蔡佳男 劉斌 張風(fēng)華 陳玉婷 向雨晴 常海艷 方芳

摘 要：流感病毒滅活疫苗通常需要添加佐劑來增強(qiáng)其免疫保護(hù)效果。鋁佐劑是常用的人用疫苗佐劑，主要誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答。在本研究中，我們將氫氧化鋁（Al）佐劑與TLR7/8激動(dòng)劑R848組成復(fù)合佐劑，與流感病毒H7N9滅活疫苗共同免疫小鼠；單次免疫3周后，用致死劑量（20 LD50）的同源病毒攻擊小鼠。結(jié)果顯示，與含單一R848或Al佐劑的疫苗相比較，添加了R848 + Al復(fù)合佐劑的疫苗更能提升小鼠的血清特異性IgG抗體和IgG2a抗體亞類的滴度，誘導(dǎo)Th1和Th2型細(xì)胞因子分泌及Th1偏向的免疫應(yīng)答，能為小鼠抗致死量病毒攻擊提供更有效的免疫保護(hù)。因此，R848+Al復(fù)合佐劑系統(tǒng)強(qiáng)于單一的R848或Al 佐劑。本研究對(duì)于改良Al佐劑及提高流感滅活疫苗免疫效果具有參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：R848；氫氧化鋁；滅活疫苗；流感病毒

中圖分類號(hào)：R186? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.02.009

R848 Addition to Aluminium Hydroxide Enhances Immune Protection in Mice Immunized with Inactivated Influenza H7N9 Vaccine

CAI Jianan， LIU Bin， ZHANG Fenghua， CHEN Yuting， XIANG Yuqing， CHANG Haiyan*， FANG Fang*

（College of Life Sciences， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract： Inactivated influenza virus vaccines usually require adjuvants to enhance their immune protection. Aluminium hydroxide （Al ） adjuvant is commonly used as an adjuvant in human vaccines， mainly inducing Th2 immune response. In this study， Al adjuvant and TLR7/8 agonist R848 were combined to form a complex adjuvant， and its adjuvancity was evaluated in immunization of mice with inactivated influenza virus H7N9 vaccine. Three weeks after a single immunization， mice were attacked with a lethal dose （20 LD50） of homologous virus. The results showed that， compared with vaccine adjuvanted with R848 or Al alone， R848+ Al adjuvanted vaccine enhanced mice higher titers of serum IgG and IgG2a subtype antibodies and induced both Th1 and Th2 cytokines， with a Th1-biased response， and provided potent protection in mice against lethal virus infection. Therefore， the adjuvancity of R848+ Al is superior to that of R848 or Al alone. The study may help to improve Al adjuvancity and immune effects of inactivated influenza vaccines.

Key words： R848; aluminium hydroxide; inactivated vaccine; influenza virus

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（2）： 170-176）

流感病毒（influenza virus）能引起人的急性呼吸道感染，每年可導(dǎo)致全球出現(xiàn)數(shù)百萬重癥病例和數(shù)十萬人死亡［1］。由于流感病毒的易變異性，人類不僅要應(yīng)對(duì)每年的季節(jié)性流感，還要應(yīng)對(duì)不規(guī)律暴發(fā)的流感大流行（如上世紀(jì)4次流感大流行和2009年的流感大流行）以及各種亞型禽流感病毒在人群中的局部流行或零星出現(xiàn)［2］。因此，流感病毒是一類給人類健康和全球經(jīng)濟(jì)帶來持續(xù)性威脅的病毒。接種流感疫苗是防止流感病毒感染和傳播最經(jīng)濟(jì)有效的方法。目前，全球普遍采用滅活疫苗來預(yù)防流感，只有極少數(shù)國家同時(shí)使用滅活疫苗和減毒活疫苗［3］。與減毒活疫苗相比，流感滅活疫苗的安全性更好，適合老人及嬰幼兒等更廣泛的人群接種，但滅活疫苗在體內(nèi)不具有增殖性，通常需要增加疫苗抗原量及添加佐劑來加強(qiáng)其免疫原性和免疫保護(hù)效果［3］。

目前獲得批準(zhǔn)的人用疫苗佐劑主要有近百年歷史的氫氧化鋁（Al）佐劑以及近二三十年美國食品及藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的MF59乳劑和歐盟批準(zhǔn)的AS（adjuvant system）系列佐劑［4］。Al佐劑目前仍然是應(yīng)用最廣泛的佐劑，也是我國唯一批準(zhǔn)使用的人用佐劑。然而，它是一種Th2型佐劑，含Al佐劑的疫苗主要誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，細(xì)胞免疫應(yīng)答很弱；同時(shí)，Al佐劑也可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一些不良反應(yīng)［4］。因此，單一的Al佐劑難以滿足疫苗的發(fā)展需求。改良現(xiàn)有佐劑和研發(fā)新型佐劑一直是疫苗研究領(lǐng)域的重要課題。

咪唑喹啉化合物R848（resiquimod）是一種鳥苷衍生物，是Toll樣受體TLR7/8的激動(dòng)劑［5］。它最初是作為I型干擾素的誘導(dǎo)物開發(fā)出來的，因其具有抗腫瘤和抗病毒活性在臨床得到運(yùn)用。隨后的體外和體內(nèi)研究都發(fā)現(xiàn)，R848可以促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ、IFN-α和IL-12等的分泌，能增強(qiáng)針對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體產(chǎn)生，是一種潛在的Th1型候選佐劑［5］。本文嘗試將R848與Al佐劑組成復(fù)合佐劑，與H7N9流感病毒滅活疫苗共同免疫小鼠，通過檢測相關(guān)的免疫應(yīng)答指標(biāo)和致死量同源病毒攻擊后的保護(hù)性指標(biāo)來評(píng)價(jià)該復(fù)合佐劑對(duì)疫苗的免疫增強(qiáng)效果。

1 材料與方法

1.1 病毒、疫苗、佐劑和試驗(yàn)動(dòng)物

病毒株NIBRG-267（H7N9）是含有流感病毒A/Shanghai/2/2013（H7N9）的血凝素（hemagglutinin，HA）、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）基因節(jié)段和A/PR/8/34（H1N1）的6個(gè)內(nèi)部基因節(jié)段的重組病毒株，由上海生物制品研究所提供。將該病毒在小鼠體內(nèi)反復(fù)傳代后獲得的鼠適應(yīng)型病毒株，用于小鼠的攻毒試驗(yàn)。

用NIBRG-267（H7N9）疫苗株制備的全病毒滅活疫苗由上海生物制品研究所提供。Al佐劑為Al（OH）3，由上海生物制品研究所提供。R848為Sigma產(chǎn)品，用微量乙醇助溶后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）定容到所需濃度，分裝后于-80℃保存。

6～8周齡無特定病原（specific pathogen free，SPF）級(jí)BALB/c雌性小鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。動(dòng)物飼養(yǎng)及試驗(yàn)在湖南師范大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房完成。

1.2 動(dòng)物免疫、攻毒和樣品采集

采用腹腔注射的方式對(duì)小鼠做單次免疫。將6～8周齡BALB/c小鼠分為5組，分別為未免疫組（僅注射PBS緩沖液）、單獨(dú)疫苗組（無佐劑）、疫苗+R848組、疫苗+100 μg Al組和疫苗+R848+50 μg Al組。其中疫苗抗原劑量為每劑0.033 μg（以HA含量計(jì)），R848為每劑20 μg。

一次免疫3周后，通過滴鼻的方式用致死劑量（20 LD50）鼠適應(yīng)型NIBRG-267（H7N9）病毒攻擊小鼠，觀察攻毒后小鼠的體征、體重變化和存活率。

在攻毒前1 d從小鼠尾靜脈取血，用于抗體檢測。攻毒3 d后，每組取3只小鼠用氯仿麻醉，取小鼠肺臟于1.5 mL病毒稀釋液中勻漿，8 000 r/min離心20 min，取上清，分裝后于-80℃保存，用于肺部病毒滴度測定。

1.3 抗體檢測

用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定疫苗特異性IgG抗體及其亞類IgG1和IgG2a的抗體效價(jià)。首先，用10 ?g/mL NIBRG-267（H7N9）滅活疫苗包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜，加入封閉液［含1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBS］37℃溫育2 h；然后，將待測血清作2倍系列稀釋后加入酶標(biāo)板中，37℃溫育2 h；加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1或IgG2a二抗（Southern Biotechnology Associates，Inc.， USA），37℃溫育1 h；加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈菌蛋白（Southern Biotechnology Associates，Inc.， USA），37℃溫育1 h；最后，加入含有底物pNPP（Southern Biotechnology Associates，Inc.， USA）的顯色液，37℃培養(yǎng)箱溫育30 min。用酶標(biāo)儀（GENios，TECAN）測定波長為405/450 nm的光密度（optical density，OD）值，與對(duì)照組的平均值＋2×標(biāo)準(zhǔn)差（x＋2s）比較，確定抗體IgG、IgG1和IgG2a的最高稀釋度。

采用血凝抑制法（haemagglutination-inhibition assay，HI assay）測定HI抗體效價(jià)。用受體破壞酶（北京莊笛浩禾生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）處理血清，并在56℃滅活45 min，然后與雞紅細(xì)胞一起孵育以吸附非特異性凝集素。每組小鼠血清用PBS進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋，置于96孔聚苯乙烯微量滴定板中，每孔25 μL。每孔加入25 μL含有4個(gè)血凝單位（hemagglutination unit，HAU）的病毒懸液。室溫孵育1 h后，每孔加入50 μL 體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞，室溫孵育30 min。HI滴度定義為完全抑制血凝的最高血清稀釋度的倒數(shù)。

1.4 細(xì)胞因子檢測

采用ELISA方法檢測免疫后小鼠淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的分泌量。單次免疫3周后，取小鼠脾臟，分離淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)后于24孔板中37℃培養(yǎng)；4 h后加入5 μg/mL H7N9滅活疫苗（按HA含量計(jì)）進(jìn)行刺激，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)液于1 500 r/min離心5 min，收集上清液。按照細(xì)胞因子ELISA試劑盒（達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司）說明書的方法操作，讀取450 nm處的OD值后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定細(xì)胞因子的含量。每組小鼠的細(xì)胞因子的含量用樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

1.5 肺部病毒滴度檢測

采用噬斑分析法測定小鼠肺部的殘余病毒滴度。將肺勻漿液作10倍梯度稀釋，接種于長滿MDCK細(xì)胞的96孔板中，37℃培養(yǎng)；48 h后觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。每個(gè)樣本的病毒滴度用Reed-Muench方法計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）。每組小鼠的病毒滴度值用每毫升樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Fishers exact test分析小鼠存活率。使用GraphPad Prism中的t-test分析小鼠的體重丟失率、肺部殘余病毒量、血清抗體滴度和細(xì)胞因子分泌量。體重變化、肺部殘余病毒滴度和抗體滴度數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。P<0.05為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具顯著性差異，P<0.005為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠獲得的免疫保護(hù)效果

為評(píng)價(jià)R848+Al復(fù)合佐劑對(duì)流感滅活疫苗免疫保護(hù)效果的影響，我們將各組小鼠經(jīng)腹腔注射途徑免疫1次，在免疫3周后用致死劑量（20 LD50）的H7N9同源病毒進(jìn)行攻擊。在攻毒后21 d內(nèi)觀察并記錄小鼠的狀態(tài)、體重變化及存活情況。

試驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1所示。未免疫組（即陰性對(duì)照組）小鼠在病毒攻擊后第3天開始表現(xiàn)出一些嚴(yán)重的癥狀，如背部弓起、聳毛、行動(dòng)緩慢、食欲下降；在攻毒7 d內(nèi)全部死亡，且體重丟失非常嚴(yán)重（最大體重丟失率達(dá)到33.21%）。與未免疫組相比，單獨(dú)疫苗組和3個(gè)佐劑疫苗組小鼠的體征改善，存活率顯著性提高（P<0.05）。單獨(dú)疫苗組小鼠在第6天后開始出現(xiàn)小鼠死亡的情況，體重丟失嚴(yán)重（最大體重丟失率為28.42%）。與單獨(dú)疫苗組相比，3個(gè)疫苗+佐劑組小鼠的存活率均有顯著性提高（P<0.05）。疫苗+R848佐劑組小鼠的存活率雖然有顯著提高，但體重丟失嚴(yán)重（最大體重丟失率為26.26%），恢復(fù)困難；疫苗+Al佐劑組小鼠的存活率為100%，但體重丟失率也比較大（最大體重丟失率為13.06%）。當(dāng)R848與50 μg Al佐劑聯(lián)合使用作為復(fù)合佐劑時(shí)，小鼠的存活率達(dá)到100%，最大體重丟失率只有6.01%。因此，保護(hù)性試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)表明：R848單獨(dú)作佐劑提供的保護(hù)效果不如單獨(dú)Al佐劑；而R848+Al復(fù)合佐劑要強(qiáng)于R848或Al單獨(dú)佐劑，經(jīng)免疫的小鼠在致死量同源病毒攻擊后，不僅存活率達(dá)到100%，而且在感染后能迅速恢復(fù)，體重丟失很少，幾乎不出現(xiàn)感染體征，肺部殘余病毒滴度也很低。

2.2 小鼠血清抗體滴度

為檢測復(fù)合佐劑誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，小鼠免疫3周后，從每組隨機(jī)取3只小鼠實(shí)施斷尾取血，用ELISA和HI方法分別檢測血清中的疫苗特異性IgG抗體和HI抗體。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。ELISA結(jié)果顯示，與未免疫的陰性對(duì)照組相比，所有免疫組小鼠體內(nèi)均誘導(dǎo)產(chǎn)生了疫苗特異性的IgG抗體。與無佐劑疫苗組相比，疫苗中添加了佐劑的免疫組小鼠IgG抗體滴度均有顯著提升（P<0.05）：R848佐劑組的IgG抗體滴度有近13倍增加，Al佐劑組的IgG抗體滴度提高了39倍，R848+Al復(fù)合佐劑組小鼠抗體滴度提高了200倍。HI檢測結(jié)果顯示，疫苗中添加了佐劑的免疫組小鼠的HI抗體滴度都有提升，其中Al佐劑組和R848+Al復(fù)合佐劑組與無佐劑疫苗組相比均提高了6倍以上，具有顯著性差異（P<0.05）。

同時(shí)，我們用ELISA檢測了IgG抗體亞類IgG1和IgG2a抗體滴度（表2），結(jié)果顯示，與無佐劑疫苗組相比，小鼠接種了添加佐劑的疫苗后，IgG1和IgG2a抗體都得到了提升，但從IgG2a/IgG1比值可以發(fā)現(xiàn)，添加不同的佐劑導(dǎo)致產(chǎn)生了不同的IgG亞類譜。無佐劑疫苗主要誘導(dǎo)IgG2a抗體反應(yīng)（IgG2a/IgG1比值約為25），表明Th1反應(yīng)占主導(dǎo)地位。R848作佐劑的疫苗誘導(dǎo)的IgG2a和IgG1滴度差別很大（IgG2a/IgG1比值為64），說明R848使疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答發(fā)生了極端Th1偏向；Al佐劑疫苗同時(shí)刺激IgG1和IgG2a抗體（IgG2a/IgG1比值約為3），提示發(fā)生了Th2應(yīng)答偏向；R848+Al復(fù)合佐劑疫苗更多提升了IgG2a抗體滴度（IgG2a/IgG1比值為32），說明復(fù)合佐劑使疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答發(fā)生了Th1偏向。

3.3 小鼠脾臟細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌量

為了檢測復(fù)合佐劑疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效應(yīng)，我們?cè)谛∈髥未蚊庖?周后，每組取3只小鼠，分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后用H7N9滅活疫苗刺激，收集培養(yǎng)液，用ELISA試劑盒分別檢測其中含有的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5四種細(xì)胞因子的分泌量。結(jié)果如圖2所示，單獨(dú)疫苗組小鼠的四種細(xì)胞因子分泌量都很低。與單獨(dú)疫苗組相比，R848疫苗組的IFN-γ和IL-2分泌量明顯提高，但I(xiàn)L-4和IL-5的分泌量變化不大，說明R848作為佐劑極大地促進(jìn)了Th1型細(xì)胞因子的分泌，能增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫；Al佐劑疫苗組正好與R848疫苗組相反，IFN-γ和IL-2分泌量變化不大，但I(xiàn)L-4和IL-5的分泌量明顯提高，說明Al佐劑極大地促進(jìn)了Th2型細(xì)胞因子的分泌，但不能增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答；而R848+Al復(fù)合佐劑組小鼠四種細(xì)胞因子分泌量均得到提高，且都明顯高于單獨(dú)疫苗組，說明R848+Al復(fù)合佐劑同時(shí)促進(jìn)了Th1型和Th2型細(xì)胞因子的分泌，不僅有助于體液免疫，也增強(qiáng)了細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫。

3 討論

自2013年首例新型H7N9感染病例報(bào)告以來，我國經(jīng)歷了5波H7N9流行高峰，在第5波中出現(xiàn)了高致病性H7N9毒株。同時(shí)，由于突變位點(diǎn)的積累，H7N9病毒對(duì)人呼吸道上皮α-2，6唾液酸受體的親和力增強(qiáng)［6］。因此，H7N9亞型病毒仍有可能導(dǎo)致大流行。全球多家疫苗研究機(jī)構(gòu)都開展了H7N9流感疫苗的研發(fā)［7］。臨床研究證明，添加佐劑（MF59或AS03等）能有效增強(qiáng)H7N9滅活疫苗的免疫原性，節(jié)省疫苗抗原［7］。在本研究中，我們利用小鼠模型探討了Al與R848 組成的復(fù)合佐劑對(duì)流感H7N9全病毒滅活疫苗的免疫增強(qiáng)效果。根據(jù)我們的前期試驗(yàn)確定疫苗抗原的劑量。Al和R848均采用針對(duì)小鼠的常規(guī)劑量，R848+Al復(fù)合佐劑中Al（OH）3的劑量由常規(guī)的100 μg減半至50 μg。對(duì)小鼠實(shí)施單次免疫，然后用致死劑量（20 LD50）的同源病毒進(jìn)行攻擊，用攻毒后小鼠的表現(xiàn)（主要包括小鼠的存活率、體重變化、體征和肺部殘余病毒滴度等）來評(píng)判疫苗的免疫效果。從我們的試驗(yàn)結(jié)果可以看出（表1、圖1），小鼠獲得的免疫保護(hù)效果可以排序?yàn)椋?0 μg Al+R848疫苗組＞100 μg Al 疫苗組＞R848疫苗組＞單獨(dú)疫苗組。50 μg Al+R848作為疫苗佐劑時(shí)，小鼠不僅在致死劑量攻毒后能夠100%存活下來，且肺部殘余病毒滴度最低，體重丟失最少，幾乎不顯示流感體征。由此可見，Al與R848組成的復(fù)合佐劑優(yōu)于Al或R848單獨(dú)佐劑。

Al佐劑是疫苗中使用最廣泛的佐劑，其膠體顆粒能吸附各種疫苗抗原，也能與樹突狀細(xì)胞表面結(jié)合，有利于抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）吸收抗原。Al佐劑-抗原被APC吞噬，可促使APC釋放促炎性細(xì)胞因子和APC的特化，誘導(dǎo)naive CD4+T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞［8］。然而，Al佐劑誘導(dǎo)Th1應(yīng)答的能力弱，不利于胞內(nèi)感染病原體的清除。R848是一種PRR（pathogen recognition receptor）激動(dòng)劑，通過活化固有免疫細(xì)胞內(nèi)的TLR7/8激活MyD88依賴的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致免疫細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子，從而刺激Th1偏向的免疫應(yīng)答。目前，R848的佐劑效應(yīng)在流感病毒［9］、艾滋病病毒［10］、諾瓦克病毒［11］和乙肝病毒［12］等病毒的疫苗研究中都有報(bào)導(dǎo)，研究結(jié)果可謂喜憂參半。R848是一種合成的小分子化合物，在應(yīng)用時(shí)容易從局部擴(kuò)散，與抗原分離，不僅降低免疫效果，還會(huì)引起全身性副反應(yīng)［13-14］。所以，很多研究者選擇將這種小分子與抗原直接或間接偶聯(lián)，或與納米凝膠等合成聚合物偶聯(lián)［9-11，15-16］。這樣做雖然發(fā)揮了R848的佐劑效力，但無疑增加了疫苗研制的復(fù)雜性。本研究將R848與疫苗直接混合后免疫小鼠，R848的佐劑效力不明顯，小鼠在攻毒后雖然存活，但狀態(tài)很差，體重丟失嚴(yán)重；而R848與Al佐劑在低溫下充分混合后得到的復(fù)合佐劑顯示出兩者具有良好的協(xié)同互補(bǔ)效應(yīng)，對(duì)小鼠提供的免疫保護(hù)效果好于R848或Al單獨(dú)佐劑。因此，我們推測，R848可能與Al佐劑發(fā)生某種相互作用被吸附在Al佐劑膠體顆粒上。

通過免疫學(xué)指標(biāo)檢測我們發(fā)現(xiàn)，R848+Al復(fù)合佐劑之所以優(yōu)于Al或R848單獨(dú)佐劑，至少有兩個(gè)方面的原因。其一，R848+Al復(fù)合佐劑同時(shí)增強(qiáng)了Th1和Th2型免疫應(yīng)答，且使疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答發(fā)生了適中的免疫偏向。通過檢測小鼠脾臟細(xì)胞在疫苗抗原刺激后的Th1型和Th2型細(xì)胞因子的分泌情況發(fā)現(xiàn)（圖2），與單一的R848或Al佐劑相比，復(fù)合佐劑同時(shí)誘導(dǎo)了Th1型和Th2型細(xì)胞因子應(yīng)答，且復(fù)合佐劑誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的分泌量與單獨(dú)疫苗組相比都呈現(xiàn)出極顯著差異（P<0.005）。同時(shí)，IgG抗體亞類（IgG1和IgG2a）的檢測結(jié)果顯示，不同的佐劑產(chǎn)生的IgG亞類譜差別很大（表2）。單獨(dú)疫苗組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答以Th1反應(yīng)占主導(dǎo)（IgG2a/IgG1比值約為25）。這與Hovden等［15］的結(jié)論是一致的，全病毒滅活疫苗誘導(dǎo)以Th1反應(yīng)占主導(dǎo)的免疫應(yīng)答。R848單一佐劑使得Th反應(yīng)極端偏向于Th1型（IgG2a/IgG1比值從25升為64），這也可能是R848佐劑導(dǎo)致副作用的原因之一；Al單一佐劑使免疫應(yīng)答極大地向Th2型偏移（IgG2a/IgG比值從25降為3）；而R848+Al復(fù)合佐劑使疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答發(fā)生了進(jìn)一步的Th1偏移（IgG2a/IgG1比值從25升為32）。 Bungener等［16］的研究認(rèn)為，Al佐劑全病毒流感疫苗如果能減少Th2極化，偏向Th1應(yīng)答，則更有利于清除病毒。在Al佐劑中添加R848正好起到了這樣的作用。其二，R848+Al復(fù)合佐劑極大地提升了疫苗誘導(dǎo)的血清特異性IgG抗體水平，特別是IgG2a的水平（表2）。與單獨(dú)疫苗組相比，R848佐劑組和Al佐劑組的抗體水平分別提高13倍和39倍，而復(fù)合佐劑組抗體水平提高達(dá)200倍。早有研究者證實(shí)，在流感的防御機(jī)制中，強(qiáng)大的體液免疫應(yīng)答對(duì)于保護(hù)效果是至關(guān)重要的，血清特異性IgG抗體是機(jī)體抵抗流感病毒感染，特別是致死性流感肺炎的重要免疫成份［17］。Hovden等［15］研究發(fā)現(xiàn)，感染流感病毒后，血清中含量最多的一類IgG亞類抗體是IgG2a。IgG2a抗體亞類在補(bǔ)體激活和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）中起主要作用。在本研究中，與其他組相比，50 μg Al +R848誘導(dǎo)了最高水平的IgG2a抗體滴度，而HI抗體水平與100 μg Al佐劑組相當(dāng)（表2）。我們推測，在復(fù)合佐劑所提供的免疫保護(hù)中，高滴度的IgG2a抗體所介導(dǎo)的免疫調(diào)理功能應(yīng)該發(fā)揮了不可忽視的作用。

目前，非單一成份佐劑的研究越來越受到重視。由于Al佐劑是使用歷史最長且使用范圍最廣的老牌佐劑，對(duì)Al佐劑進(jìn)行改良是一個(gè)便捷的提升佐劑效果的途徑。在AS系列佐劑中，AS04就屬于含Al佐劑系統(tǒng)，它是由Al佐劑和MPL（3-O-desacyl-4'-monophosphoryl lipid A，TLR4激動(dòng)劑）組成的，目前已批準(zhǔn)用于人類疫苗［18］；另外，在SARS-CoV-2 S-2P 蛋白疫苗臨床二期試驗(yàn)中，Al佐劑和CpG（TLR9激動(dòng)劑）組成的佐劑系統(tǒng)顯示出良好的安全性和免疫原性［19］。我們的初步研究表明，由Al 佐劑和R848（TLR7/8激動(dòng)劑）組成的復(fù)合佐劑減少了一半的Al佐劑用量，與單一Al佐劑相比，能提供更加強(qiáng)大有效的抗流感免疫保護(hù)。此外，我們還在分別以新冠病毒的S蛋白和巨細(xì)胞病毒的gO蛋白作為疫苗抗原的研究中也得出了同樣的結(jié)論（數(shù)據(jù)未列出）。因此，我們認(rèn)為，添加R848的含Al佐劑系統(tǒng)值得更加細(xì)致的研究。

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收稿日期：2022-12-13；修回日期：2023-01-18。

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳項(xiàng)目（19C1160，21C0004）。

作者簡介：蔡佳男，碩士研究生。

* 通信作者：常海艷，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事分子病毒學(xué)的研究，E-mail： changhaiyan@hunnu.edu.cn；

方芳，副教授，主要從事分子病毒學(xué)的研究，E-mail： 727244887@qq.com。