李宏名，胡瑞馨，鄭維江，鄧麗

1國藥集團(tuán)川抗制藥有限公司，成都 611731；

2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130

同一種藥物的不同晶型可能存在著溶解性、堆密度、吸濕性、靜電吸附等理化性質(zhì)、穩(wěn)定性等方面的差異，而這些差異又可能影響下游結(jié)晶工藝和制劑處方過程，甚至影響制劑終產(chǎn)品的有效性、安全性和穩(wěn)定性[1-2]。作為藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要分支，晶型研究越來越受到關(guān)注，已成為藥物研發(fā)中的熱點(diǎn)。為了促進(jìn)和規(guī)范藥物晶型研究，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、人用藥品技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)理事會（ICH）、國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）等監(jiān)管機(jī)構(gòu)相繼出臺了針對晶型研究的相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則[3-5]。

在晶型研究中，晶型鹽型的篩選試驗(yàn)所涉及的結(jié)晶方式的確定及其所用溶劑種類的選擇，結(jié)晶工藝開發(fā)試驗(yàn)所涉及的結(jié)晶方式的確定及其所用溶劑種類的選擇，諸如這些藥物晶型研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，都需要大量的溶解度數(shù)據(jù)支撐[6-7]。而經(jīng)典“搖瓶法”作為溶解度測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，雖然數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高，但存在檢測效率低、耗時長等缺點(diǎn)，已不能滿足晶型研究對溶解度數(shù)據(jù)量需求大的要求。如何快速、高效地獲得大量的藥物溶解度數(shù)據(jù)已成為晶型研究的一個棘手問題。同時，晶型研究對溶解度數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性要求不高，可以允許一定程度的誤差，為溶解度的高效測定創(chuàng)造了條件。本文旨在探討晶型研究中溶解度的高效測定，并提供一些建設(shè)性的建議。

1 儀器設(shè)備

JXH-200 恒溫振蕩儀[拓赫機(jī)電科技（上海）有限公司]；JJ223BC 電子分析天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；MS-10 迷你掌上離心機(jī)（常州恩誼儀器有限公司）；1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）。

2 溶解度測定方法

2.1 常用測定方法簡介 藥物晶型研究中溶解度的測定，常用方法有兩種。第一種方法是動態(tài)溶劑法，其原理是在一定量的固體藥物中逐次加入溶劑，分別記錄固體藥物最后一次未溶解和第一次溶解時的溶劑量，即可計(jì)算出固體藥物的溶解度范圍。在實(shí)際操作中，通常先精密稱取一定量的固體藥物，再分3～5 次添加溶劑，如果觀察到相鄰兩次加入溶劑時固體藥物分別處于渾濁和澄清狀態(tài)，則可計(jì)算出固體藥物的溶解度范圍；如果最后一次加入溶劑后固體藥物仍然處于渾濁狀態(tài)，則可計(jì)算出固體藥物的最大溶解度。這種測定方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，對設(shè)備要求低，有1 臺萬分之一天平即可，無需額外的檢測設(shè)備。這種方法也有其缺點(diǎn)，其一是操作繁瑣，需要不停地觀察體系的狀態(tài)和不斷添加溶劑，且每次加入溶劑后均需要混合足夠的時間以確保體系達(dá)到動態(tài)平衡，溶解度測定時間長；其二是固體藥物剛?cè)芙夂?，還需要額外加入過量固體，并平衡一定時間后，才能確定該溶劑中的固相組成；其三是溶解度數(shù)據(jù)不夠精確，只能得到溶解度的范圍。第一種方法的簡要流程見圖1。

圖1 動態(tài)溶劑法流程示意圖

晶型研究中測定溶解度的第二種常用方法是靜態(tài)平衡法，其原理是在一定量的溶劑中加入固體藥物直至固體過量并達(dá)到靜態(tài)平衡。在實(shí)際操作中，通常先加入少量的溶劑，再一次或分多次加入固體藥物，直至固體不再消失，混合足夠長的時間以確保固液平衡，用紫外檢測法（UV）或高效液相色譜法（HPLC）檢測液相中藥物濃度，即為固體藥物的溶解度。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，加料次數(shù)少；可同時測定大量數(shù)據(jù)；溶解度數(shù)據(jù)較第一種方法更準(zhǔn)確；固體信息容易通過X-射線粉末衍射法（XRPD）、拉曼光譜等檢測方法獲得。這種方法的缺點(diǎn)是UV 或HPLC 檢測量大、耗時較長，且在溶解度較高的體系中需要較多的固體藥物，容易造成物料的浪費(fèi)。第二種方法的簡要流程見圖2。

圖2 靜態(tài)平衡法流程示意圖

2.2 采用高效液相色譜對藥物溶解度的高效測定方法為了更高效地測定溶解度以便更好地服務(wù)于晶型研究，本文提出一種新的溶解度測定方法，該方法結(jié)合了以上兩種常用方法的優(yōu)點(diǎn)。本文方法在溶解度測定時將溶解度范圍進(jìn)行初步分類，溶解度大于100 mg/ml 的體系采用第一種方法，可以克服第二種方法物料消耗大的缺點(diǎn)；溶解度10～100 mg/ml 的體系采用第二種方法，可以克服第一種方法溶解度不夠精確的缺點(diǎn)。以下是具體的實(shí)驗(yàn)步驟，供晶型研究人員參考。

（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：選擇合適的溶劑填入表1；

表1 溶解度測試實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果統(tǒng)計(jì)

（2）按步驟1 設(shè)計(jì)的溶劑種類數(shù)一次性精密稱取多份約10 mg 原料藥，分別加入到已編號的2 ml 液相進(jìn)樣瓶中；

（3）用移液槍取步驟1 設(shè)計(jì)的溶劑各100 μl，分別加入已編號的液相進(jìn)樣瓶中，放入已恒溫至20℃的恒溫振蕩儀中混合5～10 min，如果體系渾濁則進(jìn)入下一步，如果體系澄清則將溶解度結(jié)果記錄為“＞100”；

（4）用移液槍取步驟1 設(shè)計(jì)的溶劑各100 μl，分別加入仍然渾濁的液相進(jìn)樣瓶中，放入已恒溫至20℃的恒溫振蕩儀中混合5～10 min，如果體系渾濁則進(jìn)入下一步，如果體系澄清則將溶解度結(jié)果記錄為“50～100”；

（5）用移液槍取步驟1 設(shè)計(jì)的溶劑各800 μl，分別加入仍然渾濁的液相進(jìn)樣瓶中，放入已恒溫至20℃的恒溫振蕩儀中混合5～10 min，如果體系渾濁則將稀釋倍數(shù)設(shè)定為10 倍，如果體系澄清則將稀釋倍數(shù)設(shè)定為50 倍。體系于恒溫20℃繼續(xù)混合24 h，混合過程中可加入固體確保固體過量；

（6）混懸體系轉(zhuǎn)入2 ml 離心管后離心，固相檢測XRPD 法確認(rèn)晶型，液相按步驟5 確定的稀釋倍數(shù)稀釋后用HPLC 法檢測藥物濃度；

（7）重復(fù)以上步驟測定高溫時（建議40℃即可）的溶解度。

3 討論

3.1 溫度 不同藥物的溶解度受溫度的影響程度不同，大多數(shù)藥物的溶解度受溫度的影響較大，在測定溶解度時，溫度是一個十分重要的參數(shù)。通常情況下，溶解度測定時需要同時考慮兩種不同溫度條件：較高的溫度和較低的溫度?？紤]到設(shè)備對溫度控制的難易程度，較低的溫度通常選擇室溫，在晶型篩選中有時會選擇一些低沸點(diǎn)溶劑，因此較高的溫度可選擇為40℃，如果不考慮低沸點(diǎn)溶劑，較高的溫度也可選擇超過40℃，如50℃或更高，但不應(yīng)超過所有已選擇溶劑沸點(diǎn)以下10℃。

3.2 樣品 固體藥物中雜質(zhì)的種類和含量可能會影響其溶解度[8]。通常情況下，不同工藝制備的樣品其雜質(zhì)譜存在一定的差異。一般來說，多數(shù)情況下雜質(zhì)會引起固體藥物溶解度的增大，少數(shù)情況下雜質(zhì)會引起固體藥物溶解度的減小，某些雜質(zhì)的存在甚至可能引起藥物溶解度的巨大變化，從而導(dǎo)致溶解度測定數(shù)據(jù)的較大誤差，因此溶解度測試時的樣品最好采用已確定的工藝路線制備的樣品。對于雜質(zhì)譜相同的藥物樣品，純度越高、雜質(zhì)含量越低，其溶解度數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性也越高，因此在晶型研究中用于溶解度測試的樣品純度應(yīng)不低于95%。

3.3 溶劑 固體藥物在不同溶劑中的溶解度往往不同，溶劑對溶解度的影響是多方面的。因此在進(jìn)行溶解度測試時，需要考慮溶劑的多種因素，如溶劑的熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、極性、介電常數(shù)、黏度、氫鍵以及溶劑與藥物分子的相互作用等。在溶解度試驗(yàn)中，應(yīng)在有限的試驗(yàn)數(shù)量內(nèi)盡可能多地選擇不同類型的溶劑，同時也應(yīng)考慮溶劑殘留對藥物質(zhì)量的影響，在藥物晶型研究中的溶劑選擇也應(yīng)遵循ICH Q3C“優(yōu)先選擇使用三類溶劑，控制使用二類溶劑，盡量避免使用一類溶劑”的原則[9]。

在溶解度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時，應(yīng)盡可能多地選擇不同結(jié)構(gòu)類型的溶劑，建議優(yōu)先選擇以下幾種常見的溶劑：甲醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、甲基叔丁基醚、丙酮、丁酮、乙腈、甲苯、正庚烷、二氯甲烷、二甲亞砜（DMSO）、純化水（通常加入10% DMSO）以及四氫呋喃或1，4-二氧六環(huán)（二選一或全選）。適當(dāng)?shù)臅r候可以選擇混合溶劑。

3.4 容器 恒溫振蕩儀可以根據(jù)不同的使用情形，更換不同的模塊，使用2 ml、5 ml 或10 ml 塑料離心管，但制造這類離心管的最主要材質(zhì)是聚丙烯，可能會在某些溶劑中浸出而影響溶解度的測試結(jié)果[10]，再加上塑料離心管的密封性普遍較差，因此在溶解度測試時建議向玻璃廠家定制不同規(guī)格的帶蓋玻璃小瓶或者向恒溫振蕩儀廠家定制特殊模塊，以便直接使用1.5 ml或2 ml 玻璃質(zhì)液相進(jìn)樣瓶。另外，在整個測試過程中均應(yīng)保持容器的密封，防止溶劑揮發(fā)。

3.5 平衡時間 在進(jìn)行溶解度測試時，為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，樣品應(yīng)混合足夠時間以使體系達(dá)到固液平衡[11-12]。固體藥物在溶液中達(dá)到固液平衡的時間與樣品溶解速度、溶解度和測試時的溫度密切相關(guān)，大多數(shù)藥物的溶解度、溶解速度隨溫度升高時而增大。根據(jù)筆者經(jīng)驗(yàn)，40℃時混合8h 或20℃時混合24 h，大多數(shù)藥物能夠達(dá)到固液平衡。

3.6 HPLC 色譜條件 采用HPLC 檢測固液分離后液相的藥物濃度，HPLC 方法可以采用已有的原料藥含量檢測方法，也可以開發(fā)更高效的HPLC 方法。在方法開發(fā)時，需要注意的是，選定的檢測波長除該藥物應(yīng)有較大的紫外吸收，樣品也應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屢允顾幬餄舛缺M量控制在已驗(yàn)證的線性限度內(nèi)[13]；在固液分離時，也應(yīng)盡量保持離心管或容器小瓶密封狀態(tài)，以防止溶劑揮發(fā)，同時盡量控溫，以防止溫度變化對溶解度數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的影響。

3.7 剩余固體分析 固體藥物不同晶型的溶解度通常是不同的。溶解度測定試驗(yàn)中的剩余固體，如果已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)晶現(xiàn)象，此時的溶解度為剩余固體晶型的溶解度，不再是待測藥物晶型的溶解度[14]。因此，剩余固體采用XRPD、拉曼光譜等手段測定其晶型就顯得非常有必要[15]。

3.8 溶解度范圍 通常認(rèn)為，溶解度范圍10～100 mg/ml，特別是10～50 mg/ml 是晶型鹽型篩選、結(jié)晶工藝開發(fā)最有用的溶解度區(qū)間。因?yàn)楣腆w藥物溶解度超過100 mg/ml 時，通常溶液體系黏度較大，固體很難析出；溶解度低于10 mg/ml 時，溶液中的藥物濃度太低，不利于晶型的轉(zhuǎn)化。因此，溶解度測定時，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注此區(qū)域范圍。

綜上所述，由于藥物晶型研究中晶型鹽型篩選以及結(jié)晶工藝開發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)均依賴于大量的溶解度數(shù)據(jù)，基于此，本文綜合闡述了晶型研究中溶解度測定的相關(guān)因素，并對如何高效、快速地測定溶解度這一問題，提出相應(yīng)的建議和試驗(yàn)方案，以期為該領(lǐng)域的研究提供一定的參考。