趙愛萍，官瑩潔，陳啟霞，林珊珊，戴尚征，林滿遍

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004； 2.福州市倉山區(qū)倉山鎮(zhèn)衛(wèi)生院，福建 福州 350007； 3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122； 4.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院，福建 福州 350003）

國內(nèi)流行病學(xué)橫斷面調(diào)查顯示，成年人慢性腎臟病患病率已增長至10.8%［1］，本病一旦發(fā)展至終末期則將不可逆轉(zhuǎn)，其發(fā)病機制復(fù)雜多樣，其中氧化應(yīng)激對病情發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要［2］。核因子E2相關(guān)因子2 （Nrf2）是調(diào)節(jié)人體抗氧化物表達的關(guān)鍵性因子，可通過識別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件來調(diào)控一系列下游保護性基因，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、過氧化氫酶（CAT）等［3］。目前，臨床尚無治愈慢性腎臟病的藥物，中醫(yī)藥對改善患者臨床癥狀、延緩腎功能進展有著一定的作用。

益腎清濁湯是全國名老中醫(yī)阮詩瑋教授基于“肝腎同源” 理論，總結(jié)多年臨床經(jīng)驗而擬定的方劑，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該方可降低慢性腎臟病患者尿蛋白水平，可能與氧化應(yīng)激水平有關(guān)［4］。本研究考察益腎清濁湯聯(lián)合常規(guī)治療對肝腎陰虛型慢性腎臟病患者的臨床療效，試圖從信號通路角度闡述其干預(yù)機制，以期為相關(guān)治療提供更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2021 年2 月至2021 年12 月就診于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院、福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院的76 例肝腎陰虛型慢性腎臟病患者，隨機分為對照組和觀察組，每組38 例，2 組一般資料見表1，可知差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。同時，從福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院體檢科選擇20 例同年齡層的健康體檢者，其中男性12 例，女性8 例； 平均年齡（57.40±5.41）歲。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號2019-043-02）。

表1 2 組一般資料比較（x±s，n＝38）Tab.1 Comparison of general data between the two groups （±s，n＝38）

表1 2 組一般資料比較（x±s，n＝38）Tab.1 Comparison of general data between the two groups （±s，n＝38）

組別性別／例男女平均年齡／歲原發(fā)病類型／例慢性腎炎糖尿病腎病高血壓腎病多囊腎多發(fā)性骨髓瘤觀察組221656.45±5.971713710對照組231555.00±6.991912511

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)（慢性腎臟?。﹨⒄铡堵阅I臟病早期篩查、診斷及防治指南》［5］，①腎臟損傷，包括白蛋白尿、尿沉渣異常、腎小管病變、影像學(xué)檢查異常、組織學(xué)檢查異常、腎移植病史，6 項中滿足1 項即可； ②估算腎小球濾過率（eGFR）＜60 mL／ （min·1.73 m2），①或②中滿足1 項，持續(xù)時間≥3 個月即可確診。另外，本研究納入的是慢性腎臟病3 期患者，故eGFR 需≥30 mL／ （min·1.73 m2）且＜60 mL／ （min·1.73 m2）。

1.2.2 中醫(yī)（肝腎陰虛證）參照《中藥新藥臨床指導(dǎo)原則》［6］，主證頭昏頭疼，咽干，腰膝酸軟，五煩心熱，口干； 次證大便干結(jié)，尿少，色黃； 舌淡紅，舌苔少，脈沉細(xì)或弦細(xì)，根據(jù)無、輕度、中度、重度分別計為0、1、2、3 分，其中主證需要雙倍積分，舌脈象異常計為1 分，總分≥7分即可辨證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合“1.2” 項下診斷標(biāo)準(zhǔn)； （2）年齡18 ～65 歲； （3）未進行腹膜透析或血液透析； （4）患者自愿參加本研究，簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）尿蛋白定量≥3.5 g／24 h；（2）合并急性炎性反應(yīng)、外科手術(shù)、惡性腫瘤、外傷及心、腦、消化、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾?。?（3）曾有輸血史，以及既往或目前從事與輻射或毒物接觸有關(guān)的作業(yè)； （4）存在造成腎功能短暫可逆性下降的因素； （5）妊娠期或哺乳期婦女； （6）近1 個月內(nèi)服用過抗氧化應(yīng)激藥物； （7）正使用糖皮質(zhì)激素和（或）免疫抑制劑； （8）近3 個月內(nèi)參加過其他臨床試驗； （9）因患有精神病等而無法配合治療。

1.5 治療手段

1.5.1 對照組 參考2009 年《臨床診療指南·腎臟病學(xué)分冊》、2015 年《慢性腎衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療指南》，（1）優(yōu)質(zhì)低蛋白、低鈉、低磷、低脂飲食； （2）合并高血壓者首選貝那普利或纈沙坦；（3）合并糖尿病者首選胰島素控制血糖； （4）合并代謝性酸中毒者補充碳酸氫鈉； （5）合并貧血者進行重組人促紅細(xì)胞生成素治療； （6）合并礦物質(zhì)及骨代謝異常者口服骨化三醇，連續(xù)治療8 周。

1.5.2 觀察組 在對照組基礎(chǔ)上采用益腎清濁湯，組方藥材生地黃15 g、山藥15 g、山茱萸15 g、牡丹皮6 g、車前子15 g、茯苓15 g、鹿銜草15 g、川牛膝15 g、桑寄生15 g、大黃6 g、黃柏6 g、六月雪15 g、知母6 g，每袋100 mL，每天早晚2 次餐后服用，連續(xù)治療8 周。

1.6 療效評價 參考《中藥新藥臨床指導(dǎo)原則》［6］，分為臨床痊愈、顯效、有效、無效，中醫(yī)證候評分分別降低≥95%、≥70%但＜95%、≥30%但＜70%、＜30%?？傆行剩剑郏ㄅR床痊愈例數(shù)＋顯效例數(shù)＋有效例數(shù)）／總例數(shù)］×100%。

1.7 指標(biāo)檢測 采用CKD-EPI 公式計算eGFR，脲酶-谷氨酸脫氫酶法檢測血清尿素氮（BUN）水平，酶法檢測血清肌酐（Scr）水平，ELISA 法檢測血清HO-1、CAT 水平，相關(guān)試劑盒均購自蘭博利德（福州）生物技術(shù)有限公司。

檢測Nrf2 水平：①主要試劑，包括人全血單個核細(xì)胞分離液（FICOLL 配制）、核蛋白提取試劑盒、BCA 法蛋白濃度測定試劑盒、人Nrf2 ELISA試劑盒，均購自蘭博利德（福州）生物技術(shù)有限公司； ②樣本采集，患者于上午7：00 至7：30 空腹抽取肘靜脈血； ③外周血單個核細(xì)胞分離、核蛋白提取，采血后立即進行核細(xì)胞分離、核蛋白提取，置于-80 ℃冰箱中保存； ④檢測Nrf2 表達，取出凍存細(xì)胞核蛋白，解凍，BCA 蛋白定量試劑盒檢測濃度，將所有樣品核蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至0.5 mg／mL，總體積為50 μL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行檢測。

治療期間，檢測2 組血常規(guī)、電解質(zhì)、肝功能、糞便常規(guī)＋OB、心電圖等指標(biāo)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料如符合正態(tài)分布以（±s）表示，不符合以M （IQR）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗或秩和檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗或秩和檢驗； 計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗，再進行Spearman 秩相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前Nrf2、HO-1、CAT 水平 治療前，疾病組Nrf2、HO-1、CAT 水平低于健康組 （P＜0.05），見表2。

表2 治療前2 組Nrf2、HO-1、CAT 水平比較 ［±s，M （IQR）］Tab.2 Comparison of Nrf2，HO-1 and CAT levels between the two groups before treatment ［±s，M （IQR）］

表2 治療前2 組Nrf2、HO-1、CAT 水平比較 ［±s，M （IQR）］Tab.2 Comparison of Nrf2，HO-1 and CAT levels between the two groups before treatment ［±s，M （IQR）］

注：與健康組比較，*P＜0.05。

指標(biāo)健康組（n ＝20）疾病組（n ＝76）Nrf2／（pg·mL-1）23.11（3.53）13.00（6.08）*HO-1／（ng·mL-1）75.04±2.5029.77±8.26*CAT／（pg·mL-1）14.21±0.743.10±1.63*

2.2 中醫(yī)證候評分 治療后，2 組中醫(yī)證候評分降低（P＜0.05），以觀察組更明顯（P＜0.05），見表3。

表3 2 組中醫(yī)證候評分比較［分，M （IQR），n＝38］Tab.3 Comparison of TCM syndrome scores between the two groups ［score，M （IQR），n＝38］

2.3 臨床療效 觀察組總有效率高于對照組（P＜0.05），見表4。

表4 2 組臨床療效比較［例（%），n＝38］Tab.4 Comparison of clinical efficacy between the two groups ［case （%），n＝38］

2.4 腎功能指標(biāo) 治療后，2 組BUN、Scr 水平降低（P＜0.05），eGFR 升高（P＜0.05），以觀察組更明顯（P＜0.05），見表5。

表5 2 組腎功能指標(biāo)比較（x±s，n＝38）Tab.5 Comparison of renal function indices between the two groups （±s，n＝38）

表5 2 組腎功能指標(biāo)比較（x±s，n＝38）Tab.5 Comparison of renal function indices between the two groups （±s，n＝38）

注：與同組治療前比較，*P＜0.05； 與對照組治療后比較，＃P＜0.05。

指標(biāo)組別治療前治療后BUN／（mmol·L-1）對照組9.86±2.928.74±2.53*觀察組9.99±2.508.38±2.16*＃Scr／（μmol·L-1）對照組 143.86±30.11 138.98±26.11*觀察組 143.73±24.00 127.34±24.16*＃eGFR／（mL·min-1· 對照組 43.50±8.1445.02±7.65*1.73 m-2）觀察組 42.48±7.2349.53±9.44*＃

2.5 Nrf2、HO-1、CAT 水平 治療后，2 組Nrf2、HO-1、CAT 水平升高（P＜0.05），以觀察組更明顯（P＜0.05），見表6。

表6 2 組 Nrf2、HO-1、CAT 水平比較 ［x ± s，M （IQR），n＝38］Tab.6 Comparison of Nrf2，HO-1 and CAT levels between the two groups ［x ± s，M （IQR），n＝38］

2.6 相關(guān)性分析 Nrf2、HO-1、CAT 水平與Scr水平呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.946、-0.194、-0.673，P＜0.05），與eGFR 呈正相關(guān) （r＝0.742、0.270、0.587，P＜0.05）。

2.7 安全性評價 2 組均未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，血糞常規(guī)、肝功能、心電圖指標(biāo)均無明顯變化。

3 討論

慢性腎臟病早期存在活性氧積聚，而且隨著腎小球濾過率的下降愈加顯著［7-8］。在氧化應(yīng)激作用下，Nrf2、Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）解離、釋放，使前者轉(zhuǎn)位進入核內(nèi)，促使下游靶基因轉(zhuǎn)錄活化，增強細(xì)胞抗氧化、清除毒物的功能。另外，HO-1 是Nrf2 下游眾多靶蛋白中臨床研究中關(guān)注度高的抗氧化蛋白之一［9］，CAT通過清除H2O2表現(xiàn)出抗氧化損傷的活性［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎臟病患者外周血單個核細(xì)胞Nrf2、血清HO-1、CAT 水平低于健康人，提示Nrf2-ARE信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與慢性腎臟病發(fā)病密切相關(guān)，這與胡波等［11］報道一致。

本研究經(jīng)Spearman 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Nrf2、HO-1、CAT 水平與Scr 水平呈負(fù)相關(guān)，與eGFR 呈正相關(guān)，提示慢性腎臟病患者隨著腎功能減退，Nrf2、HO-1、CAT 表達降低，表明Nrf2-ARE 信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與腎功能損傷程度相關(guān)。

中醫(yī)將慢性腎臟病歸類于“水腫” “血尿”“關(guān)格” 等范疇。阮詩瑋教授［12］認(rèn)為，慢性腎臟病中期患者肝腎之陰精虧損，肝腎同源，腎不主水，肝失疏泄，使水濕內(nèi)聚，濁瘀內(nèi)生。益腎清濁湯功效滋陰補益肝腎、祛濕泄?jié)?、活血化瘀，以生地黃為君藥，可滋補肝腎之陰，也可制約肝腎相火妄動； 山茱萸、山藥為臣藥，補益肝脾腎，固澀精微； 黃柏、牡丹皮、知母瀉火滋陰，茯苓健脾利濕，大黃瀉下化瘀，車前子利濕泄?jié)幔卵┗钛顫?，川牛膝、桑寄生、鹿銜草祛風(fēng)除濕活血，共為佐藥，其中川牛膝亦為使藥，諸藥合用，共奏滋補肝腎之陰、泄?jié)峄?、祛風(fēng)濕之功效。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組可有效改善中醫(yī)證候評分及腎功能，提示其臨床療效顯著，這與益腎清濁湯組方藥材有效成分有關(guān)，山茱萸提取物具有肝腎保護作用［13］，六月雪能使腎小球基底膜逐漸修復(fù)［14］，山藥多糖能減少糖尿病小鼠腎組織纖維化［15］； 外周血單個核細(xì)胞Nrf2、血清HO-1、CAT 水平升高，提示益腎清濁湯具有較強的抗氧化能力，其機制與激活Nrf2-ARE 信號通路、上調(diào)下游因子表達有關(guān)?，F(xiàn)代藥理研究也表明，益腎清濁湯中所含的中藥及其提取物有不同程度的抗氧化作用［16-21］。

綜上所述，外周血單個核細(xì)胞Nrf2、血清HO-1、CAT 水平與慢性腎臟病關(guān)系密切，可將其作為治療的靶點； 益腎清濁湯可提升肝腎陰虛型慢性腎臟病患者機體抗氧化應(yīng)激能力，而且安全性良好，其機制可能為激活Nrf2-ARE 信號通路，上調(diào)下游抗氧化因子HO-1、CAT 的水平，從而保護腎臟。