢,采集心血和肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定,與MH相符。

        2.4 藥敏試驗(yàn)

        藥敏結(jié)果如圖5、圖6所示,該分離株對(duì)青霉素、頭孢唑林、氨芐西林敏感;對(duì)包括頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、阿奇霉素、多黏菌素B、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、克林霉素、林可霉素、阿米卡星、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素在內(nèi)的17種抗菌藥物耐藥。

        圖5 藥敏試驗(yàn)1

        圖6 藥敏試驗(yàn)2

        3 討論與結(jié)論

        隨著新疆養(yǎng)羊業(yè)的蓬勃發(fā)展,養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,羊患病的風(fēng)險(xiǎn)也日益突出,尤其是羊呼吸系統(tǒng)疾病,主要由支原體、巴氏桿菌和曼氏桿菌引起。曼氏桿菌不僅能使羔羊發(fā)病,也能感染成年羊,一旦發(fā)病,病羊則會(huì)消瘦、咳嗽氣喘,嚴(yán)重者還會(huì)死亡,制約了新疆養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。國(guó)內(nèi)外關(guān)于牛曼氏桿菌的報(bào)道很多,關(guān)于羊的研究卻不夠全面。目前有學(xué)者研究關(guān)于羊曼氏桿菌的滅活疫苗,臨床使用效果卻不佳,可能是由于血清型不同,難以達(dá)到交叉保護(hù)的效果,要制備具有交叉保護(hù)效果的疫苗,關(guān)于曼氏桿菌血清型的研究必不可少。聶荷蓮[9]等的研究中說(shuō)明溶血性曼氏桿菌A2型的主要來(lái)源是羊,江蘇地區(qū)的溶血性曼氏桿菌A2 型也是來(lái)源于羊。本研究從新疆地區(qū)的綿羊中也分離到了溶血性曼氏桿菌A2型,為后續(xù)曼氏桿菌的研究和疫苗制備提供參考。

        本研究中的分離株僅對(duì)青霉素、頭孢唑林、氨芐西林敏感,對(duì)其他頭孢菌素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、多肽類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、氯霉素類(lèi)、林可酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)等多種抗菌藥耐藥,可能是由于新疆地區(qū)治療溶血性曼氏桿菌病僅依靠抗菌藥物,導(dǎo)致多重耐藥性的產(chǎn)生。郜敏[10]等的研究顯示四川MH分離株鏈霉素、阿奇霉素、頭孢氨芐、恩諾沙星和頭孢噻吩耐藥,其中復(fù)方新諾明耐藥性最強(qiáng)。本研究耐藥性的結(jié)果與該研究基本一致,但與馮旭飛[4]等報(bào)道中MH 分離株對(duì)四環(huán)素、氟苯尼考、氧氟沙星、恩諾沙星等大部分藥物敏感的結(jié)果存在很大差異,可能由于養(yǎng)殖過(guò)程中大量使用相關(guān)抗菌藥物有關(guān)。本研究中的MH存在多重耐藥性,可為后續(xù)MH耐藥基因的研究提供參考,本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明該養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)于溶血性曼氏桿菌病的治療用藥情況需要改進(jìn)。

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