杜杰 蔡海林 黃彬彬 黃軍 張翠央 龍青山 張亮 陳海榮 唐冰璇 陳武 劉清術(shù)

摘 要：短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）X23可產(chǎn)生非核糖體肽類(lèi)抗生素伊短菌素，已被廣泛用于植物病害的生物防治。伊短菌素合成基因簇中，edeB基因參與調(diào)控伊短菌素的合成積累。本研究利用基因同源重組技術(shù)，以edeB基因作為外源基因的重組片段，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-edeB，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)edeB基因在短短芽孢桿菌不同培養(yǎng)時(shí)間（12、18、24、30和36 h）的轉(zhuǎn)錄時(shí)相。結(jié)果表明：edeB基因全長(zhǎng)為771 bp，編碼256個(gè)氨基酸。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示，在分子質(zhì)量為30 kD處有一條特異條帶，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的EdeB蛋白的大小一致，且EdeB蛋白主要以包涵體的形式存在。轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析結(jié)果表明，edeB基因在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，表達(dá)模式為先升高后降低，且在30 h時(shí)表達(dá)水平最高。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究edeB基因調(diào)控伊短菌素合成積累的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為短短芽孢桿菌高產(chǎn)伊短菌素菌株的構(gòu)建提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：短短芽孢桿菌；edeB基因；原核表達(dá)；轉(zhuǎn)錄時(shí)相；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.96? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.02.006

Cloning， Prokaryotic Expression and Transcription Profile Analysis of edeB Gene in Brevibacillus brevis X23

DU Jie 1， CAI Hailin2， HUANG Binbin1， HUANG Jun1， ZHANG Cuiyang1， LONG Qingshan 1，

ZHANG Liang3， CHEN Hairong1， TANG Bingxuan1， CHEN Wu 3*， LIU Qingshu 1*

（1. Hunan Provincial Engineering and Technology Research Center for Agricultural Microbiology Application， Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， China; 2. Changsha Tobacco Company of Hunan Province， Changsha 410011， China;

3. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract： Brevibacillus brevis X23 can produce non-ribosomal antibiotic edeines， which have been widely used in biological control of plant diseases. The edeB gene in the edeine biosynthetic gene cluster regulates the synthesis of edeines. In this study， the prokaryotic expression vector pET28a-edeB was constructed by homologous recombination technology with edeB gene as the recombinant fragment of exogenous gene， and was transformed into Escherichia coli BL21（DE） for induced expression. The transcription profile of edeB gene in different culture times （12， 18， 24， 30 and 36 h） of B. brevis was detected by transcriptome sequencing. The results showed that the edeB gene was 771 bp in length， encoding 256 amino acids. SDS-PAGE electrophoresis showed that a specific band with a molecular weight of 30 kD appeared， which is in consistent with the bioinformatics prediction results. EdeB protein mainly existed in the form of inclusion bodies. The results of transcription profile showed that edeB gene was expressed at all culture times， and the gene expression showed a pattern of increasing at first and then decreasing with a peak at 30 h. These results laid a foundation for further study on the molecular mechanism of edeB gene regulating the synthesis of edeines， and provided a theoretical basis for the construction of high-yield edeine strains of B. brevis.

Key words： Brevibacillus brevis; edeB gene; prokaryotic expression; transcription profile; transcriptome

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（2）： 146-152）

短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）是一類(lèi)革蘭陽(yáng)性菌，呈桿狀，產(chǎn)芽孢，不產(chǎn)生毒素，對(duì)環(huán)境安全［1］。短短芽孢桿菌在植物病害生物防治、污染物降解和重金屬修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用均有報(bào)道。由于能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，其已成為用于植物病害生物防治方面的重要菌株［2-5］。

短短芽孢桿菌X23為本課題組從茄科作物根際土壤中分離篩選到的生防菌株。該菌對(duì)由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的茄科作物青枯病防治效果突出，已作為茄科作物青枯病生防菌得到大面積的推廣應(yīng)用［6-9］。短短芽孢桿菌X23能產(chǎn)生具有廣譜抗菌活性的非核糖體肽類(lèi)抗生素伊短菌素（edeines）。伊短菌素活性突出，抑菌譜廣，可很好地抑制細(xì)菌、真菌、支原體以及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景［10-13］。2012年，短短芽孢桿菌X23的基因組測(cè)序完成（GenBank ID：CP023474.1），利用antiSMASH軟件分析基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，該菌株含有伊短菌素合成基因簇 ［14-15］。通過(guò)對(duì)伊短菌素基因簇進(jìn)行敲除，驗(yàn)證了該基因簇負(fù)責(zé)伊短菌素的生物合成，并通過(guò)原位啟動(dòng)子工程改造獲得了將伊短菌素的產(chǎn)量提高8倍的短短芽孢桿菌工程菌［16］。為進(jìn)一步提高伊短菌素的產(chǎn)量，人們對(duì)伊短菌素生物合成基因簇進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明： edeB是伊短菌素合成基因簇的重要調(diào)控基因，其編碼蛋白EdeB為ParB蛋白家族成員，分子質(zhì)量為30.42 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.23；該蛋白為親水性蛋白質(zhì)，無(wú)信號(hào)肽和跨膜螺旋區(qū)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式為α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，并且含有16個(gè)磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和20個(gè)O-糖基化位點(diǎn)［17］?；蚯贸突蚧匮a(bǔ)試驗(yàn)表明，edeB在伊短菌素的生物合成過(guò)程中起著正調(diào)控作用，此外，過(guò)表達(dá)edeB基因可顯著提高短短芽孢桿菌X23中伊短菌素的產(chǎn)量［18］。本研究以短短芽孢桿菌X23基因組為材料，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）獲得edeB基因，利用基因同源重組技術(shù)構(gòu)建edeB基因的原核表達(dá)載體，進(jìn)行EdeB蛋白原核表達(dá)和純化，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究edeB基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相。這將有助于深入研究edeB基因在短短芽孢桿菌生防應(yīng)用中的功能及探究其調(diào)控伊短菌素合成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

短短芽孢桿菌X23由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院分離并保藏；質(zhì)粒pET28a、大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞和GB05-dir由湖南省微生物研究院保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基（Luria-Bertani medium，LB）（胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 1.0 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.5，固體培養(yǎng)基則添加1.5%的瓊脂粉）用于短短芽孢桿菌X23、大腸桿菌BL21（DE3）和GB05-dir的培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

高保真DNA聚合酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶Xba I和Xho I購(gòu)自英國(guó)NEB公司；Ni-NTA鎳柱購(gòu)自GIAGEN公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）和卡那霉素均購(gòu)自生工生物工程公司（上海）；基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 短短芽孢桿菌X23基因組的提取

從-80℃超低溫冰箱中取出短短芽孢桿菌X23菌種涂板活化，挑取單菌落接種至裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃、180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)12～16 h，使用基因組DNA提取試劑盒提取短短芽孢桿菌X23的基因組DNA。

1.2.2 edeB基因的擴(kuò)增與表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

參照短短芽孢桿菌X23基因組中edeB基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物序列如下。edeB-F：5'-CCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAA

GAAGGAGATATACCATGTACGATGTGCTGGCAAATCTA-3'；edeB-R：5'-GGGCTTTGTTAGCA

GCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCG

AGTCGCATCGCACATATACACG-3'。以短短芽孢桿菌X23的基因組為模板，應(yīng)用PrimerSTAR Max DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；98℃ 30 s；58℃ 40 s; 58℃ 20 s；72℃ 20 s；共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化。載體pET28a經(jīng)Xba I和Xhol I雙酶切處理后純化回收，并與edeB純化DNA片段混合；采用基因同源重組的方法電擊轉(zhuǎn)入含有重組系統(tǒng)的大腸桿菌GB05-dir；提取質(zhì)粒，進(jìn)行Xba I和Xhol I雙酶切驗(yàn)證和測(cè)序，確認(rèn)目的基因正確后插入載體，將重組質(zhì)粒命名為pET28a-edeB。

1.2.3 EdeB蛋白的表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET28a-edeB轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，挑取單菌落過(guò)夜培養(yǎng)，按照體積比1：100轉(zhuǎn)入50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2.5 h，OD600 nm達(dá)到0.5左右后加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，在16℃下誘導(dǎo)表達(dá)36 h，9 000 r/min離心5 min后收集菌體， 磷酸緩沖液（phosphate belanced solution，PBS）洗滌2次后超聲破碎30 min，9 000 r/min離心10 min。收集上清并用Ni-NTA瓊脂糖鎳柱進(jìn)行蛋白純化，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate poly acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析檢測(cè)EdeB蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 EdeB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載波特氏短芽孢桿菌（Brevibacillus porteri）、強(qiáng)壯短芽孢桿菌（Brevibacillus fortis）、藻渣膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus algifaecis）、土壤短芽孢桿菌（Brevibacillus agri）、熱紅短芽胞桿菌（Brevibacillus thermoruber）、溶短芽孢桿菌（Brevibacillus dissolubilis）、棲深海多分枝霉菌（Polycladomyces abyssicola）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、克里布所島津氏菌（Shimazuella kribbensis）、大豆白驊菌（Baia soyae）和解甘露聚糖熱堿芽孢桿菌（Caldalkalibacillus mannanilyticus）共11種微生物的ParB家族蛋白。使用MEGA7.0軟件，通過(guò)鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建EdeB蛋白與以上11種微生物ParB家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自舉檢驗(yàn)值（bootstrap）設(shè)定為1 000，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。

1.2.5 短短芽孢桿菌edeB基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析

短短芽孢桿菌X23轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的時(shí)間點(diǎn)分別為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12、18、24、30和36 h。將離心收集的菌體迅速轉(zhuǎn)入–80℃的冰箱中保存，參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提取總RNA。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品總RNA的純度及完整性，用分光光度計(jì)（NanoDrop ND2 000）進(jìn)一步檢測(cè)RNA濃度和OD260 nm/OD280 nm、OD260 nm/OD230 nm。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由深圳華大基因科技有限公司完成。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取edeB基因的FPKM表達(dá)數(shù)據(jù)，利用TBtools軟件［19］進(jìn)行基因表達(dá)熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 edeB基因的序列分析及克隆

edeB基因全長(zhǎng)為771 bp，其編碼蛋白有256個(gè)氨基酸（GeneBank ID：ATF13884.1）（圖1）。提取短短芽孢桿菌X23基因組，以其為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得edeB全長(zhǎng)基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可知，長(zhǎng)度與預(yù)期相符（圖2a）。利用基因重組技術(shù)將edeB基因片段連接于pET28a質(zhì)粒載體后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行Xba I和Xhol I雙酶切驗(yàn)證（圖2b），經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后將重組質(zhì)粒命名為pET28a-edeB，并轉(zhuǎn)化E. coil BL21（DE3）構(gòu)建表達(dá)菌株。

2.2 EdeB蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化

pET28a-edeB重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，誘導(dǎo)前無(wú)特異條帶，誘導(dǎo)后菌體破碎離心分離得到的上清液和沉淀均在30 kD附近出現(xiàn)單一特異條帶，而且沉淀中條帶顏色較深，表明EdeB蛋白主要以包涵體的形式存在。對(duì)原核表達(dá)的EdeB蛋白純化后在30 kD處有一清晰的條帶，與預(yù)期蛋白質(zhì)的大小吻合（圖3）。

2.3 EdeB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為探究短短芽孢桿菌X23中EdeB蛋白與其他微生物ParB家族蛋白之間的親緣關(guān)系，本文對(duì)EdeB與11種微生物的ParB家族蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，利用MEGA7.0構(gòu)建NJ進(jìn)化樹(shù)（圖4）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，EdeB蛋白與波特氏短芽孢桿菌（Brevibacillus porteri）ParB蛋白的親緣性最高，與解甘露聚糖熱堿芽孢桿菌（Caldalkalibacillus mannanilyticus）ParB蛋白的親緣性最低。

2.4 短短芽孢桿菌edeB基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析

利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)deB基因在短短芽孢桿菌不同培養(yǎng)時(shí)間（12、18、24、30和36 h）的轉(zhuǎn)錄時(shí)相進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在所有培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)edeB基因均有表達(dá)，但表達(dá)情況具有明顯差異，其中，edeB基因在30 h表達(dá)量最高，在36 h表達(dá)量最低，基因表達(dá)模式呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（圖5）。由此可推測(cè)，短短芽孢桿菌edeB基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相可能與伊短菌素的合成積累過(guò)程有關(guān)。

3 討論

短短芽孢桿菌屬于革蘭陽(yáng)性菌，主要分布在土壤中，隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，其新種陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其中大多數(shù)都有重要的生物學(xué)意義，且具有廣泛的生防潛力，可作為微生物菌劑和植物保鮮劑等［20］。據(jù)報(bào)道，短短芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)抑制病原菌的生長(zhǎng)。例如：2002年，Sheng等［21］分離到一株可有效防治蔬菜病原霉菌的短短芽孢桿菌No.G1，其可產(chǎn)生具有超高熱穩(wěn)定性和抑菌能力的幾丁質(zhì)內(nèi)切酶；2014年，楊廷雅等［22］分離到一株可抑制芒果炭疽菌的短短芽孢桿菌HAB-5，發(fā)現(xiàn)其可產(chǎn)生大小約為14.4 kD的抑菌蛋白。

短短芽孢桿菌X23是在茄科作物根際土壤中分離到的廣譜拮抗細(xì)菌，大田試驗(yàn)對(duì)煙草（Nicotiana tabacum L.）青枯病的平均防治效果達(dá)到85%以上，作為茄科作物青枯病生防菌劑的主要組成菌株已經(jīng)得到大面積推廣［23-26］。edeB基因是短短芽孢桿菌X23伊短菌素合成基因簇中的調(diào)控基因。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，其編碼的EdeB蛋白為ParB家族的一員，可以通過(guò)蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合方式發(fā)揮調(diào)控作用。

ParB家族蛋白已經(jīng)在許多微生物中被鑒定出。該家族蛋白又稱(chēng)質(zhì)粒主動(dòng)分配蛋白，主要參與質(zhì)粒和染色體的分配過(guò)程，具有DNA結(jié)合活性［27］。越來(lái)越多的研究表明，一些ParB家族蛋白不僅參與了質(zhì)粒的分離，還參與了轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，在各種細(xì)胞生物進(jìn)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［28］。EdeB蛋白含有ParB家族結(jié)合DNA的典型HTH結(jié)構(gòu)域，表明其可作為伊短菌素合成基因簇中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮調(diào)控伊短菌素合成的作用。雖然ParB家族蛋白廣泛存在于短短芽孢桿菌中，但是這類(lèi)蛋白參與調(diào)控抗生素生物合成的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

本研究成功克隆獲得了edeB基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體對(duì)EdeB蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)edeB基因序列特征和轉(zhuǎn)錄時(shí)相進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究edeB基因在調(diào)控短短芽孢桿菌伊短菌素合成積累的分子機(jī)制及其功能奠定了基礎(chǔ)，以期為利用分子生物學(xué)手段提高短短芽孢桿菌伊短菌素的產(chǎn)量、篩選獲得高產(chǎn)菌株提供有益的參考。

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收稿日期：2023-02-07；修回日期：2023-03-02。

基金項(xiàng)目：長(zhǎng)沙市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（kq2208130）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32000047）；湖南省技術(shù)攻關(guān)“揭榜掛帥”項(xiàng)目（2021NK1040）；湖南省煙草公司長(zhǎng)沙市公司科技項(xiàng)目（CS2022KJ02）。

作者簡(jiǎn)介：杜杰，助理研究員，主要從事微生物分子遺傳與功能基因組學(xué)的研究。

* 通信作者：劉清術(shù)，研究員，主要從事微生物分子生物學(xué)的研究，E-mail： liuqingshu2012@126.com；? 陳武，副教授，主要從事作物土傳病害生物防控研究，E-mail： chenwuworrior@163.com。