潘綺琳 李淼淼 肖睦滄 艾保全 熊建文

摘 要：通過水熱法和表面修飾法制備了以CoFe2O4為內(nèi)核、TiO2為外殼、用透明質(zhì)酸修飾的HA@CoFe2O4-TiO2。利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）成像、能譜分析（EDS）、X射線衍射（XRD）、X射線光電子譜（XPS）、紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）以及傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對復(fù)合納米顆粒的理化性質(zhì)進行表征。用細胞計數(shù)試劑（CCK-8）法研究HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒在暗室條件下對白血病HL60細胞的毒性，以及在光照條件下的光動力療法（PDT）滅活效果。結(jié)合復(fù)合納米顆粒的熒光光譜（FS）、細胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)量和攝取納米顆粒水平分析，初步探究CoFe2O4和透明質(zhì)酸與TiO2結(jié)合影響PDT滅活HL60細胞的作用機制。試驗結(jié)果表明，HA@CoFe2O4-TiO2形貌規(guī)則呈球形，尺寸符合細胞攝取要求。CoFe2O4拓寬了TiO2的可見光響應(yīng)范圍。暗毒性試驗表明，HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒對HL60細胞的毒性較小。同時，與TiO2和CoFe2O4-TiO2納米顆粒相比，HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的光動力滅活效率高達82.6%，表明其有望成為應(yīng)用于體外PDT治療白血病的光敏劑，提高光動力效率及靶向性。

關(guān)鍵詞：CoFe2O4-TiO2；透明質(zhì)酸；光動力療法；可見光；HL60細胞

中圖分類號：R454.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.02.004

An Experimental Study Based on HA Modified CoFe2O4-TiO2 Nanoparticles by Photodynamic Therapy for HL60 Cells in vitro

PAN Qilin， LI Miaomiao， XIAO Mucang， AI Baoquan， XIONG Jianwen*

（School of Physics and Telecommunication Engineering， South China Normal University， Guangzhou 510006， China）

Abstract： In this study， CoFe2O4-TiO2 was prepared by hydrothermal method， in which CoFe2O4 was the core and TiO2 was the shell， and HA@CoFe2O4-TiO2 was obtained by hyaluronic acid modification. The physicochemical properties of the nanocomposites were characterized by scanning electron microscopy （SEM） imaging， energy dispersive spectroscopy （EDS）， X-ray diffraction （XRD）， X-ray photoelectron spectroscopy （XPS）， ultraviolet-visible absorption spectroscopy （UV-Vis） and Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）. CCK-8 method was used to investigate the toxicity of HA@CoFe2O4-TiO2 nanocomposites on HL60 cells in dark chamber， and the inactivation effect of photodymanic therapy （PDT）. The mechanism of interaction between CoFe2O4， hyaluronic acid and TiO2 on PDT inactivation of HL60 cells was preliminarily investigated by fluorescence spectra （FS）， intracellular ROS production and uptake level analysis of nanocomposites. The experimental results showed that the morphology of HA@CoFe2O4-TiO2 was regular and spherical， and the size met the requirements of cell uptake. The visible response range of TiO2 was broadened with CoFe2O4. Dark toxicity experiment proved that HA@CoFe2O4-TiO2 nanocomposites were less toxic to HL60 cells under darkroom conditions. Meanwhile， Compared with the groups treated with TiO2 and CoFe2O4-TiO2 nanoparticles， the photocatalytic inactivation efficiency of the group treated with HA@CoFe2O4-TiO2 was as high as 82.6%. Therefore， it has the potential to become a photosensitizer for the PDT treatment of leukemia in vitro， improving photodynamic efficiency and targeting.

Key words： CoFe2O4-TiO2; hyaluronic acid; photodynamic therapy; visible light; HL60 cells

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（2）： 126-138）

白血病是一種由造血干細胞惡性克隆引起的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重影響造血系統(tǒng)的正常功能［1］。化學(xué)療法、放射療法、分子靶向療法、免疫治療、造血干細胞移植等是治療各類白血病最常見的治療策略，但它們也面臨著一些嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)［2］。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種基于使用光敏劑（photosensitizer，PS）的非侵入性治療策略。這種光敏劑可以在腫瘤組織上積聚，并可以被特定波長的光源激活，在內(nèi)源性分子氧存在的情況下形成具有細胞毒性的活性氧（reactive oxygen species，ROS），通過破壞細胞膜對微生物和靶組織產(chǎn)生不可逆的損傷，導(dǎo)致細胞壞死或凋亡［3］。PDT是一種有效的癌癥治療方式，可替代放療和化療，被廣泛用于癌癥治療的研究。

PDT系統(tǒng)的核心材料是光敏劑，它吸收光能轉(zhuǎn)化為治療因子或物質(zhì)［4］。二氧化鈦納米顆粒（TiO2 NPs）在各種生物應(yīng)用，如藥物傳遞等方面具有巨大的潛力，具有獨特的光催化特性、成本低、易合成、低毒等優(yōu)點，是一種具有潛力的PDT治療藥物［5-6］。然而，由于銳鈦礦相TiO2具有較寬的能量帶隙（3.2 eV），光誘導(dǎo)載流子的自發(fā)復(fù)合率高，導(dǎo)致其可見光響應(yīng)效率不高，限制了TiO2 NPs的應(yīng)用［7-9］。有研究表明，TiO2可與其他窄帶隙半導(dǎo)體形成異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)，能有效提高光催化劑的光生載流子的分離和光催化效率［10-11］。尖晶石結(jié)構(gòu)的鈷鐵氧體（CoFe2O4）具有可見光響應(yīng)的光催化活性，帶隙窄，低毒，與TiO2結(jié)合可以使復(fù)合納米顆粒的光響應(yīng)范圍拓展到可見光區(qū)［12］。然而，到目前為止，利用銳鈦礦相TiO2包裹CoFe2O4設(shè)計核-殼型異質(zhì)結(jié)光敏劑的研究較少，且CoFe2O4-TiO2對癌細胞缺乏特異性識別能力。受體介導(dǎo)的抗癌藥物攝取可以作為白血病治療的一種有效的藥物傳遞系統(tǒng)［13］。CD44受體在HL60細胞表面高表達［14-16］。有研究發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸（hyaluronicacid，HA）是一種天然多糖，具有生物相容性、可生物降解性和無毒性，對CD44受體有很強的親和力［17-19］。

本研究采用水熱法制備得到了CoFe2O4-TiO2的復(fù)合納米顆粒，其中CoFe2O4為內(nèi)核，TiO2為外殼，并且用HA修飾制得HA@CoFe2O4-TiO2。通過探究TiO2、不同摩爾比的CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的體外PDT滅活效果，分析CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒、HA修飾納米顆粒對HL60細胞的作用效果及機理，驗證HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒應(yīng)用于體外PDT治療白血病的光敏劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人早幼粒急性白血病細胞（HL60細胞）由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供。

1.2 試劑及儀器

試劑：六水三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、氯化鈷（六水合物，CoCl2·6H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、無水乙醇（CH3CH2OH）、乙酰丙酮（C5H8O2）、鈦酸四丁酯（C16H36O4Ti）、25%氨水（NH3·H2O）、HA（C14H21NO11）n、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS，C4H5NO3）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC，C8H17N3］、臺盼藍試劑（北京Biosharp）、細胞計數(shù)試劑（cell counting kit-8，CCK-8）（日本Dojindo）、RPMI-1604培養(yǎng)基（杭州四季青）、活性氧檢測試劑（北京普利萊）、磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，美國Gibco）、醫(yī)用酒精（山東利爾康）、雙蒸餾水。

儀器：集熱式磁力加熱攪拌器（上海紅星）、SK2510LHC超聲儀（上?？茖?dǎo)）、TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀）、101-0A電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京永光明）、KSL-1400X-A2馬弗爐（合肥科晶）、MIRA4場發(fā)射掃描電子顯微鏡（捷克TESCAN）、X射線粉末衍射儀（德國Bruker）、X射線光電子能譜儀（日本島津）、WFY-28型熒光分光光度計（天津拓普）、UV-2600紫外可見分光光度計（日本Shimadzu）、PDT輻照室（自行設(shè)計）、XDS-1A倒置顯微鏡（廣東廣州）、超微振蕩器（姜堰新康）、酶標(biāo)儀（美國Bio Rad）、CountessTM型自動細胞計數(shù)儀（美國Invitrogen）、TDL-50B低速離心機（上海安亭）、HH·CP-TW二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒）、SW-CJ型潔凈工作臺（蘇州安泰）、移液槍（德國Eppendorf）、細胞計數(shù)板、96孔板。

1.3 試驗方法

1.3.1 HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒的制備方法

CoFe2O4的制備：取20 mmol（5.406 0 g）FeCl3·6H2O和10 mmol（2.379 4 g）CoCl2·6H2O加入50.00 mL去離子水中并攪拌，形成溶液A；再向溶液A中加入50.00 mL 2.4 mol/L NaOH溶液，并用磁力攪拌器攪拌30 min，形成前驅(qū)體，將溶液pH調(diào)至8。隨后，將前驅(qū)體轉(zhuǎn)移至對位聚苯（para polyphenyl，PPL）水熱合成高壓釜中，在200℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中反應(yīng)8 h，冷卻后取出。最后用去離子水將產(chǎn)物洗滌3次，然后將其在60℃下干燥12 h，制得CoFe2O4。

CoFe2O4-TiO2的制備：將上述合成的CoFe2O4納米顆粒（0.386 g）分散在35.00 mL乙醇中，在超聲波（40 kHz，100 W）的作用下打散30 min。在磁力攪拌的作用下向溶液中加入4.00 mL乙酰丙酮和5.45 mL鈦酸四丁酯，緩慢加入35.00 mL去離子水和10.00 mL 25%氨水，將溶液轉(zhuǎn)移至高壓釜中180℃反應(yīng)5 h。水熱反應(yīng)后，用去離子水洗滌沉淀物3次，并在60℃下干燥12 h，隨后將其置于500℃的馬弗爐中，以5℃/min的加熱速率煅燒2 h，得到n（CoFe2O4）： n（TiO2）為0.1的復(fù)合納米顆粒CoFe2O4-TiO2，記為CT-0.1。重復(fù)上述試驗過程，改變鈦酸四丁酯的量（分別為2.80 mL、1.08 mL），制備得到n（CoFe2O4）： n（TiO2）分別為0.2和0.5的CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒，對應(yīng)記為CT-0.2、CT-0.5。

HA@CoFe2O4-TiO2的制備：取0.1 g透明質(zhì)酸、36.2 mg EDC和27.9 mg NHS溶于10.00 mL去離子水中攪拌4 h，以活化羧酸部分，形成溶液A。再取上述合成的CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒（CT-0.5，50.0 mg）溶于10.00 mL去離子水，形成5 mg/mL的CoFe2O4-TiO2溶液，并逐滴加入溶液A與活化的透明質(zhì)酸反應(yīng)20 h，通過高速離心得到透明質(zhì)酸修飾的CoFe2O4-TiO2。隨后用去離子水洗滌產(chǎn)物3次，制得HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒。

1.3.2 HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的表征

通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）表征復(fù)合納米顆粒的形貌和尺寸；使用能譜分析（energy dispersive spectroscopy，EDS）儀對復(fù)合納米顆粒的元素組成及含量進行分析；使用X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀對復(fù)合納米顆粒的結(jié)晶度和相純度進行研究；使用X射線光電子譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）對復(fù)合納米顆粒表面的化學(xué)狀態(tài)和元素組成進行分析；使用紫外可見分光光度計（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）對復(fù)合納米顆粒的光響應(yīng)范圍進行測定；使用熒光分光光度計對復(fù)合納米顆粒的電子空穴復(fù)合率進行分析；使用傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）對生物復(fù)合納米材料的官能團和化學(xué)鍵進行研究。

1.3.3 HL60細胞的培養(yǎng)與計數(shù)

將HL60細胞接種至含雙抗的10%新生牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱的托盤中進行培養(yǎng)。每隔24 h換液打散，使用移液槍取20 μL細胞懸浮液與臺盼藍染色液按照體積比1∶1的比例打散并混合均勻；取20 μL混合液加至細胞計數(shù)板的一個孔后迅速插入CountessTM型自動細胞計數(shù)儀中進行計數(shù)，取處于對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

1.3.4 HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒對HL60

細胞的暗毒性試驗與PDT試驗

在96孔培養(yǎng)板上規(guī)劃試驗，用CCK-8［20］檢測在無光照條件下和PDT輻照室中410 nm光照條件下的HL60細胞與各種不同質(zhì)量濃度的復(fù)合納米顆粒共孵育后的細胞活性。取4個96孔培養(yǎng)板分別設(shè)置為光照組A、C板和遮光組B、D板，A、B板上設(shè)有對照組、試驗組以及調(diào)零組，每個試驗變量設(shè)置3個復(fù)孔，以減少試驗誤差。取對數(shù)生長期的HL60細胞制備細胞密度為2×105個/mL的細胞懸液。96孔板中的對照組中每孔接種100 μL細胞懸液和100 μL含雙抗、10%新生牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基；試驗組中每孔接種100 μL細胞懸液和100 μL不同質(zhì)量濃度（20、40、80、160、200、320 μg/mL）的TiO2、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5、HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的溶液；調(diào)零組中每孔接種200 μL含雙抗、10%新生牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基。用微量振蕩器將96孔培養(yǎng)板內(nèi)的細胞懸液和復(fù)合納米顆粒的溶液振蕩3 min，用75%醫(yī)用酒精拭擦消毒后置于CO2培養(yǎng)箱中進行避光培養(yǎng)12 h。取出光照組A、C板放入PDT輻照室中光照1 h，光照劑量為18 J/cm2，遮光組B、D板在CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)進行避光培養(yǎng)。隨后向96孔板中每孔加入20 μL CCK-8，放置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 h使用iMarkTM酶標(biāo)儀測定A、B板每孔的吸光度（optical density，OD）值，連續(xù)暗室條件下孵育4 h后，OD值接近1，停止培養(yǎng)。

利用公式（1）計算細胞的相對存活率：

R=×100%。（1）

式中R表示細胞相對存活率；ODtreat表示試驗組的OD值；ODcontrol表示對照組的OD值；ODblank

表示調(diào)零組的OD值。

利用公式（2）計算PDT滅活效率：

EPDT=（1-）×100%。（2）

式中EPDT為光動力滅活效率；ODirradiation表示光照組A、C板試驗組的OD值；ODblankA表示光照組A、C板調(diào)零組的OD值；ODwithout-irradiation表示遮光組B、D板試驗組的OD值；ODblankB表示遮光組B、D板調(diào)零組的OD值。

1.3.5 細胞內(nèi)ROS檢測

熒光探針標(biāo)記方法可檢測細胞內(nèi)的ROS水平，具有較高的靈敏度、高分辨率、數(shù)據(jù)處理方便等優(yōu)點［21-23］。取1.5 mL細胞密度為2×105個/mL的細胞懸液和1.5 mL質(zhì)量濃度為320 μg/mL的不同的復(fù)合納米顆粒的溶液分別接種至6孔培養(yǎng)板中，在CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)12 h。用培養(yǎng)基稀釋活性氧檢測試劑（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）至濃度為10 μmol/L，加入6孔板中，振蕩3 min混合均勻后放置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中共孵育40 min。取出細胞液，離心，棄其上清，用PBS洗滌2次，將6孔培養(yǎng)板放入PDT輻照室中光照1 h，使用熒光分光光度計測量每孔溶液的熒光強度，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射峰約為525 nm。

1.3.6 細胞攝取納米顆粒的熒光檢測

用熒光光譜分析CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）和HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的細胞攝取情況。取1.5 mL細胞密度為2×105個/mL的細胞懸液和1.5 mL質(zhì)量濃度為320 μg/mL的不同復(fù)合納米顆粒溶液分別接種至6孔培養(yǎng)板中，振蕩3 min混合均勻后放置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中共孵育12 h。取出6孔培養(yǎng)板，用PBS溶液洗滌細胞3次，去除未進入細胞的復(fù)合納米顆粒。最后使用熒光分光光度計，在激發(fā)波長為410 nm條件下測試每孔溶液的熒光強度，可以間接反映細胞攝取納米顆粒后的濃度，與攝取前納米顆粒溶液的熒光強度進行對比。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

測試數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件分析顯著性差異，進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。使用Origin 8.5軟件進行作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為3個重復(fù)試驗孔的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）。在所有的統(tǒng)計分析中，P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合納米顆粒的表征

2.1.1 SEM成像和EDS分析

CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）、HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的SEM圖像如圖1a、1d和1g所示，其中CoFe2O4和CoFe2O4-TiO2納米顆粒均呈球形，表面形貌規(guī)則。由圖1a可見，CoFe2O4納米顆粒粒徑較小，但有部分團聚的現(xiàn)象。圖1d為TiO2包裹CoFe2O4形成的CoFe2O4-TiO2，納米顆粒尺寸雖然增大，但是改善了納米顆粒的團聚現(xiàn)象，粒徑分布均勻。圖1g為CoFe2O4-TiO2經(jīng)HA修飾形成的HA@CoFe2O4-TiO2，分散性較好。利用Nano Measurer 1.2軟件計算出納米顆粒的粒徑，其粒徑分布統(tǒng)計圖分別如圖1b、1e和1h所示，CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）和HA@CoFe2O4-TiO2的平均粒徑分別約為39.17、55.99和71.17 nm。CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）和HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒的粒徑均小于100 nm，能被細胞攝取。

CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2（CT-0.5）和HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的EDS分析如圖1c、1f和1i所示。圖1c可見O、Fe、Co的元素峰，Co和Fe的原子百分?jǐn)?shù)分別為19.12%和42.18%，Co和Fe的原子比約為1∶2，表明CoFe2O4納米顆粒已成功制備，且無其他雜質(zhì)元素。圖1f中O、Fe、Co、Ti的元素峰表明CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒已有效合成，Co、Fe、Ti的原子百分?jǐn)?shù)分別為11.06%、23.50%、29.45%，與CT-0.5的理論值一致，說明在CoFe2O4表面用TiO2包裹形成的CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒為CT-0.5。圖1i中多了C的元素峰，表明存在有機物HA。此外，C、O、Ti、Fe、Co的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25.88%，17.37%、22.90%、21.31%、12.55%，且無其他雜質(zhì)元素。

2.1.2 XRD圖譜分析

本研究利用XRD研究了樣品TiO2、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5、CoFe2O4的結(jié)晶度和相純度，結(jié)果如圖2所示。CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5均在2θ為18.12°、30.20°、35.54°、43.19°、57.35°、62.58°時出現(xiàn)CoFe2O4的衍射峰，分別對應(yīng)于尖晶石型的（111）、（220）、（311）、（400）、（422）、（440）晶面的衍射峰［24-25］；同時在2θ為25.39°、37.89°、48.18°、53.98°、55.19°、62.85°、68.96°、70.35°、75.25°時出現(xiàn)TiO2的衍射峰分別對應(yīng)于銳鈦礦型的（101）、（004）、（200）、（105）、（211）、（204）、（116）、（220）、（215）晶面的衍射峰［26］。在TiO2、CoFe2O4、CoFe2O4-TiO2的圖譜中沒有觀察到任何雜質(zhì)的存在，表明所制得的樣品純度較高。另外，TiO2、CoFe2O4-TiO2經(jīng)過高溫煅燒后結(jié)晶度較CoFe2O4高。在XRD圖譜的基礎(chǔ)上，利用Debye-Scherrer公式［27］估算了樣品的平均晶粒尺寸D：

D=（3）

其中，K為常數(shù)0.89，λ為輻射波長（λCu =1.541 78 ?），θ為布拉格角，β為半波峰全寬（full width at half maxima，F(xiàn)WHM）。TiO2、CoFe2O4、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5的平均晶粒尺寸分別為22.0、19.0、42.9、41.4、28.3 nm，所得結(jié)果略小于SEM圖測得的水合粒徑。

2.1.3 XPS分析

圖3為CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的XPS。圖3a顯示，284.8、456.0、528.0、709.0和778.0 eV的結(jié)合能分別屬于C 1s、Ti 2p、O 1s、Fe 2p和Co 2p。在這些特征峰中，C 1s來自于吸附在樣品表面的空氣中的CO2。用C 1s（284.8 eV）［28］進行標(biāo)定，各元素的高分辨率光譜如圖3b～3e所示。

Co 2p的高分辨率光譜在780.26和796.15 eV處出現(xiàn)兩個峰，分別對應(yīng)于Co 2p3/2和Co 2p1/2態(tài)；此外，位于785.06和802.55 eV的衛(wèi)星峰分別對應(yīng)于尖晶石體系八面體和四面體位點Co2+的氧化態(tài)［29］。Fe 2p的高分辨率光譜在Fe 2p3/2和Fe 2p1/2主峰上各有兩個自旋軌道分裂雙峰，表明Fe3+離子存在于兩個不同的點陣位置，與立方尖晶石型晶體結(jié)構(gòu)的預(yù)期一致，結(jié)合能在710.43和724.16 eV處歸因于八面體中的Fe3+，在712.65和726.74 eV處歸因于四面體中的Fe3+，在718.72和733.34 eV處的峰為振蕩衛(wèi)星峰［30］。O 1s的高分辨率光譜在529.77、531.02和532.98 eV處出現(xiàn)特征峰，分別對應(yīng)于TiO2和CoFe2O4中的Co-O-Fe橋接鍵、TiO2表面吸附水末端的-OH鍵（Ti-OH）和TiO2的晶格氧空位（Ov），這種氧缺陷的現(xiàn)象可能歸因于合成過程中形成的Ti3+。Ti 2p的高分辨率光譜在458.58和464.44 eV處出現(xiàn)兩個峰，分別對應(yīng)于TiO2中Ti4+的Ti 2p3/2和Ti 2p1/2態(tài)；在459.49 eV處出現(xiàn)的峰對應(yīng)于Ti2O3中的Ti3+。TiO2表面的Ti4+和Ti3+表明，溶劑熱反應(yīng)過程中會形成大量的氧空位Ov，氧化態(tài)較低的Ti3+證實了氧缺陷。Ti3+的存在通過創(chuàng)造新的中隙態(tài)增加了光催化活性［31］。

2.1.4 UV-Vis分析

TiO2、CoFe2O4、CT-0.1、CT-0.2和CT-0.5復(fù)合納米顆粒的UV-Vis吸收光譜如圖4a所示。TiO2在400 nm波段以下的紫外光區(qū)吸收較強，而CoFe2O4的光吸收范圍沿可見光區(qū)域擴展，在近紅外光區(qū)吸收逐漸減弱。CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的光譜也有較寬的吸收范圍，從紫外光區(qū)擴展到可見光區(qū)，表明與純TiO2相比，TiO2由于與CoFe2O4相偶聯(lián)而發(fā)生紅移。CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒在410 nm的可見光區(qū)吸收較強，TiO2、CoFe2O4、CT-0.1、CT-0.2和CT-0.5復(fù)合納米顆粒對可見光410 nm波段的吸收值分別為0.059、1.347、0.938、1.043和1.177。有類似的研究發(fā)現(xiàn)，CoFe2O4-TiO2光吸收的增加是由于在鈦氧化物晶格結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)e3+（0.64 ?）或Co2+（0.65 ?）取代了一些Ti4+（0.68 ?）離子，這種離子取代意味著TiO2的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，F(xiàn)e3+/Co2+修飾成為價帶（valence band，VB）或?qū)В╟onduction band，CB）之間的一個新的雜質(zhì)能級，縮小了原有的帶隙，增強了可見光的響應(yīng)范圍［32］。本試驗光動力輻照室中LED陣列光源的發(fā)射光譜如圖4b所示，發(fā)射峰為409.54 nm，能有效激發(fā)CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒，從而進行PDT試驗。

2.1.5 FTIR分析

圖5a為納米顆粒的FTIR。在CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的FTIR（曲線a）中出現(xiàn)了759、1 634、3 357 cm–1的吸收峰，位于759 cm–1的吸收峰對應(yīng)于O-Ti-O鍵的振動［33］，在1 634和3 357 cm-1的吸收峰歸因于表面殼層銳鈦礦TiO2的羥基（-OH）的彎曲振動和伸縮振動［34］。

在HA的FTIR（曲線b）中，1 032 cm–1的吸收峰是由于環(huán)狀酸酐的C-O-C伸縮振動引起的，1 321和1 375 cm–1處的峰對應(yīng)于羧酸基團的特征峰，1 406 cm–1的吸收峰是由N-乙酰氨基的C-N鍵對稱伸縮振動引起的，在1 606 cm–1的吸收峰歸因于羧酸基團的酰胺（-CO-NH-）中C=O的反對稱伸縮振動［35］，在2 896 cm–1處表示醛基的飽和碳原子上的C-H基團的振動峰，處于3 289 cm–1的吸收峰歸因于締合態(tài)OH的伸縮振動［36］。

在HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的FTIR（曲線c）中，位于761 cm–1的吸收峰對應(yīng)于CoFe2O4-TiO2中O-Ti-O鍵的振動；當(dāng)HA與CoFe2O4-TiO2結(jié)合時，峰值移到了1 630 cm–1處，表明HA的游離羧酸基團參與了CoFe2O4-TiO2殼層羥基的鍵合；與CoFe2O4-TiO2的FTIR相比，羥基（-OH）的伸縮振動吸收峰向低波數(shù)方向移到了3 244 cm–1處，是羥基化合物產(chǎn)生的締合現(xiàn)象［37］；在1 406和2 896 cm–1處出現(xiàn)N-乙酰氨基和D-葡萄糖醛酸的特征峰表明，HA被成功地包覆在了CoFe2O4-TiO2表面。

HA的分子結(jié)構(gòu)如圖5b所示，是由β-1，4-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-N-乙酰-D-葡糖胺的重復(fù)雙糖單元組成的線性陰離子聚合物，其含有羧酸、羥基和N-乙酰氨基，很容易與其他化學(xué)物質(zhì)結(jié)合［38］。HA分子中含有大量的羧基，而CoFe2O4-TiO2外殼含有豐富的羥基。綜合上述FTIR可知，HA通過其羧酸基團與CoFe2O4-TiO2的殼層表面的羥基以酯化反應(yīng)的形式結(jié)合。

2.2 細胞試驗

2.2.1 CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒對HL60細胞的暗毒性試驗

圖6顯示了不同質(zhì)量濃度與不同摩爾比的CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒孵育12 h后HL60細胞的活力?？梢钥闯觯S著納米顆粒質(zhì)量濃度的增加，細胞活力降低。此外，在低質(zhì)量濃度（小于150 μg/mL）的納米顆粒孵育后，細胞活力沒有受到納米顆粒的顯著影響。然而，當(dāng)CT-0.5納米顆粒質(zhì)量濃度增加到較高濃度200 μg/mL和320 μg/mL時，HL60細胞的活力分別降低到（87.1±2.2）%和（86.6±1.7）%，這仍然是可以接受的。這表明，即使在相對高濃度的納米顆粒下，CoFe2O4-TiO2仍具有相對較低的細胞毒性。在納米顆粒質(zhì)量濃度低于40 μg/mL時，HA@CoFe2O4-TiO2處理HL60細胞后的存活率高于CoFe2O4-TiO2，可能是由于在低濃度下，HL60細胞攝取復(fù)合納米顆粒的量是相同的，而經(jīng)過透明質(zhì)酸包裹后的CoFe2O4-TiO2可減少CoFe2O4暴露對細胞的損傷。當(dāng)質(zhì)量濃度達到320 μg/mL時，HA@CoFe2O4-TiO2處理后的細胞存活率為（82.0±1.5）%，仍然高于80%。

2.2.2 CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒對HL60細胞的PDT體外滅活試驗

在光照條件下，TiO2、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5復(fù)合納米顆粒對HL60細胞的PDT滅活效率隨質(zhì)量濃度變化的曲線如圖7所示。由圖可知，納米顆粒質(zhì)量濃度增加，PDT效率會隨之提高。在相同質(zhì)量濃度條件下，PDT滅活效率的高低依次是CT-0.5>CT-0.2>CT-0.1>TiO2，這說明，以CoFe2O4為內(nèi)核、TiO2為殼層形成的CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的PDT效率比TiO2高。當(dāng)CoFe2O4與TiO2的摩爾比為1：2、質(zhì)量濃度為320 μg/mL時，CT-0.5對HL60細胞的最佳PDT滅活效率為（78.3±1.8）%，而TiO2對HL60細胞的最佳PDT滅活效率為（52.6±2.9）%。CT-0.5復(fù)合納米顆粒同時具有較低的暗毒性和高光毒性。經(jīng)過HA修飾后的HA@CoFe2O4-TiO2對白血病HL60細胞的可見光PDT滅活效率顯著提高。當(dāng)質(zhì)量濃度為320 μg/mL時，HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的最佳滅活效率為（82.6±1.3）%。

2.3 HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒PDT體外滅活HL60細胞的機理分析

2.3.1 CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒熒光光譜分析

當(dāng)光敏劑被特定波長光照射時，價帶上的電子因吸收足夠的入射光子能量被激發(fā)到高能級的導(dǎo)帶，而這個過程電子和空穴會復(fù)合導(dǎo)致發(fā)射熒光，發(fā)光的強度與電子空穴的復(fù)合率有關(guān)［39］，從而可以揭示載流子的壽命。如圖8所示，TiO2、CT-0.1、CT-0.2、CT-0.5復(fù)合納米顆粒的熒光強度依次降低，說明CoFe2O4的引入有效抑制了TiO2光生電子、空穴的復(fù)合，內(nèi)核CoFe2O4與殼層TiO2之間發(fā)生了有效的電子轉(zhuǎn)移。CT-0.5復(fù)合納米顆粒的電子-空穴復(fù)合率最低，更多的電子、空穴參與光動力反應(yīng)產(chǎn)生了ROS，進而提高了PDT效率。復(fù)合納米顆粒中電子空穴較低的復(fù)合率可能是由于納米復(fù)合材料結(jié)構(gòu)中較高的雜質(zhì)水平導(dǎo)致了非輻射型的復(fù)合。

2.3.2 活性氧水平分析

在癌癥的PDT中，光敏劑選擇性地在腫瘤組織中積累，被最佳波長的光激發(fā)后，光敏劑與周圍氧分子反應(yīng)產(chǎn)生了具有細胞毒性的1O2和其他形式的ROS，導(dǎo)致細胞膜、線粒體或溶酶體損傷，最終通過凋亡或壞死導(dǎo)致細胞死亡［40］，因此，細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平是評估光敏劑介導(dǎo)PDT滅活細胞的重要參數(shù)。使用熒光分光光度計測試活性氧探針DCFH-DA被氧化為2'，7'-二氯熒光素（2'，7'-dichlorofluorescein，DCF）的熒光強度，DCF的最大波峰在528 nm，其熒光強度的增強與ROS產(chǎn)量成正比。如圖9所示，經(jīng)PDT處理后，CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒作用后細胞的綠色熒光強度顯著高于TiO2組，表明CoFe2O4-TiO2組的ROS產(chǎn)量顯著增加，即有更多的光生空穴、電子參與細胞內(nèi)水和氧分子的氧化還原反應(yīng)；CT-0.5復(fù)合納米顆粒處理后，細胞內(nèi)的ROS產(chǎn)量最高，是TiO2組的1.9倍。此結(jié)果與PDT滅活效率結(jié)果一致，光照后光敏劑產(chǎn)生的ROS是PDT滅活HL60細胞的主要因素。HA@CoFe2O4-TiO2處理后的HL60細胞在光照1 h后，相比于CoFe2O4-TiO2能產(chǎn)生更多ROS，這可能是由于CoFe2O4-TiO2部分團聚，表面體積比變小，光照射到外殼TiO2的面積有限。而HA@CoFe2O4-TiO2顆粒表面的HA具有親水性，在水溶液中具有更好的分散性，表面體積比更大，吸收光效率更高，因此HA@CoFe2O4-TiO2產(chǎn)生的ROS含量更高。

2.3.3 細胞內(nèi)攝取納米顆粒的水平分析

為了進一步證實HA可以促進靶細胞對HA@CoFe2O4-TiO2的特異性攝取，本研究采用熒光光譜分析HL60細胞對CoFe2O4-TiO2和HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的胞內(nèi)攝取情況。圖10為原始組質(zhì)量濃度為320 μg/mL的CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2和攝取組經(jīng)過12 h孵育后，被細胞吸收的納米顆粒產(chǎn)生的熒光強度。兩圖中a、b曲線的重疊程度可以反映HL60細胞對納米顆粒的吸收程度，與CoFe2O4-TiO2組相比，經(jīng)過HA修飾后的HA@CoFe2O4-TiO2納米顆粒的攝取增加。

3 討論

TiO2具有較高的光生電子-空穴對復(fù)合率，因此生成的電子-空穴對只有一小部分可用于光催化反應(yīng)。摻雜金屬或非金屬，或形成異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)能有效分離半導(dǎo)體光催化劑中的光生電子-空穴對，從而提高光催化效率。本研究的CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒是一種核殼異質(zhì)結(jié)構(gòu)，內(nèi)核CoFe2O4為p型半導(dǎo)體，外殼TiO2為n型半導(dǎo)體，兩者形成了p-n異質(zhì)結(jié)。TiO2的電子經(jīng)過p-n界面擴散到CoFe2O4，留下帶正電的空穴（h+）；同時，CoFe2O4的空穴擴散到TiO2中，留下帶負(fù)電的電子（e-）。電子和空穴繼續(xù)擴散，CoFe2O4的EF位置升高，而TiO2的EF位置下降，直到CoFe2O4和TiO2的費米能級EF相等，達到熱平衡為止，最后在p-n界面中形成一個內(nèi)部電場。CoFe2O4和TiO2能帶彎曲，CoFe2O4的整體能級上升，而TiO2的整體能級下降［12］。由于從n型半導(dǎo)體TiO2的導(dǎo)帶到p型半導(dǎo)體CoFe2O4的價帶形成的內(nèi)部電場的影響，光照時，光生電子很容易從CoFe2O4的ECB轉(zhuǎn)移到TiO2的ECB，光生空穴從TiO2的高EVB轉(zhuǎn)移到CoFe2O4的低EVB。TiO2的eCB-可以將O2還原為O2·，而hVB+則可以將水氧化為羥基自由基（·OH）等ROS物質(zhì)。電子的有效轉(zhuǎn)移延長了分離后載流子的壽命，并與細胞周圍環(huán)境的底物反應(yīng)生成ROS。

本文主要研究了HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒對HL60細胞的PDT滅活效果。采用水熱法制備了不同摩爾比的CoFe2O4-TiO2核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米顆粒。SEM分析表明，納米顆粒形貌規(guī)則呈球形，粒徑大小符合細胞攝取要求。XPS分析表明，氧化態(tài)較低的Ti3+的存在可能是由于溶劑熱反應(yīng)過程中形成了大量的氧空位Ov。UV-Vis分析表明，CoFe2O4拓寬了TiO2的可見光響應(yīng)范圍，對可見光吸收增強。使用HA對CT-0.5復(fù)合納米顆粒的表面進行修飾，F(xiàn)TIR分析表明，HA分子通過其羧基基團與CoFe2O4-TiO2的殼層表面的羥基以酯化反應(yīng)的形式結(jié)合，使得HA修飾的納米顆粒對HL60細胞具有靶向性，也增強了CoFe2O4-TiO2可見光PDT滅活白血病HL60細胞的效率。暗毒性試驗表明，CoFe2O4-TiO2、HA@CoFe2O4-TiO2具有較低的暗毒性。對于CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒而言，CoFe2O4的存在導(dǎo)致Fe3+和Co2+離子的釋放，引起DNA損傷，造成一定的生物遺傳毒性。對于不同摩爾比的CoFe2O4-TiO2，TiO2外殼厚度越大，其對HL60細胞的毒性越低，在無光照條件下能減少CoFe2O4內(nèi)核的暴露，起保護細胞的作用。由于在高質(zhì)量濃度下，CoFe2O4-TiO2已達到細胞的最大攝取量，而HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的親和力越高，細胞對其攝取量越大，導(dǎo)致細胞存活率越低。這表明，HA的修飾提高了CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的生物相容性。在光照條件下，CoFe2O4-TiO2的PDT滅活效果優(yōu)于TiO2，其中CT-0.5對HL60細胞的最佳PDT滅活效率達到了（78.3±1.8）%。CoFe2O4的引入有效抑制了TiO2光生電子、空穴的復(fù)合，CoFe2O4-TiO2的電子-空穴復(fù)合率越低，納米顆粒表面產(chǎn)生的ROS越多，PDT效率越高。當(dāng)納米顆粒的質(zhì)量濃度高于200 μg/mL時，PDT效率增長趨勢變緩，這可能是由于納米顆粒的質(zhì)量濃度較高，HL60細胞對納米顆粒的攝取達到了極限值。而經(jīng)HA修飾形成的HA@CoFe2O4-TiO2對HL60細胞的親和力越高，細胞的攝取量越大，越多的復(fù)合納米顆粒參與光動力反應(yīng)，因此，HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒的PDT滅活HL60細胞的效率越高，最佳PDT滅活效率達到了（82.6±1.3）%。HA@CoFe2O4-TiO2很可能通過內(nèi)吞作用被吸收，而CoFe2O4-TiO2則可能通過細胞膜自由擴散。已有大量研究表明，在許多白血病細胞如人急性髓系白血病細胞、HL60細胞表面的CD44受體過表達。CD44是HA的主要結(jié)合受體之一，負(fù)責(zé)HA與細胞表面相互作用［41］，表明HA@CoFe2O4-TiO2可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑被CD44受體過度表達的癌細胞特異性吸收，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用比非特異性結(jié)合（穿透過程）更有效。HL60細胞能靶向吸收更多的HA@CoFe2O4-TiO2復(fù)合納米顆粒，被可見光激發(fā)產(chǎn)生更多的電子、空穴參與細胞內(nèi)水分子、氧氣的氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生更多的ROS殺傷細胞，從而提高PDT滅活HL60細胞的效率。

本研究制備的HA@CoFe2O4-TiO2對白血病HL60細胞具有靶向性及較高的PDT滅活效率，有望成為應(yīng)用于體外PDT治療白血病的光敏劑。但體內(nèi)PDT滅活效果及對正常細胞是否有殺傷作用尚未探究。接下來將在活體內(nèi)進行PDT滅活試驗，更好地了解HA@CoFe2O4-TiO2的體內(nèi)命運，在細胞攝取后實現(xiàn)對藥物釋放的控制，以達到所需的藥效學(xué)效果。

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收稿日期：2023-01-09；修回日期：2023-02-04。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（12075090）。

作者簡介：潘綺琳，碩士研究生。

* 通信作者：熊建文，教授，主要從事激光生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)方面的研究。E-mail： jwxiong@scnu.edu.cn。