薛楚然，陳佳威，張瑩輝，傅曉方，趙曉寧，郜成軍，凌 翰，鄭紫淼，王文祺，楊學威

（1.中國長城葡萄酒有限公司，河北 張家口 075400；2.圣利亞酒莊有限公司，智利第六地區(qū) 316000）

龍眼葡萄是我國最具特色和代表性的栽培品種，有近千年的栽培歷史[1]，其果實呈紫紅色或深玫瑰紅色，酸甜可口，既是鮮食葡萄佳品也是釀造高級干白葡萄酒的主要原料，被郭沫若先生譽為“北國明珠”[2]，在我國山東、山西、河南、河北、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古等地具有廣泛的栽培，由于長期的栽培馴化，河北懷涿盆地已成為龍眼葡萄的最適栽培區(qū)之一[3]。

發(fā)酵前處理指的是酒精發(fā)酵前對于葡萄原料的各種處理工藝，包括除梗破碎處理、壓榨處理、帶皮浸漬、果汁澄清等，這些工藝對葡萄酒發(fā)酵及香氣物質的呈現(xiàn)有重要作用?，F(xiàn)代學者對葡萄酒發(fā)酵前處理研究著重于干紅葡萄酒，通過調整原料的破碎程度、浸漬方式、時間、溫度，得出最佳的釀造工藝條件。張志龍[4]通過研究浸漬方式對黑比諾干紅葡萄酒揮發(fā)性風味物質的影響得出了冷浸漬處理對黑比諾干紅葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的影響較大。陳嘉[5]以玫瑰香葡萄為原料，通過研究不同破碎程度對干紅葡萄酒風味的影響，結果表明破碎程度為70%的樣品口感最好。王華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，采用熱浸漬處理的葡萄酒多了3-羥基丁酸乙酯、丁二酸二乙酯和癸酸乙酯3種新的香氣構成物，這3種物質均具有愉快的水果香氣，可使葡萄酒的果香更加濃郁。以上研究表明，發(fā)酵前處理于改善葡萄酒品質具有積極作用，而白葡萄品種多為澄清汁發(fā)酵，其有效的前處理工藝主要集中于澄清工藝的調整。

基于龍眼葡萄品種特性，其釀造的干白葡萄酒通常果香較弱、酒體偏薄，如何提升龍眼干白葡萄酒的感官品質（風味濃郁度、復雜度等），是亟待解決的問題之一。董志剛等[7]研究了煉白濃縮工藝對龍眼葡萄酒品質及揮發(fā)性香氣成分的影響，結果表明，煉白-3葡萄酒中揮發(fā)酸含量最低、香氣成分含量最高，且含量超過閾值的6種酯類物質、具有水果香和植物香的香氣活力總值均最高。濃縮工藝的本質是減少發(fā)酵葡萄汁的水分、提高內(nèi)容物濃度，從而提升最終發(fā)酵酒的有效物質含量，但該方法的加熱過程會對葡萄汁造成不可逆的香氣損失，失去部分新鮮果香。本研究在龍眼葡萄前處理過程中，通過提升澄清汁中的果肉含量，提升發(fā)酵果汁中的各類有效物質含量，采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro extraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法，對比研究不同葡萄果肉、澄清汁比例發(fā)酵釀制葡萄酒的理化指標、香氣成分和感官評分，為改良龍眼干白葡萄酒的釀造工藝、釀造高品質龍眼干白葡萄酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼葡萄：采收于中國長城葡萄酒有限公司農(nóng)戶合作基地；果膠酶（酶活6 700 PGNU/g）：法國Laffort公司；揮發(fā)性物質標準品（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；4-甲基-2-戊醇、乙醇（均為色譜純）：美國Thermo Fisher Scientific公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Sigma-Aldrich公司；HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 μm×0.25 mm）：美國Agilent Technologies公司；6890N氣相色譜-質譜（GC-MS）聯(lián)用儀：安捷倫科技（中國）有限公司；100 L不銹鋼發(fā)酵罐：石家莊恒昌食品包裝機械有限公司；Siprem VS 20入氣囊壓榨機：意大利西博梅國際股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 龍眼干白葡萄酒的發(fā)酵工藝流程及操作要點

龍眼葡萄采收→人工分選→除梗破碎→添加果膠酶→壓榨出汁→入罐澄清→按不同果肉含量處理將葡萄汁分別分離至不銹鋼罐→添加酵母→酒精發(fā)酵→龍眼干白葡萄原酒

龍眼葡萄采收、人工分選：去除生青果、霉爛果、干枝干葉及其他雜質。

除梗破碎、壓榨出汁：入壓榨機時均勻添加果膠酶，添加量為（20±5）g/t葡萄。

入罐澄清：壓榨后的果汁入罐時均勻添加焦亞硫酸鉀，按照總SO230～50 mg/L添加；澄清溫度10～12 ℃，澄清時間24～48 h。

添加酵母：以150 g/t葡萄汁的添加量加入VL2酵母。

酒精發(fā)酵：發(fā)酵溫度14～16 ℃，總糖低于4 g/L時認定為酒精發(fā)酵結束即為龍眼干白葡萄原酒。

1.3.2 不同果肉含量葡萄汁的處理方式。

澄清處理的葡萄汁濁度到達150～200 NTU時進行果汁分離，澄清汁分離后剩余的部分即為果肉，每罐澄清汁和果肉的比例固定為80%∶20%，以確保每罐果肉的含汁量一致。根據(jù)表1進行果肉含量調整后，進行酒精發(fā)酵。

表1 不同果肉含量龍眼葡萄汁實驗處理Table 1 Experimental treatment of Longyan grape juice with different pulp contents

1.3.3 酒精發(fā)酵曲線繪制

葡萄汁在添加釀酒酵母、啟動酒精發(fā)酵后，每12 h監(jiān)測一次發(fā)酵溫度及葡萄汁比重，直至比重降低至0.996以下，檢測發(fā)酵原酒糖度不高于4 g/L，則判定酒精發(fā)酵結束。以不同果肉含量葡萄汁的比重變化情況繪制的曲線即為酒精發(fā)酵曲線。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質分析方法

前處理及SPME條件：取7.5mL酒樣和1g氯化鈉加25μL 300 mg/mL 3-辛醇（內(nèi)標物）置于20 mL滅菌小瓶中，迅速用聚四氟乙烯-硅酮隔膜密封小瓶，并在40 ℃平衡15 min，將在270 ℃預處理1 h的DVB/CAR/PDMS萃取頭纖維插入小瓶的頂部空間，持續(xù)加熱提取40 min。將萃取頭在GC/MS進樣口解吸，解吸溫度230 ℃。

GC-MS條件：采用HP-INNOWAX色譜柱（60m×0.25mm，0.25 μm）分離并鑒定揮發(fā)性風味物質。柱溫箱升溫程序為50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至80 ℃，然后以5 ℃/min升溫至230 ℃保持6 min。載氣為高純氦氣（He）（純度＞99.999%），流速1 mL/min，采用不分流模式。電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，質譜掃描區(qū)間為20～450 m/z，并在自動調諧條件下在選擇性離子模式下操作。溶劑延遲時間6.0 min。

定性定量分析：采用與標準香氣成分保留時間（reten tion time，RT）對比的方法結合美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）14標準譜庫檢索比對結果進行揮發(fā)性香氣化合物定性分析。利用標準品制作標準曲線，通過標準曲線進行定量。所有實驗進行3次重復。

1.3.5 理化指標分析方法

龍眼葡萄、葡萄汁及葡萄酒中總糖、總酸、揮發(fā)酸、總硫、游離硫、干浸出物、pH值等的測定：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用試驗方法》[8]進行，酒精度的檢測：參照GB/T 5009.225—2023《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》[9]進行。

1.3.6 感官評價

以《葡萄酒中國鑒評體系》為評分基準，組織10位葡萄酒專業(yè)品鑒人員，從外觀（10分）、香氣（30分）、口感（50分）、整體（10分）四個方面評價龍眼干白葡萄酒的感官特征，每款干白葡萄酒滿分100分，結果取平均分，具體評分標準見表2。

表2 龍眼干白葡萄酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of Longyan dry white wine

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用軟件SPSS Statistics 24.0進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），使用Microsoft Excel 2013進行制圖。

2 結果與分析

2.1 不同果肉含量的龍眼干白葡萄酒發(fā)酵曲線

不同果肉含量的葡萄汁酒精發(fā)酵期間比重變化見圖1。由圖1可知，在相同的發(fā)酵條件下，各處理葡萄汁發(fā)酵曲線均呈現(xiàn)“S”型的下降趨勢，且果肉含量越高，發(fā)酵速率越快，即發(fā)酵結束時間越短。對照組（100%澄清汁）在發(fā)酵啟動20 d時完成酒精發(fā)酵，而R1、R2和R3處理的發(fā)酵時間分別為18 d、16.5 d和16 d，即葡萄汁果肉含量30%、50%和80%對比果肉含量0（100%澄清汁）的酒精發(fā)酵速率分別提升了10%、17.5%和20%。這可能是由于葡萄汁中果肉含量越高，其營養(yǎng)物質含量越高，使得發(fā)酵汁中酵母生物量更大，發(fā)酵速率更快[10]。本實驗表明，龍眼葡萄汁中果肉含量與發(fā)酵速率成正相關，增加葡萄汁中果肉含量可以顯著提升發(fā)酵速率。

圖1 不同果肉含量的葡萄汁發(fā)酵釀制龍眼干白葡萄酒發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curves of Longyan dry white wine fermented by grape juice with different pulp contents

2.2 不同果肉含量發(fā)酵龍眼干白葡萄酒的理化指標對比

不同果肉含量葡萄汁發(fā)酵釀制的龍眼干白葡萄酒，經(jīng)過澄清、分離，在不銹鋼罐滿罐貯存5個月，并于次年春季倒酒后測定理化指標，結果見表3。由表3可知，各處理組在酒精度、總糖、總酸和揮發(fā)酸含量上無顯著差異（P＞0.05），龍眼干白葡萄酒中干浸出物含量有顯著差異并與發(fā)酵葡萄汁中果肉含量呈正比，干浸出物含量由17.10 g/L增加至19.45 g/L。葡萄酒中干浸出物主要包括一些游離酸、鹽類、單寧、色素、果膠等物質[11]，這些物質對葡萄酒馥郁口感的形成有重要作用，因此干浸出物的含量是考核葡萄酒質量的一項重要指標[12]。本實驗表明，發(fā)酵葡萄汁中果肉含量對于龍眼干白葡萄酒中酒精度、總糖、總酸和揮發(fā)酸含量無顯著性影響，果肉含量增加可以顯著提升龍眼干白葡萄酒中干浸出物含量，進而提升葡萄酒整體質量。

表3 不同果肉含量葡萄汁發(fā)酵釀制龍眼干白葡萄酒的理化指標Table 3 Physicochemical indexes of Longyan dry white wine fermented by grape juice with different pulp contents

2.3 不同果肉含量發(fā)酵龍眼干白葡萄酒的揮發(fā)性香氣物質對比

葡萄酒中的揮發(fā)性香氣成分是葡萄酒品質的重要組成部分，主要包括酯類、醇類、萜烯類、酚類和酮類等[13]。不同果肉含量的葡萄汁發(fā)酵釀制的龍眼干白葡萄酒的揮發(fā)性風味物質含量結果見表4。由表4可知，各處理龍眼干白葡萄酒共檢測出43種揮發(fā)性香氣物質，其中，對照組檢測出35種物質，R1處理組檢測出43種物質，R2處理組檢測出34種物質，R3處理組檢測出37種物質。43種物質中，共檢測出14種乙酯類物質、11種其他酯類物質、9種醇類物質、4種酸類物質、4種萜烯類物質和1種醛酮類物質。

表4 不同果肉含量葡萄汁發(fā)酵釀制的龍眼干白葡萄酒的揮發(fā)性風味物質含量Table 4 Volatile flavor substance contents of Longyan dry white wine fermented by grape juice with different pulp contents

2.3.1 酯類

葡萄酒中的酯類物質主要成分是在酒精發(fā)酵過程中由酵母合成的代謝產(chǎn)物[14]，是葡萄酒香氣中果香的主要來源[15]。本實驗共檢測出酯類物質25種，其中乙酯類物質13種。己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯等13種乙酯類物質在R1處理組中的含量顯著高于其他組（P＜0.05），其中己酸乙酯、癸酸乙酯能夠帶來檸檬、蘋果等水果的香氣，辛酸乙酯能為葡萄酒帶來花類香氣。在其他酯類物質中乙酸異戊酯、乙酸己酯等8種物質在R1處理組中的含量顯著高于其他組（P＜0.05）。果肉含量30%、50%和80%的龍眼葡萄汁發(fā)酵釀制的干白葡萄酒，其酯類物質的含量較對照組分別提升了251%、75%和59%。實驗表明，含有果肉的葡萄汁發(fā)酵干白葡萄酒，其酯類物質含量能夠得到顯著提升。

2.3.2 醇類

高級醇主要來源于酵母發(fā)酵和氨基酸轉化，葡萄酒中如果含有過高或過低的高級醇則會對葡萄酒香氣和口感產(chǎn)生不良影響[16]。一般情況下，當葡萄酒中高級醇含量＜300 mg/L時，能突出葡萄酒的愉悅香氣；高級醇含量＞400 mg/L時，會給葡萄酒帶來負面影響[17]。對照組高級醇總含量1.38 mg/L，R1處理組高級醇總含量9 mg/L，R2處理組高級醇總含量1.19 mg/L，R3處理組高級醇總含量1.15 mg/L。本實驗檢測到的醇類物質中，1-己醇和異丁醇等4種物質在R3處理組中含量最高，異戊醇和2,3-丁二醇等5種物質在R1處理組中含量最高，苯乙醇在R1、R2和R3處理組中的含量無顯著性差異（P＞0.05），均顯著高于對照組（P＜0.05），該物質可以為葡萄酒貢獻花果香和蜂蜜味[18]。本實驗表明，用含有果肉的葡萄汁進行發(fā)酵對于龍眼干白葡萄酒中的醇類物質含量有顯著性影響。

2.3.3 脂肪酸類

葡萄酒中酸類物質主要來源于發(fā)酵副產(chǎn)物和葡萄漿果[19]，其含量由葡萄汁的營養(yǎng)水平、發(fā)酵環(huán)境條件和酵母決定[20]。本實驗共檢測出酸類物質4種，分別為乙酸、己酸、辛酸和正癸酸，4種物質在R1處理組的含量顯著高于其他處理組（P＜0.05），對比對照組中的含量分別提升了442%、244%、275%和382%。乙酸、己酸、辛酸、正癸酸均為低級脂肪酸，能為葡萄酒帶來脂肪味，對葡萄酒的整體結構和風味具有重要作用[21]。本實驗表明，果肉含量30%的龍眼葡萄汁發(fā)酵釀制的干白葡萄酒，其脂肪酸類物質的含量得到了顯著提升。

2.3.4 萜烯類

萜烯類物質主要來自于釀酒葡萄果實，是葡萄果實發(fā)育過程中產(chǎn)生的一類重要的次生代謝產(chǎn)物，是葡萄酒中花果香的重要來源[22]，本實驗共檢測出萜烯類物質4種，分別為苯乙烯、（-）-4-萜品醇、香茅醇和2,6-二甲基-6-辛二烯，各物質在R1處理組的含量均高于其他組別，其中香茅醇能為葡萄酒帶來丁香花、薔薇花香[23]。

2.3.5 不同果肉含量發(fā)酵龍眼干白葡萄酒揮發(fā)性風味物質

含量分析

不同果肉含量發(fā)酵釀制的龍眼干白葡萄酒揮發(fā)性風味物質分類含量結果見圖2。由圖2可知，R1處理組中各類風味物質含量總和均為最高，說明“70%澄清汁+30%果肉”的處理形成的風味物質種類和總量都顯著高于其他處理組（P＜0.05）；R2、R3處理組中乙酯類、其他酯類、酸類和萜烯類物質含量均高于對照組，說明含果肉的葡萄汁相比于100%澄清汁發(fā)酵能夠提升風味物質總體含量。

圖2 不同果肉含量葡萄汁發(fā)酵釀制的龍眼干白葡萄酒揮發(fā)性風味物質分類及含量Fig.2 Classification and contents of volatile flavor substances in Longyan dry white wine fermented by grape juice with different pulp contents

2.4 關鍵揮發(fā)性香氣物質的確定

氣味活力值（odour activity value，OAV）由香氣物質的含量除以相應閾值計算而得，OAV能夠更為準確地確定各種香氣物質對葡萄酒的香氣特征作用大小[24]。有關研究表明，香氣物質的OAV＞1，則其對葡萄酒的風味特征的貢獻作用明顯，且OAV越大對香氣特征貢獻越顯著，而OAV＜1的物質對葡萄酒的香氣僅起到協(xié)助作用[25]。

不同果肉含量發(fā)酵釀制的龍眼干白葡萄酒揮發(fā)性風味物質分類含量見表5。由表5可知，對照組、R1處理組、R2處理組和R3處理組龍眼干白葡萄酒中OAV＞1的關鍵香氣化合物分別有3、6、4和4種。對照組中OAV＞1的關鍵香氣化合物有己酸乙酯、癸酸乙酯和乙酸異戊酯，主要香氣為香蕉、青蘋果和脂肪味。R1處理組中關鍵香氣化合物有己酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸，特征香氣為香蕉、青蘋果、溫柏、花香、奶酪、脂肪等，香氣復雜度較高；R2處理組的關鍵香氣化合物有己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸異戊酯，對應香氣為香蕉、青蘋果、花香等。R3處理組的關鍵香氣化合物為己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸異戊酯，對應特征香氣與R2處理組一致。綜上，各處理龍眼干白葡萄酒共有的特征香氣為香蕉、青蘋果；以“70%澄清汁+30%果肉”進行發(fā)酵釀制的龍眼干白葡萄酒關鍵香氣化合物種類最高、OAV總值最高，且具有獨特的溫柏、奶酪和脂肪等香氣，說明該處理對于提升干白葡萄酒的香氣濃郁度和復雜度有顯著影響。

表5 不同果肉含量的葡萄汁發(fā)酵釀制龍眼干白葡萄酒中關鍵香氣化合物的氣味活力值Table 5 Odor activity values of key aroma compounds in Longan dry white wine fermented by grape juice with different pulp contents

2.5 不同果肉含量發(fā)酵龍眼干白葡萄酒感官品質對比

春季倒酒后，對于不同果肉含量處理的龍眼干白葡萄酒進行感官品質評分，結果見表6。由表6可知，感官評分總分最高為R1處理組（95.9分），最低分為R3處理組（87.6分）。該結果與2.3所示的風味物質種類及含量結果相符。本研究表明，以70%澄清汁+30%果肉進行發(fā)酵，可以增加干白葡萄酒的香氣復雜度、酒體圓潤度和回味長度，但果肉含量過高時，外觀會出現(xiàn)渾濁狀態(tài)，并帶有一定程度的還原味。

表6 不同果肉含量葡萄汁發(fā)酵釀制龍眼干白葡萄酒的感官評分Table 6 Sensory evaluation score of fermented Longyan dry white wine with different pulp contents

3 結論

本研究通過控制發(fā)酵果汁中不同果肉含量，開展龍眼葡萄干白發(fā)酵實驗，得到結論如下：在其他發(fā)酵條件相同情況下，葡萄汁中果肉含量越高，酒精發(fā)酵速率越快，果肉含量0%、30%、50%和80%的龍眼葡萄汁酒精發(fā)酵時間分別為20 d、18 d、16.5 d和16 d。干浸出物含量與發(fā)酵葡萄汁中果肉含量呈正比，干浸出物含量由17.10 g/L增長到19.45 g/L。帶果肉葡萄汁發(fā)酵的龍眼干白葡萄酒，其酯類、酸類和萜烯類物質含量均顯著高于對照組（P＜0.05）；對照組、R1、R2和R3處理組龍眼干白葡萄酒中OAV＞1的關鍵香氣化合物分別有3、6、4和4種，OAV總和分別為16.92、75.86、32.75和30.62；R1處理組（70%澄清汁+30%果肉）發(fā)酵的龍眼干白葡萄酒，其風味物質種類、含量以及感官評分均為最高，并具有更為豐富的特征香氣類型，如花香、脂肪、奶酪等；至于果肉含量過高時，葡萄酒中會產(chǎn)生還原的不良氣味，還需進一步的實驗進行探究。