羅文舉,李亞嬌,路雪萍,童偉楊,陳才俊,馬培杰,陳澤輝,王小利

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系,貴陽 550025;2.貴州省草業(yè)研究所,貴陽 550006;3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025;4.貴州省旱糧研究所,貴陽 550006)

【研究意義】玉米(ZeamaysL.)是一種短日照(SD)植物,普遍種植在熱帶和溫帶地區(qū),是重要的工業(yè)原料和糧飼作物來源。熱帶玉米種質(zhì)是現(xiàn)代玉米種源創(chuàng)新的重要基因源,具有豐富的遺傳多樣性、籽粒飽滿及抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]。Suwan作為常用的熱帶玉米種質(zhì)受到普遍歡迎,如在我國南方,選用自交系S37和T32組成的雜交種受到廣大種植者的喜歡[2]。但熱帶玉米種質(zhì)也并不完美,如光周期敏感性強(qiáng),在長日照條件下很難生長發(fā)育,種植條件也受到限制[3]。因此,探究在長日照條件下熱帶玉米九葉期差異蛋白的特性,對于解析玉米分子機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物開花時(shí)間是環(huán)境適應(yīng)性最重要特征之一[4-5],成花誘導(dǎo)與光周期反應(yīng)、植物開花有直接關(guān)聯(lián)。研究表明,開花時(shí)期受到很多數(shù)量性狀基因座(QTLs)的影響,包括編碼含有CCT結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)ZmCCT[6-8],而CCT結(jié)構(gòu)域基因在玉米開花時(shí)間調(diào)控中起著重要作用,如ZmCOL3主要在長日照(LD)條件下通過激活ZmCCT的表達(dá)抑制開花時(shí)間[9];在短日照條件下熱帶玉米種質(zhì)主要通過抑制ZmCCT9的順式表達(dá)促進(jìn)長日照玉米開花,長日照條件下ZmCCT9通過對抑制成花素基因表達(dá)促進(jìn)玉米開花,而下調(diào)ZCN8延遲開花時(shí)間[10]。Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)在ZmCCT中類似CACTA的轉(zhuǎn)座元件,此轉(zhuǎn)座元件不但可以減弱玉米的光周期敏感性,還可以加速玉米馴化后的傳播[12]。高媛等[13]分析2種熱帶玉米在長日照條件下的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因不同且參與了成花誘導(dǎo),導(dǎo)致開花起始的晝夜節(jié)律差異,可能是與光周期敏感性的遺傳變異有關(guān)。羅文舉等[14]研究2個(gè)熱帶玉米種質(zhì)在長日照條件下的蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn),玉米光周期敏感性由關(guān)鍵蛋白調(diào)控,差異蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能,保證玉米的正常發(fā)育。此外,其他植物的成花誘導(dǎo)分子調(diào)控機(jī)制對光周期反應(yīng)差異也備受研究人員的關(guān)注。長日照條件下擬南芥的3個(gè)突變體NF-YC3、NF-YC4和NF-YC9在開花前產(chǎn)生的總?cè)~片數(shù)量幾乎是野生型的2倍,表明NF-YC3、NF-YC4和NF-YC9基因參與了光周期依賴性開花調(diào)控[15]。ZmNF-YA3編碼玉米中的NF-YA亞基,其突變體在長日照(LD)條件下顯示出延遲開花,而在短日照條件下與野生型擬南芥開花時(shí)間相比沒有顯著差異[16]。黃忠凱[17]研究發(fā)現(xiàn),日照增長有利于芥藍(lán)根系的生長、根系活力增強(qiáng)、葉片生長速率上升及地上部分迅速生長,同時(shí)也保證了作物的正常發(fā)育。王玉卓等[18]研究發(fā)現(xiàn),短日照條件下菊花的花期提前,但株高減少、莖粗變細(xì)及平均節(jié)間長度縮小等,同時(shí)不同處理植株的農(nóng)藝性狀有很大差別。李海云等[19]發(fā)現(xiàn),菊花葉綠素含量隨日照時(shí)長的減少而下降,日照時(shí)數(shù)為8 h時(shí)菊花植株矮小瘦弱,花卉質(zhì)量較差。Shaw等[20]研究發(fā)現(xiàn),CO1和CO2在長日照條件下的野生型比雙突變體晚開花3 d,說明TaPPD1蛋白存在時(shí),CO1和CO2能夠輕微抑制開花。潘衍有[21]分析小麥TaTOC1基因(TaTOC1-A、TaTOC1-B和TaTOC1-D)的遺傳轉(zhuǎn)化和功能發(fā)現(xiàn),其在不同光照條件下,TaTOC1均能促進(jìn)小麥提前開花?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Suwan玉米種質(zhì)在育種中日益重要,但關(guān)于玉米葉片蛋白翻譯水平的表達(dá)模式研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用TMT標(biāo)記技術(shù),以熱帶玉米Suwan種質(zhì)選育的自交系光敏感NT32和光鈍感NQR273為試驗(yàn)材料,比較在長日照(16 h光照/8 h黑暗)條件下九葉期玉米相關(guān)蛋白的表達(dá)特性,通過分析長日照條件下差異蛋白的特性,進(jìn)一步了解在長日照條件下九葉期玉米的關(guān)鍵蛋白,為揭示玉米的分子機(jī)理、栽培種植及品質(zhì)提供生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 玉米(ZeamaysL.)是以Suwan玉米種質(zhì)選育的典型自交系光敏感NT32和光鈍感NQR273,其均來自Suwan群體,且均由貴州省旱糧研究所提供。其中,NT32表現(xiàn)出強(qiáng)光敏感特性,光敏指數(shù)：株高為46.35%,穗位高為50.67%;NQR273表現(xiàn)出光頓感特性,光敏指數(shù)：株高為3.82%,穗位高為22.22%。

1.1.2 試劑 lysis buffer、100 mmol/L Dissolution Buffer、375 mmol/L Iodoacetamide、200 mmol/L Reducing Reagent、TMT試劑、5% Quenching Reagent、Denaturing Reagent均為Scientific公司(上海)生產(chǎn);10 kd 超濾管(Sartorious)由Sartorious公司(上海)生產(chǎn)。

1.1.3 儀器設(shè)備 渦旋振蕩器,SCILOGEX公司(美國);真空離心濃縮儀,吉艾母科技有限公司(北京);電熱恒溫水浴鍋,光明醫(yī)療儀器有限公司(北京);離心機(jī),Eppendorf公司(德國);酶標(biāo)儀,華衛(wèi)德朗儀器有限公司(無錫);電泳系統(tǒng),bio-rad公司(美國);高通量組織研磨器,賀帆儀器有限公司(上海);超聲破碎儀,滬析實(shí)業(yè)有限公司(上海);色譜儀,普源精電科技有限公司(北京);質(zhì)譜儀,Scientific公司(美國)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 長日照處理 2022年4月20日,將光敏感NT32和光鈍感NQR273玉米種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所人工氣候室內(nèi),培養(yǎng)條件：溫度25 ℃,濕度40%～50%,光照強(qiáng)度86.4～108.0 μmol/ (m2·s),在LD條件下(16 h光照,8 h黑暗),玉米九葉期(2022年6月28日)時(shí),取長勢相近的玉米的葉尖部分(5～10) cm左右液氮速凍,3個(gè)生物學(xué)重復(fù),-80 ℃保存。

1.2.2 總蛋白提取 樣本中加入適量lysis buffer,渦旋混勻,放入3粒研磨二氧化鈦研磨珠,放入組織研磨機(jī),70 Hz,120 s。研磨樣本5000 g后離心5 min,取上清14 000 g離心30 min,取上清,分裝,留取5 μL定量,其余凍入-80 ℃。

1.2.3 蛋白酶解與TMT標(biāo)記 蛋白酶解：蛋白定量后,在每種溶液中取100 μg蛋白樣液置于離心管中;用Dissolution Buffer調(diào)制終體積100 μL。加入5 μL 200 mmol/L Reducing Reagent,在55 ℃孵育1 h。再加入5 μL 375 mmol/L Iodoacetamide溶液,避光室溫孵育30 min。轉(zhuǎn)移至10 kd超濾管,加入200 μL 100 mmol/L Dissolution Buffer,12 000 r/min離心20 min,棄掉收集管底部溶液,4次重復(fù)(pH以8.0為宜)。用100 mmol/L Dissolution Buffer補(bǔ)足體積至100 μL。再加入2.5 μL胰酶。37 ℃恒溫過夜14 h。第2天,用超純水洗3次,富集管底凍干,用100 mmol/L Dissolution Buffer復(fù)溶。TMT標(biāo)記：TMT試劑放置室溫解凍后開蓋,加入0.8 mg/管TMT試劑+41 μL無水乙醇,震蕩5 min。用41 μL TMT試劑加入100 μg (100 μL/樣)酶切好的樣本中,室溫反應(yīng)1 h。加入8 μL 5% Quenching Reagent,孵育15 min,終止反應(yīng)?；旌蠘?biāo)記后的樣品,渦旋振蕩,離心至管底。真空冷凍離心干燥,保存待用。

1.2.4 酶解肽段預(yù)分離及LC-MS/MS質(zhì)譜分析 混合標(biāo)記后的樣品用100 μL流動(dòng)相A溶解,14 000 r/min離心20 min,取上清待用。使用400 μg酶解好的BSA進(jìn)行分離,檢測系統(tǒng)情況。取100 μL準(zhǔn)備好的樣本上樣。接下來將高pH反相分離得到的組份用2%甲醇及0.1%甲酸各20 μL復(fù)溶。12 000 r/min離心10 min,吸取上清上樣。上樣體積10 μL,采取夾心法上樣。Loading Pump流速350 nL/min分離15 min。

1.2.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理 采用Uniprot Mus musculus數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理。TMT的質(zhì)譜分析是由Thermo Q-Exactive型質(zhì)譜完成,產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件采用Thermo公司的Proteome Discoverer 2.4.1.15處理。

1.2.6 蛋白質(zhì)功能注釋 差異蛋白分別進(jìn)行GO(http：//geneontology.org/)[22]功能聚類和KEGG(https：//www.kegg.jp/)[23]代謝途徑分析。差異蛋白相關(guān)作用關(guān)系分析使用String[24]數(shù)據(jù)庫實(shí)現(xiàn),采用igraph[25]構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.2.7 差異蛋白的篩選 將每個(gè)蛋白在2個(gè)樣本組(NT32與NQR273)中相互比較,再將得到的生物學(xué)測量均值的比值作為差異倍數(shù)。為了判斷差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,將每個(gè)蛋白在兩個(gè)相互比較的樣本組中的定量值進(jìn)行T檢驗(yàn)(P<0.05),蛋白量變化超過1.2倍的作為差異蛋白,組別較多時(shí)采用單因素方差分析,并計(jì)算相應(yīng)的P值,以此作為顯著性指標(biāo),并采用BH FDR對P值進(jìn)行矯正。

1.2.8 差異蛋白的富集分析 功能富集分析采用過表達(dá)分析方法,基于超幾何分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn),以GO的功能類別注釋為基礎(chǔ),計(jì)算其反應(yīng)鑒定或差異蛋白在某GO功能類別或KEGG Pathway上顯著富集程度的P值,以及基于多重假設(shè)檢驗(yàn)的FDR校正值,富集度的值則是-log(Pvalue)計(jì)算獲得。P值或FDR值越小,富集度的值越高,則富集度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異蛋白的GO富集分析

對NT32與NQR273間的差異蛋白進(jìn)行GO功能注釋,結(jié)果共有191個(gè)差異蛋白注釋到37個(gè)顯著性GO條目中(圖1)。按照生物過程、細(xì)胞組件及分子功能的功能范疇進(jìn)行分類,在生物過程中,蛋白質(zhì)廣泛參與核糖體的結(jié)構(gòu)組成(Structural constituent of ribosome,GO： 0003735)、半胱氨酸型肽酶活性過程(Cysteine-type peptidase activity,GO： 0008234)及錳離子結(jié)合(Manganese ion binding,GO： 0030145)等過程,分別占注釋差異蛋白的30.30%、12.12%和9.09%。在細(xì)胞組分(Cell component)中,蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞膜(Integral component of membrane,GO： 0016021)、細(xì)胞外區(qū)域(Extracellular region,GO： 0005576)和細(xì)胞質(zhì)大核糖體亞基(Cytosolic large ribosomal subunit,GO： 0022625),分別占注釋差異蛋白的52.27%、13.64%和9.09%。在分子功能(Molecular function)中,蛋白質(zhì)主要具備蛋白水解(Proteolysis,GO： 0006508)、翻譯過程(Translation,GO： 0006412)和防御反應(yīng)(Defense response,GO： 0006952)等活性,分別占注釋差異蛋白的21.57%、19.61%和7.84%。表明在長日照條件下,光敏感NT32玉米葉片核糖體的結(jié)構(gòu)組成和半胱氨酸型肽酶活性具有明顯變化,并對細(xì)胞膜和細(xì)胞外區(qū)域產(chǎn)生明顯影響。

2.2 差異蛋白的KEGG代謝途徑

KEGG顯著富集共有27個(gè)差異蛋白注釋到7條Pathway(圖2)。其中,上調(diào)表達(dá)13個(gè),下調(diào)表達(dá)14個(gè)。差異蛋白主要富集在次生代謝物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites,map01110)、谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism,map00480)及卟啉和葉綠素代謝(Porphyrin and chlorophyll metabolism,map00860)通路。為進(jìn)一步了解長日照對玉米葉片蛋白表達(dá)影響,對以上3條顯著富集通路進(jìn)行分析,結(jié)果表明(圖3),長日照條件下參與次生代謝物的生物合成9個(gè)蛋白中有3個(gè)為上調(diào)表達(dá)(K7VDC0、A0A0H4PB35及B4FGC2),其中NT32中的過氧化物酶(K7VDC0)在長日照條件下活性增強(qiáng),而細(xì)胞內(nèi)的氧對早期的玉米具有一定的負(fù)面影響,過多的過氧化物酶可以消除細(xì)胞內(nèi)的氧元素,保證細(xì)胞內(nèi)代謝正常,維持細(xì)胞體內(nèi)平衡,進(jìn)而對玉米葉片的生長具有保護(hù)作用;糖基轉(zhuǎn)移酶(A0A0H4PB35)在長日照條件下活性增強(qiáng),有助于調(diào)節(jié)糖醛代謝,利于細(xì)胞正常運(yùn)作及調(diào)節(jié)玉米生長代謝平衡,保證玉米正常生長。6個(gè)差異蛋白下調(diào)表達(dá)(A0A804UGK3、B4FFN2及AOA3L6E5G9等),在長日照條件下,NT32葉片中的蔗糖磷酸酶(A0A804UGK3)活性下降,催化能力減弱,糖代謝緩慢,糖的積累得到增強(qiáng),為玉米的生長提供糖類物質(zhì)(圖3-A)。參與谷胱甘肽代謝途徑的5個(gè)蛋白中有4個(gè)(A0A804QKD5、A0A3L6EMR0等)上調(diào)表達(dá),其中在長日照條件下NT32中的水解酶(A0A804QKD5)活性增強(qiáng),代謝也隨之增強(qiáng),從而加快生物合成,進(jìn)而在玉米葉片體內(nèi)中的新陳代謝起到重要作用。1個(gè)下調(diào)表達(dá)(A0A804ML65),其中未知功能蛋白(A0A804ML65)在長日照條件下活性下降,推測該蛋白具有緩解細(xì)胞代謝,調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡的功能,進(jìn)而降低谷胱甘肽代謝,維持玉米葉片體內(nèi)穩(wěn)態(tài),保證玉米正常生長(圖3-B)。有4個(gè)差異蛋白顯著富集到卟啉和葉綠素代謝途徑,其中有2個(gè)(B4FRM5和 B4FR11)為上調(diào)表達(dá),其中在長日照條件下,NT32葉片中紅色葉綠素分解代謝還原酶(B4FRM5)活性增強(qiáng),加快葉綠素代謝,維持玉米葉片體內(nèi)代謝平衡,保證玉米正常生長;2個(gè)(A0A317YL21和A0A3L6F622)為下調(diào)表達(dá),其中NT32中的葉綠素酶-1(A0A317YL21)在長日照條件下活性下降,葉綠素在葉綠素酶的作用下,分解為葉綠醇進(jìn)一步氧化后參與葉綠素代謝,對玉米的生長起到重要作用(圖3-C)。由此可見,光敏感NT32中的次生代謝物的生物合成與谷胱甘肽代謝及卟啉和葉綠素代謝在長日照條件下具有積極的反應(yīng)效果,在維持玉米生長發(fā)育和保護(hù)細(xì)胞的新陳代謝和基礎(chǔ)生理功能中具有重要意義。

1.合成素結(jié)合;2.半胱氨酸型肽酶活性過程;3.核糖-5-磷酸異構(gòu)酶活性;4.幾丁質(zhì)結(jié)合;5.幾丁質(zhì)酶活性;6.絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性;7.錳離子結(jié)合;8.核糖體的結(jié)構(gòu)組成;9.α-L-阿拉伯核苷核苷酶活性;10.核苷二磷酸激酶活性;11.金屬氨基肽酶活性;12.碳水化合物結(jié)合;13.細(xì)胞膜;14.細(xì)胞外區(qū)域;15.細(xì)胞質(zhì)大核糖體亞基;16.外質(zhì)體;17.液泡;18.呼吸小體;19.大核糖體亞基;20.錨定質(zhì)膜組分;21.蛋白水解;22.防御反應(yīng);23.多糖分解代謝過程;24.翻譯過程;25.幾丁質(zhì)分解代謝過程;26.細(xì)胞壁大分子分解代謝過程;27.戊磷酸分流,非氧化分支;28.GTP生物合成過程;29.UTP生物合成過程;30.CTP生物合成過程;31.核苷二磷酸磷酸化;32.苯丙類生物合成過程;33.細(xì)胞碳水化合物分解代謝過程;34.脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn);35.氧脂素生物合成過程;36.脂肪酸生物合成過程;37.熱響應(yīng)。1.Syntaxin binding; 2.Cysteine-type peptidase activity; 3.Ribose-5-phosphate isomerase activity; 4.Chitin binding; 5.Chitinase activity; 6.Serine-type endopeptidase inhibitor activity; 7.Manganese ion binding; 8.Structural constituent of ribosome; 9.α-L-arabinofuranosidase activity; 10.Nucleoside diphosphate kinase activity; 11.Metallo-aminopeptidase activity; 12.Carbohydrate binding; 13.Cell membrane; 14.Extracellular region; 15.Cytosolic large ribosomal subunit;16.Apoplast; 17.Vacuole;18.Respirasome; 19.Large ribosomal subunit; 20.Anchored component of plasma membrane; 21.Proteolysis; 22.Defense response; 23.Polysaccharide catabolic process; 24.Translation; 25.Chitin catabolic process; 26.Macromolecule catabolic process in cell wall ; 27.Pentose-phosphate shunt, non-oxidative branch; 28.GTP biosynthetic process; 29.UTP biosynthetic process; 30.CTP biosynthetic process; 31.Nucleoside diphosphate phosphorylation; 32.Phenylpropanoid biosynthetic process; 33.Cellular carbohydrate catabolic process; 34.Lipid transport; 35.Oxylipin biosynthetic process; 36.Fatty acid biosynthetic process; 37.Response to heat.圖1 不同光敏型玉米自交系的差異蛋白GO功能注釋(NT32較NQR273)Fig.1 GO functional annotation analysis of differentially expressed proteins in different light-sensitive maize inbred lines (NT32 compared with NQR273)

1.玉米素生物合成;2.PPAR信號通路;3.卟啉和葉綠素代謝;4.其他聚糖降解;5.谷胱甘肽代謝;6.冠狀病毒病;7.次生代謝物的生物合成;8.β-丙氨酸代謝;9.抗原加工提呈。1.Zeatin biosynthesis; 2.PPAR signaling pathway; 3.Porphyrin and chlorophyll metabolism; 4.Other glycan degradation;5.Glutathione metabolism; 6.Coronavirus disease; 7.Biosynthesis of secondary metabolites; 8.β-alanine metabolism; 9.Antigen processing and presentation.圖2 不同光敏型玉米自交系的差異蛋白KEGG代謝通路富集分析(NT32較NQR273)Fig.2 Enrichment analysis of KEGG metabolic pathway of differentially expressed protein in different light-sensitive maize inbred lines (NT32 compared with NQR273)

圖3 不同光敏型玉米自交系差異蛋白的KEGG代謝通路個(gè)體聚類(NT32較NQR273) (前3名)Fig.3 Individual cluster of KEGG metabolic pathway of differentially expressed proteins in different photosensitive maize inbred lines (NT32 compared with NQR273) (top 3)

2.3 差異蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

使用String(http：//string-db.org/)分析191個(gè)差異蛋白,篩選到304個(gè)具有相互作用的差異蛋白,并得到88 037個(gè)具有互作關(guān)系的差異蛋白。在互作網(wǎng)絡(luò)中篩選前20個(gè)Hub節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,在長日照條件下,Uncharacterized protein(A0A804ML65)、轉(zhuǎn)醛酶(Transaldolase,A0A3L6DQJ9)和60S核糖體蛋白L27a-3(60S ribosomal protein L27a-3,B6T0Z9)是NT32中互作數(shù)目最多的蛋白質(zhì)(圖4)。進(jìn)一步使用String在線軟件篩選出NT32在長日照條件下的關(guān)鍵蛋白作為后續(xù)研究的候選蛋白。酪氨酸硫酸化糖肽受體1(Tyrosine-sulfated glycopeptide receptor 1,K7US97,得分996)、60S核糖體蛋白L27a-3(60S ribosomal protein L27a-3,B6T0Z9,得分995)和60S核糖體蛋白L29(60S ribosomal protein L29,B6TL28,得分995)分別是3個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)中得分最高的候選蛋白。長日照條件下篩選到的候選蛋白主要與氨基酸合成和核糖體代謝有關(guān);此外,K7US97與氨基酸代謝有關(guān),而B6T0Z9和B6TL28是核糖體蛋白。表明氨基酸合成和核糖體代謝過程是玉米葉片在長日照條件下生長發(fā)育的重要途徑。

2.4 差異蛋白的功能注釋

在191個(gè)差異蛋白中,對有功能注釋的79個(gè)蛋白做了更深入分析并了解其詳細(xì)功能(表1)。根據(jù)差異蛋白的生物學(xué)功能分為4類：19個(gè)涉及ROS體內(nèi)平衡,7個(gè)涉及貯藏物質(zhì)保護(hù),8個(gè)涉及氨基酸代謝,45個(gè)涉及其他功能基因。其中,光敏感NT32玉米和光鈍感NQR273玉米間大部分光周期相關(guān)蛋白存在顯著差異,表達(dá)也不一致;光敏感NT32玉米的ROS清除能力增強(qiáng),貯藏物質(zhì)保護(hù)能力及氨基酸代謝下降,其他功能基因種類繁多且功能復(fù)雜,推測不同蛋白在長日照條件下發(fā)揮的功能與作用不同,并且存在一定的關(guān)聯(lián)。

3 討 論

ROS(Reactive oxygen species)平衡體系對植物生長發(fā)育及分子代謝具有重要作用[26]。本研究中,19個(gè)差異相關(guān)蛋白涉及ROS體內(nèi)平衡,其功能多樣且種類復(fù)雜,推測是每個(gè)蛋白在ROS體內(nèi)平衡中所扮演的角色不同,表達(dá)特性也存在差異。其中,ROS體內(nèi)平衡涉及的相關(guān)蛋白在NT32中相對表達(dá)量高于NQR273,說明NT32在長日照條件下需要調(diào)節(jié)更多蛋白的表達(dá)量來維持植物的正常生長。另外,ROS差異相關(guān)蛋白種類繁多,說明玉米在響應(yīng)長日照條件下,多種抗氧化酶參與此過程。由于ROS的清除功能具有差異性,所以將涉及到的差異相關(guān)蛋白進(jìn)一步歸納為兩類進(jìn)行分析,一是抗氧化酶類,主要包括過氧化物酶和多胺氧化酶等;二是抗氧化物代謝相關(guān)蛋白,主要包括脫氫抗壞血酸還原酶類(DHAR)等。Kang等[27]研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥、水稻及小麥等模式植物中,GSH和DHAR等蛋白對植物的生長發(fā)育有直接影響。因此,本研究結(jié)果推測NT32玉米葉片在長日照條件下存在多種ROS清除機(jī)制。

互作網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)蛋白;Connectivity為節(jié)點(diǎn)的顏色,表示Hub節(jié)點(diǎn)的連接度;數(shù)值越高表示連接度越高,即在功能上是重要的節(jié)點(diǎn)。Each node in the interaction network represents a protein;Connectivity is the color of the node,indicating the connectivity degree of the Hub node;The higher the value is,the higher the connectivity degree is, which means the important node of function.圖4 不同光敏型玉米自交系的差異蛋白互作(NT32較NQR273)Fig.4 Different protein interaction networks of different photosensitive maize inbred lines (NT32 compared with NQR273)

表1 不同光敏型玉米自交系差異蛋白的功能注釋(NT32較NQR273)

續(xù)表1 Continued table 1

植物的貯藏物質(zhì)包括淀粉、蛋白質(zhì)和油脂等。本研究確定了7個(gè)與貯藏物質(zhì)保護(hù)相關(guān)的差異蛋白,其不僅具有抑制貯藏蛋白的水解作用,且β-淀粉酶和蛋白酶抑制劑也可以阻止淀粉的水解和降解[28]。另外,與貯藏物質(zhì)保護(hù)相關(guān)的核苷二磷酸激酶(NDPKs)在植物中具有多功能調(diào)節(jié)的作用,與植物生長發(fā)育也有重要關(guān)系[29]。如,植物在受到NDPKs與過氧化氫介導(dǎo)的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響,葉片中NDPKs含量會逐漸增加,對植物新陳代謝及自身保護(hù)具有重要作用。本研究光敏感NT32玉米葉片的NDPKs差異顯著,對長日照的反應(yīng)與上述研究相似,表明相關(guān)的調(diào)節(jié)酶可能在光敏感NT32玉米葉片對長日照的反應(yīng)中起主要調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果表明,有8個(gè)核糖體蛋白同時(shí)受到長日照條件的影響,但變化趨勢不一致。其中,光敏感NT32玉米葉片的核糖體蛋白大部分為下調(diào),與Wu等[11]研究長日照下光敏感H496玉米中有大量的核糖體蛋白上調(diào)結(jié)果相反。推測可能原因：一是核糖體蛋白質(zhì)對晝夜節(jié)律有重要影響,導(dǎo)致NT32中核糖體蛋白下調(diào);二是長日照條件不同或試驗(yàn)材料不同所導(dǎo)致。Rogalski等[30]在煙草中已經(jīng)驗(yàn)證40S核糖體蛋白S18的功能,S18的缺失可導(dǎo)致煙草葉片發(fā)育受阻。吳倩等[31]發(fā)現(xiàn),低氮處理也可抑制60S核糖體蛋白的合成途徑。本研究結(jié)果表明,60S核糖體蛋白S18下調(diào)表達(dá),說明光敏感NT32葉片中的S18表達(dá)特性與長日照條件密切相關(guān),推測通過下調(diào)表達(dá)方式維持細(xì)胞體內(nèi)平衡,保證玉米葉片的生長,與上述研究結(jié)果相似。然而,大部分核糖體蛋白在植物中的具體功能以及調(diào)控機(jī)制尚未了解,在長日照條件中的功能,也有待進(jìn)一步研究。

本研究中45個(gè)其他功能基因被鑒定,其種類多、功能不一且生物學(xué)特性廣泛。因此可以推斷其他功能基因在長日照條件下是非常重要的代謝與調(diào)控過程。脂氧合酶對植物生長發(fā)育發(fā)揮重要作用[32-33]。本研究中脂氧合酶在光敏感NT32中顯著積累,說明脂氧合酶在該階段發(fā)揮了重要作用,且還能調(diào)節(jié)脂質(zhì)化合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),參與植物的生長發(fā)育,如植物生長與開花等。另外,鈣網(wǎng)蛋白是一種植物胞內(nèi)分子伴侶,參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及植物生長發(fā)育[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn),在長日照條件下,NT32鈣網(wǎng)蛋白下調(diào)表達(dá),推測是該條件下植物胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)處于下降趨勢,造成NT32光敏感性較NQR273弱的現(xiàn)象。此外在長日照條件下,多類家族蛋白與結(jié)構(gòu)域蛋白等均在NT32玉米九葉期顯著積累,其發(fā)揮各自功能與生物學(xué)特性,對光敏感NT32玉米葉片的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、生長發(fā)育及開花結(jié)實(shí)等過程具有積極作用,構(gòu)成了一個(gè)相互協(xié)作且多樣化的調(diào)節(jié)機(jī)制,保證了玉米的正常生長。

本研究結(jié)果與羅文舉等[14]研究長日照條件下2個(gè)熱帶玉米自交系的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果有差異,原因可能是研究材料的生長時(shí)期不同,后者為營養(yǎng)生長期(四葉期),本研究為九葉期。羅文舉等[14]分析發(fā)現(xiàn),光敏型FT32玉米葉片的ROS清除能力、蛋白代謝及相關(guān)轉(zhuǎn)移酶活性均有所下降,FT32的調(diào)控機(jī)制主要以磷酸合成酶、核糖體代謝和翻譯過程為主,組成一個(gè)相互協(xié)作的系統(tǒng),維持玉米的正常生長。本研究發(fā)現(xiàn),光敏感NT32玉米在長日照條件下ROS清除能力增強(qiáng),貯藏物質(zhì)保護(hù)能力及氨基酸代謝下降,NT32主要以氨基酸合成、核糖體代謝過程為主,構(gòu)成完整穩(wěn)定的調(diào)控系統(tǒng),保證玉米穩(wěn)定發(fā)育?？梢钥闯?在玉米的不同生長時(shí)期,差異蛋白的數(shù)量、生物學(xué)特性、調(diào)控途徑及代謝過程均有所差異。

4 結(jié) 論

光敏感NT32玉米相對于光頓感NT32在長日照條件下ROS清除能力增強(qiáng),貯藏物質(zhì)保護(hù)能力及氨基酸代謝下降,其他功能基因以不同的方式發(fā)揮作用,即在長日照條件下,光敏感NT32玉米葉片以氨基酸合成和核糖體代謝過程為主的調(diào)控系統(tǒng),維持了玉米的穩(wěn)定生長。此結(jié)果為預(yù)測光周期反應(yīng)的幾個(gè)關(guān)鍵蛋白提供了依據(jù),并為進(jìn)一步研究玉米葉片蛋白翻譯水平的表達(dá)模式相對于RNA水平的轉(zhuǎn)錄提供了基礎(chǔ)。