王毅強(qiáng)，越東杰，王儷娟，郭 鑫，張承宇，吳飛飛*

（1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院，山西 長(zhǎng)治 046000； 2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院，山西 長(zhǎng)治 046000）

糖尿病腎臟疾病是糖尿病并發(fā)微血管病變引起的慢性腎臟病，是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，在我國(guó)近20%的2 型糖尿病患者可能有腎病并發(fā)癥［1］，目前已經(jīng)成為慢性腎臟病、終末期腎衰竭的主要病因［2］，傳統(tǒng)西醫(yī)治療效果有限［3］，并被證實(shí)并不能阻礙糖尿病腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎臟病［4］，故積極探尋治療糖尿病腎臟疾病的新方法及其機(jī)制以延緩疾病發(fā)生及發(fā)展，對(duì)提高糖尿病患者存活率、改善其生活質(zhì)量具有重要意義。

近年來研究表明，腸道菌群失調(diào)與糖尿病腎臟疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，前者有害代謝物尿毒癥毒素和自身成分通過受損的腸道屏障進(jìn)入循環(huán)，觸發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)通路，最終導(dǎo)致腎組織炎癥、細(xì)胞凋亡、纖維化、腎功能衰退［5］。一些治療糖尿病腎臟疾病的中藥（如腎炎康復(fù)片［6］、清熱消正方［7］等）在改善糖尿病腎臟疾病癥狀、臨床指標(biāo)的同時(shí)，對(duì)腸道菌群產(chǎn)生有益的影響，其中金匱腎氣丸可降低糖尿病腎臟疾病患者血糖、血脂、尿蛋白，改善腎功能［8］，可能與抑制氧化應(yīng)激、降低慢性炎癥、保護(hù)腎臟足細(xì)胞、改善慢性纖維化等機(jī)制有關(guān)［9］，但它是否能改善糖尿病腎臟疾病患者腸道菌群，以及對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用是否與改善腸道菌群有關(guān)尚不明確。因此，本研究探討金匱腎氣丸對(duì)陰陽兩虛型糖尿病腎病患者的臨床療效，以期為效果中西醫(yī)結(jié)合治療提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2021 年3 月至2021 年11 月收治于長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院的20 例陰陽兩虛型糖尿病腎臟疾病患者，隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，每組10 例。其中，對(duì)照組男性6 例，女性4 例； 年齡44～73 歲，平均年齡（60.60±11.67）歲； 平均收縮壓（144.30±19.50）mmHg； 平均舒張壓 （87.70±10.11）mmHg； 平均空腹血糖 （11.93±4.29）mmol／L，而觀察組男性3 例，女性7 例； 年齡46 ～74 歲，平均年齡（60.40±8.58）歲； 平均收縮壓（129.30±11.12）mmHg； 平均舒張壓（78.80±13.42）mmHg； 平均空腹血糖（10.21±3.50）mmol ／L，2 組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)RT2021067）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)（糖尿病腎病）參照《糖尿病腎臟疾病診療中國(guó)指南》［10］、《中國(guó)2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》［11］，即典型糖尿病癥狀，有多飲、多尿、多食、消瘦等癥狀，空腹血糖≥7.0 mmol／L 或隨機(jī)血糖≥11.0 mmol／L 或OGTT 2 h ≥11.0 mmol／L 或糖化血紅蛋白≥6.5%，同時(shí)與尿蛋白、腎功能變化存在因果關(guān)系，并排除其他原發(fā)性、繼發(fā)型腎小球疾病及系統(tǒng)性疾病，（1）隨機(jī)尿白蛋白／肌酐比值（UACR）≥30 mg／g，在3 ～6 個(gè)月內(nèi)重復(fù)檢測(cè)仍≥30 mg／g； （2）估算腎小球?yàn)V過率（eGFR）＜60 mL／ （min·1.73 m2），持續(xù)3 個(gè)月以上； （3）腎活檢符合糖尿病腎臟疾病病理改變，符合上述情況之一即可確診。

1.2.2 中醫(yī)（陰陽兩虛型）參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》［12］，主證精神萎靡，形寒肢冷，大便泄瀉，陽痿，遺精； 次證面色蒼白無華，倦怠乏力，面目浮腫，腰酸耳鳴； 舌淡，苔白，脈沉遲或沉細(xì)無力。具備主證2 項(xiàng)或主證1 項(xiàng)、次證1 項(xiàng)，結(jié)合舌脈即可辨證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合 “1.2” 項(xiàng)下診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）Mogensen分期Ⅲ期、Ⅳ期（即臨床腎病期），其中Ⅲ期UACR 30～299 mg／g，Ⅳ期ACR＞300 mg／g； （3）年齡30～80 歲，病程6～10 年； （5）可長(zhǎng)期隨訪； （5）患者自愿參加本研究，簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）合并原發(fā)性或其他繼發(fā)性腎臟疾病，如診斷明確的腎小球腎炎、IgA 腎病、高血壓腎?。唬?）近2 周內(nèi)使用過可能影響臨床結(jié)果評(píng)價(jià)的藥物，如抗生素等； （3）近3 個(gè)月或目前口服益生元、益生菌等調(diào)節(jié)腸道菌群的藥物； （4）近6 個(gè)月內(nèi)有糖尿病急性并發(fā)癥或應(yīng)激狀態(tài)； （5）近6 個(gè)月內(nèi)有心肌梗死或卒中史，或存在嚴(yán)重心血管疾病及風(fēng)險(xiǎn)、肝功能異常、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤； （6）合并泌尿系感染、終末期腎臟病、接受過或正在接受透析治療； （7）對(duì)研究藥物有嚴(yán)重禁忌：（8）妊娠期婦女。

1.5 治療手段 對(duì)照組采用常規(guī)治療，包括（1）糖尿病腎病飲食教育； （2）適度運(yùn)動(dòng)； （3）藥物，如胰島素或降糖類藥物降糖、鈣通道阻滯劑類藥物降壓、他汀類藥物調(diào)脂。觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上采用金匱腎氣丸［中國(guó)北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，水蜜丸，25 粒（5 g）］，每天2 次。2 組療程均為1 個(gè)月。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 治療前，收集一般資料，進(jìn)行常規(guī)生化檢查，計(jì)算中醫(yī)證候評(píng)分，采集糞便（置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存）。治療后，計(jì)算中醫(yī)證候評(píng)分，檢測(cè)空腹血糖（FBG）、餐后2 h 血糖（2 hPBG）、甘油三酯（TC）、膽固醇（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、血肌酐（SCr）水平及隨機(jī)尿微量白蛋白／肌酐比值（ACR），采集糞便（置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存）。對(duì)糞便進(jìn)行微生物多樣性檢測(cè)，提取其總基因組DNA，對(duì)細(xì)菌16S rRNA 的V3V4 區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，采用QIIME、R 包（v3.2.0）、MEGAN 等軟件進(jìn)行分析，比較2 組糞便微生物組成差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，不符合者以［M（P25，P75）］表示，組間比較采用t檢驗(yàn)（正態(tài)分布）或秩和檢驗(yàn)（非正態(tài)分布）； 計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 檢驗(yàn)。通過QIIME、R 包（v3.2.0）軟件計(jì)算α、β 多樣性，比較2 組腸道菌群差異，雙變量相關(guān)性研究采用Spearman 相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床指標(biāo) 治療后，觀察組中醫(yī)證候評(píng)分、舒張壓及FBG、2 hPBG、TC、LDL 水平降低（P＜0.05），HDL 水平升高（P＜0.05），見表1，并且ACR 中位數(shù)降低 （P＜0.05），見表2。治療后，對(duì)照組中醫(yī)證候評(píng)分及FBG、2 hPBG、TC、LDL 水平降低（P＜0.05），HDL 水平升高（P＜0.05），見表3，并且ACR 中位數(shù)降低（P＜0.05），見表4。另外，治療后，2 組中醫(yī)證候評(píng)分、收縮壓、舒張壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 治療前后觀察組正態(tài)分布計(jì)量資料比較（x±s，n＝10，1 mmHg＝0.133 kPa）

表2 治療前后觀察組非正態(tài)分布計(jì)量資料比較［M （P25，P75），n＝10］

表3 治療前后對(duì)照組正態(tài)分布計(jì)量資料比較（x±s，n＝10，1 mmHg＝0.133 kPa）

表4 治療前后對(duì)照組非正態(tài)分布計(jì)量資料比較［M （P25，P75），n＝10］

2.2 腸道菌群差異 將糞便分為A 組（觀察組治療前）、B 組（觀察組治療后）、C 組（對(duì)照組治療前）、D 組（對(duì)照組治療后），分別采用ACE、Chao、Shannon、Simpson 指數(shù)估計(jì)群落的多樣性，結(jié)果見圖1。由此可知，4 組物種豐富度、多樣性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 4 組腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)

beta 多樣性采用非度量多維尺度分析（NMDS 分析）觀察微生物群落的相似性程度，通過對(duì)樣本距離進(jìn)行等級(jí)排序來使其在低維空間中的排序盡可能符合彼此之間的距離遠(yuǎn)近關(guān)系，結(jié)果見圖2。

圖2 4 組腸道菌群beta 多樣性

Anosim 檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，結(jié)果見圖3，可知R＝-0.004＜0，表明組間差異小于組內(nèi)差異；P＝0.52＞0.05，表明差異無顯著性。另外，4 組之間的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)不存在顯著性差異，表明治療前后腸道菌群異質(zhì)性差異較小。

圖3 4 組腸道菌群Anosim 檢驗(yàn)

LEfSe 分析基于線性判別分析（LDA），可用于找出重要的、組間具有顯著差異的物種，本實(shí)驗(yàn)采用該方法找出4組中的顯著菌屬，LDA score 為2，P＜0.05 （Krukal Wallis Anova test、Wilcoxon test），結(jié)果見圖4，可知B 組f_ _Prevotellaceae.g_ _ Prevotella_ 7 菌增加，表明治療后腸道菌群中普雷沃氏菌（Prevotella_ 7）相對(duì)豐度升高。

圖4 LDA 值分布柱狀圖

通過16s 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，對(duì)不同樣品、分組之間在功能上的差異進(jìn)行分析，采用PICRUSt 軟件，基于已測(cè)細(xì)菌16S rDNA 信息并比對(duì)Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)后近緣物種的OTU 信息，推斷其共同祖先的基因功能譜，同時(shí)對(duì)Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)中其他未測(cè)物種的基因功能譜進(jìn)行推斷，構(gòu)建古生菌和細(xì)菌域全譜系的基因功能預(yù)測(cè)譜，最后將測(cè)序得到的菌群組成“映射” 到數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)菌群代謝功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見圖5，可知B 組碳水化合物代謝水平升高，P＝0.038＜0.05，即治療后腸道菌群對(duì)碳水化合物代謝功能增強(qiáng)。

圖5 A、B 組腸道菌群功能差異預(yù)測(cè)

2.3 相關(guān)性分析 結(jié)果見圖6，可知BMI 及TC、LDL 水平與Lac_ Tyzzerella_ 3 菌群相對(duì)豐度呈正相關(guān)，中醫(yī)證候評(píng)分、病程、2 hPBG 水平與Chr_ Christensenellaceae_ R-7_group 菌群相對(duì)豐度呈正相關(guān)，TC、LDL 水平與Chr_Christensenellaceae_ R-7_ group 菌群相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)。

圖6 腸道菌群與臨床特征、指標(biāo)的聚類熱圖

3 討論

金匱腎氣丸功效滋陰、溫補(bǔ)腎陽、化氣行水、補(bǔ)腎泄邪，方中地黃、山藥、山茱萸滋陰，補(bǔ)脾腎，固精，肉桂引火歸元，附子助火化升腎氣，澤瀉、茯苓、牡丹皮利水，泄邪，全方陰中求陽，得陽助陰，補(bǔ)中有瀉，瀉中寓補(bǔ)，泄而不峻，補(bǔ)而不膩，使陰平陽秘，可治腎虛引起的水腫、消渴、小便不利、腰膝酸軟、形寒肢冷、精神萎靡、倦怠乏力［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療1 個(gè)月后觀察組中醫(yī)證候改善、血壓降低程度優(yōu)于對(duì)照組，與文獻(xiàn)［14］報(bào)道金匱腎氣丸可改善DKD 患者臨床癥狀、降低血壓一致； 治療后，2 組FBG、2 hPBG、TC、LDL、ACR 降低，HDL 升高，但組間無明顯差異，可能是因?yàn)椋?）西醫(yī)基礎(chǔ)治療掩蓋了金匱腎氣丸改善糖脂代謝作用； （2）本實(shí)驗(yàn)選擇組分固定的中藥制劑，并不能根據(jù)患者個(gè)體化情況靈活調(diào)整，未體現(xiàn)中醫(yī)辨證論治的優(yōu)勢(shì)； （3）僅測(cè)量空腹血糖、餐后2 h 血糖不能反映血糖控制情況，需進(jìn)行動(dòng)態(tài)血糖檢測(cè)； （4）本研究樣本量小，存在偏倚概率大，但仍以看出金匱腎氣丸在改善中醫(yī)癥狀、降低血壓方面的優(yōu)勢(shì)。另外，治療前后2組腸道菌群的α、β 多樣性無明顯差異，表明其豐度、多樣性、異質(zhì)性具有極大相似性，可能是因?yàn)椋?）在當(dāng)前條件下2 組治療方案對(duì)患者腸道菌群影響??； （2）治療時(shí)間不足； （3）樣本量小，存在偏倚概率大，并且觀察組腸道Prevotella_ 7 豐度升高。

普氏菌屬是厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌，為人類共棲細(xì)菌，它對(duì)健康有益與否尚存在爭(zhēng)議［15］，經(jīng)短期膳食纖維治療后，部分健康人血糖、胰島素水平降低，其腸道內(nèi)普氏菌屬出現(xiàn)富集［16］。菜豆可增加小鼠腸道中普氏菌屬豐度，促進(jìn)碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs［17］，后者可作為腸上皮細(xì)胞的能源，同時(shí)具有增強(qiáng)腸上皮屏障、調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)、抑制炎癥和氧化應(yīng)激作用［18］，從而抑制糖尿病腎臟疾病發(fā)生發(fā)展。根據(jù)KEEG 功能預(yù)測(cè)，金匱腎氣丸干預(yù)后腸道菌群碳水化合物代謝功能增強(qiáng)，但本研究并未檢測(cè)治療前后腸道SCFAs 變化，無法判斷普氏菌屬是否升高其水平而對(duì)患者產(chǎn)生益處。

Prevotellacopri富集與胰島素抵抗有關(guān)［19］，普氏菌屬在我國(guó)高血壓前期、原發(fā)性高血壓患者腸道中富集，可能與觸發(fā)炎癥有關(guān)［20］，其中Prevotella_ 7 與增加終身心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，Tyzzerella、Christensenellaceae_ R-7 在心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)人群中富集［21］。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，BMI、TC、LDL 與Tyzzerella_ 3 菌群的相對(duì)豐度呈正相關(guān)，說明Tyzzerella_ 3 的富集與肥胖、血脂異常相關(guān)，與Tyzzerella在心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)人群中富集有相關(guān)性。TC、LDL 與Christensenellaceae_ R-7 菌群相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)，與Christensenellaceae_ R-7 在心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)人群中富集不一致，Christensenellaceae 屬于厚壁菌門，目前被認(rèn)為是健康腸道特征的5 個(gè)類群之一，與BMI、內(nèi)臟脂肪量、腰圍、腰臀比、TC、LDL、TG、糖代謝受損、血壓呈負(fù)相關(guān)，有望作為一種改善人類健康的治療性益生菌［22］，故本研究認(rèn)為TC、LDL 與Christensenellaceae_ R-7 存在負(fù)相關(guān)性是合理的，而中醫(yī)證候評(píng)分、病程、餐后2 h 血糖與后者存在正相關(guān)有待商榷。

綜上所述，金匱腎氣丸可改善陰陽兩虛型糖尿病腎臟疾病患者臨床癥狀、血壓，增加腸道菌群Prevotella_ 7 豐度，提高腸道菌群對(duì)碳水化合物的代謝能力。但由于時(shí)間、人力的限制，本研究樣本量較小，可能導(dǎo)致偏倚而產(chǎn)生陰性結(jié)果，另外由于未考察治療前后患者腸道菌群代謝產(chǎn)物、炎癥因子變化，無法從其他機(jī)制方面確定金匱腎氣丸對(duì)糖尿病腎臟疾病的作用，今后將擴(kuò)大樣本量，并對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。