張睿泓，張成成，張炳玨，王成艷，馬永順，王昕澤，杜光光，李海霞*

（1.長(zhǎng)春市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，長(zhǎng)春 130000；2.杭州譜育科技發(fā)展有限公司，杭州 310000）

β-受體激動(dòng)劑藥物，屬于腎上腺素類的合成藥物[1]，于90年代末流入我國(guó)，廣泛用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，此類藥物并非自然產(chǎn)物，而是人工合成的化學(xué)藥物[2]。它們的主要作用是促進(jìn)畜禽快速生長(zhǎng)，并顯著提高瘦肉率。但因?yàn)榇祟愃幬镌趧?dòng)物體內(nèi)代謝慢，殘留時(shí)間長(zhǎng)，人類長(zhǎng)期食用后可能引起心悸、惡心并可伴有肌肉震顫等中毒癥狀，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害[3]，因此全世界各個(gè)國(guó)家均將其列為禁用藥物。至今，主要有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)技術(shù)GC-MS[4-5]、酶標(biāo)抗體法ELISA[6-7]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)HPLC-MS/MS[8-10]等檢測(cè)方法，但這些方法大多存在樣品提取凈化過(guò)程復(fù)雜、成本高、再現(xiàn)性差等缺陷，另有一些檢測(cè)方法雖然提取過(guò)程簡(jiǎn)單但是存在樣品假陽(yáng)性率高的問(wèn)題，不適用于準(zhǔn)確定量檢測(cè)。因此，本方法以現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為基準(zhǔn)，優(yōu)化檢測(cè)方法，不僅高效準(zhǔn)確的完成檢測(cè)過(guò)程，更能減少有機(jī)試劑的用量，安全環(huán)保，更好的滿足牛肉樣品的大批量檢驗(yàn)檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與供試材料

乙腈、甲酸、正己烷、乙酸純度均為色譜純；沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺濃度均為1 000 mg/L；萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、克倫特羅-D9 濃度均為100 mg/L。購(gòu)買來(lái)源：上海安譜有限公司。QC樣品：稱?。?0±0.01）g牛肉新鮮樣品，攪碎至均勻糜狀，冷凍保存。

1.2 主要儀器設(shè)備

EXPEC 5210 超高效液相—三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（杭州譜育科技發(fā)展有限公司）、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二元泵、柱溫箱、AL104-IC 型分析天平、H1750R 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、EOFO-945617型渦旋混合器、N-EVAP112型氮吹儀、NL1E-63型超聲清洗機(jī)。

1.3 試驗(yàn)過(guò)程

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置

精確量取三種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.1%甲酸水稀釋至1.0～50.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 目標(biāo)物提取

準(zhǔn)確稱量（2.00±0.01）g 均勻試樣置于50 mL 離心管中，加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)液，混勻，靜置30 min，加10 mL 0.1%乙酸乙腈溶液，震蕩混勻，再超聲提取，高速離心5 min（轉(zhuǎn)速為：10 000 r/min），40℃，取全部上清液氮?dú)獯蹈桑尤? mL 水以飽和正己烷，渦旋混勻，繼續(xù)加0.5 mL 0.1%甲酸水溶液，劇烈震蕩，取水層經(jīng)濾膜凈化后，待測(cè)。

1.3.3 色譜和質(zhì)譜條件

1.3.3.1 液相色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18 分離分析柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水；B：乙腈；柱流速：0.4 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL；洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.3.3.2 質(zhì)譜條件 依據(jù)廠商推薦及進(jìn)一步優(yōu)化后設(shè)定質(zhì)譜條件，具體參數(shù)見表2

表2 正離子模式下三種β-受體激動(dòng)劑的MRM參數(shù)（ESI+）

1.3.3.3 特征離子色譜圖和定量離子對(duì) 圖1中a、b和c為1 ng/mL 的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇以及對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)定量離子流色譜圖，圖2分別為3種β-受體激動(dòng)劑的兩個(gè)選擇離子質(zhì)譜圖。

圖1 定量色譜圖

圖2 三種β-受體激動(dòng)劑的2種選擇性離子質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍、檢出限和定量限

用0.1%甲酸水準(zhǔn)確配置標(biāo)準(zhǔn)序列曲線濃度，經(jīng)儀器檢驗(yàn)分析，采用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，結(jié)果見表3。

表3 三種β-受體激動(dòng)劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ

2.2 回收率和精密度

分別向牛肉樣品添加3水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。并重復(fù)測(cè)定6次，內(nèi)標(biāo)法定量。回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表4。最后得出克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的回收率依次為92.2%～105.7%、94.3%～107.9%和92.2%～102.3%，回收率范圍均在60%～120%之間，重復(fù)測(cè)定下計(jì)算精密度結(jié)果具體為1.1%～4.2%、2.2%～3.7%和1.7%～3.0%，完全滿足標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417-2017[11]中對(duì)于準(zhǔn)確度的相關(guān)要求，同時(shí)對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行試驗(yàn)分析，所得結(jié)果見表5。結(jié)果表明，質(zhì)控樣品結(jié)果均在特性值區(qū)間內(nèi)，回收率滿足檢驗(yàn)要求，依次判斷檢測(cè)方法可靠，有效。

表4 三種目標(biāo)物在牛肉中的加標(biāo)回收率和精密度

表5 質(zhì)控樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

3.1 樣品處理與儀器條件的優(yōu)勢(shì)

本方法選用0.1%乙酸乙腈溶液為提取液，高速離心振蕩提取。與傳統(tǒng)方法相比，省去過(guò)凈化柱這一步驟，在節(jié)省試劑耗材成本的同時(shí)縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。對(duì)HPLC-MS/MS 色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，以0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動(dòng)相，通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化后目標(biāo)物均在7 min內(nèi)檢測(cè)完畢，有效縮短檢驗(yàn)時(shí)間，減少有機(jī)試劑的使用，從而減少了對(duì)環(huán)境的污染。

3.2 前處理過(guò)程注意要點(diǎn)

選用水飽和正己烷作為去脂溶液，且為了避免復(fù)溶后樣品乳狀嚴(yán)重的問(wèn)題，需要注意應(yīng)先加入水飽和正己烷混勻后再加入復(fù)溶液的方法。此方法不僅復(fù)溶液雜質(zhì)更少，又能避免乳狀物的形成，進(jìn)一步縮短了檢驗(yàn)時(shí)間。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)創(chuàng)建了一套檢測(cè)牛肉中β-受體激動(dòng)劑的快速分離方法，該方法精簡(jiǎn)了前處理提取步驟、優(yōu)化了色譜和質(zhì)譜條件，最終得到了較為高效、便捷靈敏、可靠、準(zhǔn)確的樣品分析檢驗(yàn)方法，該方法有助于提升牛肉產(chǎn)品的安全性，避免因殘留超標(biāo)而對(duì)消費(fèi)者健康造成潛在威脅。