姚 芳，吳 平，劉 萍*，王力欣

（江蘇農牧科技職業(yè)學院 食品科技學院，江蘇 泰州 225300）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）于2018年被列入我國新食品原料，其果實含有豐富的多酚、花青素、維生素、有機酸、多糖等多種活性成分[1-3]。研究表明，黑果腺肋花楸具有抗氧化[4]、抑菌抗炎[5-6]、調節(jié)大腦功能[7]、降血壓[8]和降血糖[9]等功效，因而受到學者和食品從業(yè)者的廣泛關注[10]。黑果腺肋花楸的多酚含量是藍莓的5倍，抗氧化活性是蔓越莓的9倍，是已知植物中含量最高的[11]，但由于黑果腺肋花楸的單寧含量較高，口感酸澀，故鮮食不易被消費者接受，因此將花楸果進行發(fā)酵可改善其食用品質[12]。發(fā)酵制果酒是花楸加工的一個主要方向，可豐富花楸風味，改善口感，提高食用價值。WITKOWSKA A M等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黑果腺肋花楸果酒的抗氧化能力強于紅葡萄酒、黑加侖酒、醋栗果酒。

本研究以黑果腺肋花楸果為原料進行果酒釀造，以感官評分為評價指標，通過單因素和響應面試驗對黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并對果酒的品質、多酚含量、花色苷含量及抗氧化活性進行研究，旨在研制出風味佳、抗氧化活性強的黑果腺肋花楸果酒，為花楸資源的深加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸果：產地遼寧大連；果膠酶（50 000 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）：河南萬邦實業(yè)有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：河南禾興生物科技有限公司；檸檬酸（分析純）：廣州利成實業(yè)有限公司；安琪果酒專用酵母（RW）：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：上海市糖業(yè)煙酒有限公司；沒食子酸（純度≥99%）、2,2'-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazo line-6-sulphonate），ABTS）（純度≥98%）：北京沃凱生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度≥98%）：美國Sigma公司；福林酚試劑、過硫酸鉀、甲醇（99.5%）、硫酸亞鐵、水楊酸、抗壞血酸等試劑（分析純）：國藥集團。

1.2 儀器與設備

XY600-2C型電子秤：常州市幸運電子設備有限公司；HH-S8型水浴鍋：金壇市全城國盛實驗儀器廠；DF-101SE型磁力攪拌器：南京予華儀器有限責任公司；HT 512ATC型酒精度折射儀：福安普和電子有限公司；1001-00A型恒溫培養(yǎng)箱：佛山勁申機電設備有限公司；PHS-3E酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；WZS 32手持折光儀糖度計：上海儀電物理光學儀器有限公司；BT25S型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG9101-2S型電熱恒溫干燥箱：上海精科實業(yè)有限公司；T6-紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；PRIMOR型高速冷凍離心機：美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵工藝流程與操作要點

操作要點：

原料預處理：挑選無霉變、完好的黑果腺肋花楸果，洗凈、晾干、直接打漿。

酶解：取黑果腺肋花楸果漿1 000 g，加入0.2%的果膠酶和0.2%的纖維素酶，攪拌均勻，50 ℃酶解2 h，再90 ℃滅酶5 min，冷卻至室溫。

添加偏重亞硫酸鉀：使用100目尼龍網濾布過濾，過濾出的果汁直接添加80 mg/L偏重亞硫酸鉀，攪拌溶解。

成分調整：使用檸檬酸將黑果腺肋花楸果汁pH值調節(jié)至3.0～5.0，補加一定量白砂糖調節(jié)黑果腺肋花楸果汁的初始糖度。

酵母發(fā)酵：將11 g安琪果酒酵母RW加入110 mL由無菌水配制的50 g/L糖水中，37 ℃活化30 min，以一定的比例接種至黑果腺肋花楸果汁中，25 ℃恒溫發(fā)酵一定時間。

陳釀、過濾：使用300目尼龍網濾布過濾，4 ℃陳釀10 d后即為黑果腺肋花楸果酒成品。

1.3.2 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

在預試驗基礎上，設定果膠酶的添加量0.2%、纖維素酶的添加量0.2%、偏重亞硫酸鉀的添加量80 mg/L、發(fā)酵溫度25 ℃為固定水平，以黑果腺肋花楸果酒的感官評分、酒精度為評價指標，分別考察酵母接種量（0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%）、初始糖度（18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx）、初始pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、發(fā)酵時間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）對黑果腺肋花楸果酒品質的影響。

1.3.3 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以釀酒酵母接種量（A）、初始糖度（B）、初始pH值（C）和發(fā)酵時間（D）為影響因素，以感官評分為響應值，設計4因素3水平響應面試驗，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface method for fermentation technology optimization of A. melanocarpa fruit wine

1.3.4 測定方法

黑果腺肋花楸果酒的感官評價分析：參考魏春雨[14]的方法，根據(jù)NY/T 1508—2017《綠色食品 果酒》，選取具有一定果酒感官評定經驗的10人組成評價小組，對黑果腺肋花楸果酒從外觀、風格、香氣、滋味4個方面進行打分，取10人平均分，滿分100分。感官評分標準見表2。

表2 黑果腺肋花楸果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of A. melanocarpa fruit wine

DPPH自由基清除率：參考金海炎等[15]的方法進行測定；ABTS+自由基清除率：參考吳雙從等[16]的方法進行測定；羥自由基清除率：參考YANG H等[17]的方法進行測定；多酚含量：參照姚芳等[18]的方法采用福林酚法進行測定；花青素含量：參照魏春雨[14]的方法采用pH示差法進行測定。

酒精度：酒精度折射儀進行測定；糖度：手持式糖度儀進行測定；總糖、總酸、揮發(fā)酸含量：分別參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法、電位滴定法和蒸餾法進行測定；菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》進行測定；大腸菌群：參照國標GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》進行測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.06和Excel 2019進行數(shù)據(jù)分析，利用SPSS 23.0軟件進行顯著性分析。每個數(shù)據(jù)重復測定3次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗結果

2.1.1 釀酒酵母接種量對黑果腺肋花楸果酒品質的影響

釀酒酵母接種量對黑果腺肋花楸果酒品質的影響見圖1。

圖1 釀酒酵母接種量對黑果腺肋花楸果酒品質的影響Fig.1 Effect of Saccharomyces cerevisiae inoculum on the quality of A. melanocarpa fruit wine

由圖1可知，隨著釀酒酵母接種量的增加，黑果腺肋花楸果酒感官評分、酒精度均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。酵母接種量較低時，因發(fā)酵不完全而產生的乙醇較少，酒香也不明顯，故感官評分也低；而酵母接種量過大時，酵母菌的自身繁殖消耗了大量的營養(yǎng)物質，增加了產酸量，會抑制酵母菌的生長，生成的酒精量減少，同時破壞了果酒的風味[19]，感官評分也降低。酵母接種量為1.0%時，黑果腺肋花楸果酒的感官評分、酒精度均達到最高，分別為84.2分、9.34%vol；且顯著高于其他接種量（P＜0.05）。此時，黑果腺肋花楸果酒的品質達到最佳，故選擇較適的釀酒酵母接種量為1.0%。

2.1.2 初始糖度對黑果腺肋花楸果酒品質的影響

初始糖度對黑果腺肋花楸果酒品質的影響見圖2。

圖2 初始糖度對黑果腺肋花楸果酒品質的影響Fig.2 Effect of different initial sugar content on the quality of A. melanocarpa fruit wine

由圖2可知，隨著初始糖度的增加，黑果腺肋花楸果酒感官評分、酒精度均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。糖類是酵母發(fā)酵所需的重要營養(yǎng)物質，適量的糖會促進酵母的發(fā)酵；初始糖度較低時，酵母發(fā)酵不充分，不利于酒精度和風味的形成，酒體單薄，感官評分低[19]。但初始糖度過高時，由于高滲透作用會抑制酵母菌的生長[20]，導致酒精度下降，果酒甜度過高，破壞了果酒的糖酸比，感官評分下降。初始糖度為22°Bx時，黑果腺肋花楸果酒的感官評分、酒精度均達到最高，分別為85.8分、9.42%vol；且顯著高于其他初始糖度（P＜0.05）。故選擇較適的初始糖度為22°Bx。

2.1.3 初始pH值對黑果腺肋花楸果酒品質的影響

初始pH值對黑果腺肋花楸果酒品質的影響見圖3。

圖3 初始pH值對黑果腺肋花楸果酒品質的影響Fig.3 Effect of initial pH value on the quality of A. melanocarpa fruit wine

由圖3可知，隨著初始pH值的增加，黑果腺肋花楸果酒感官評分、酒精度均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。酵母菌有其生長的最適pH值，過低或過高的pH值會影響酵母菌的生長和發(fā)酵產物的生成。當初始pH值過低或過高時，酵母菌生長緩慢，酒精度下降，發(fā)酵產物減少，果酒的風味較平淡，感官評分下降[21]。初始pH值為4.5時，黑果腺肋花楸果酒的感官評分、酒精度均為達到最高，分別為84.8分、9.48%vol。故選擇較適的初始pH值為4.5。

2.1.4 發(fā)酵時間對黑果腺肋花楸果酒品質的影響

發(fā)酵時間對黑果腺肋花楸果酒品質的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對黑果腺肋花楸果酒品質的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of A. melanocarpa fruit wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，黑果腺肋花楸果酒感官評分呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，酒精度呈先上升后平緩的趨勢。當發(fā)酵時間短時，花楸發(fā)酵未完全，果酒的酒精度低，酒味偏淡，酒體中殘?zhí)呛扛撸诟衅?；而當發(fā)酵時間過長時，果酒中殘?zhí)呛科?，口感偏酸，酒體不協(xié)調，酒精度變化差異不顯著，與王娟等[22]有關拐棗山楂果酒發(fā)酵的研究結果相似。發(fā)酵時間為7 d時，果酒的感官評分最高，且顯著高于其他發(fā)酵時間（P＜0.05），酒精度也達到了最大值，分別為86.5分、9.40%vol。故選擇較適的發(fā)酵時間為7 d。

2.2 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 響應面試驗分析

黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化的響應面試驗分析見表3。

表3 黑果腺肋花楸果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for optimization of fermentation conditions of A. melanocarpa fruit wine

利用Design-Expert 8.06數(shù)據(jù)分析軟件對表3的結果進行多元回歸擬合，得到回歸模型的二次多項方程：

Y=87.14+1.18A-0.58B-0.54C-0.98D-1.0AB-0.68AC-0.7AD+

0.6BC+0.75BD+2.35CD-2.98A2-3.92B2-3.73C2-1.37D2

2.2.2 黑果腺肋花楸果酒感官評分回歸模型的方差分析

以黑果腺肋花楸果酒感官評分為考察指標的模型及回歸系數(shù)進行回歸分析，結果見表4。

表4 感官評分回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model of sensory score

從表4可以看出，黑果腺肋花楸果酒感官評分模型的F值為83.09，該模型極顯著（P＜0.01）。失擬項P=0.072 2＞0.05不顯著，表明響應面模型有效。決定系數(shù)R2值為0.988 1，校正決定系數(shù)R2Adj為0.976 2，預測決定系數(shù)R2Pred=0.935 3，說明模型的擬合效果好、數(shù)據(jù)可信度高，預測性好?；貧w方程中一次項A、B、C、D，交互項AB、AD、BD、CD和二次項A2、B2、C2、D2對黑果腺肋花楸果酒感官評分有極顯著影響（P＜0.01），交互項AC和BC對黑果腺肋花楸果酒感官評分有顯著影響（P＜0.05）。

2.2.3 響應面作用的交互作用分析

各因素交互作用對黑果腺肋花楸果酒感官評分影響的響應曲面及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用對黑果腺肋花楸果酒感官評分響應曲面和等高線Fig.5 Response surface plot and contour lines effect of interaction between various factors on the sensory score of A. melanocarpa fruit wine

由圖5可知，AB、AD、BD、CD交互作用的響應面圖中等高線密度分布不均勻，曲面陡峭，表明AB、AD、BD、CD交互作用強，對黑果腺肋花楸果酒的感官評分影響極顯著（P＜0.01），與表4的方差分析結果一致。以AB交互作用的響應面圖為例，當初始糖度（B）一定時，隨著酵母接種量（A）的增加，黑果腺肋花楸果酒感官評分呈現(xiàn)出先增加，達到峰值后再顯著下降，響應面曲面的變化十分陡峭。同時，從等高線的疏密程度來看，酵母接種量（A）對果酒的感官評分的影響高于初始糖度（B）。由此可知，各因素對黑果腺肋花楸果酒感官評分的影響順序為酵母接種量＞初始糖度＞發(fā)酵時間＞初始pH值。

2.3 驗證試驗

經Design-Expert 23.0軟件分析得到最優(yōu)發(fā)酵條件為酵母接種量1.05%、初始糖度21.77 °Bx、初始pH值4.47、發(fā)酵時間6.33 d。在此條件下，得黑果腺肋花楸果酒感官評分預測值為87.6分。考慮實際操作的便利性，將該條件修正為酵母接種量1.0%、初始糖度21.8 °Bx、初始pH值4.5、發(fā)酵時間6.4 d，進行3次平行驗證試驗，測得黑果腺肋花楸果酒感官評分實際值為（87.2±1.3）分，與黑果腺肋花楸果酒感官評分的預測值相差不大。

2.4 黑果腺肋花楸果酒成品的檢測結果

最佳發(fā)酵工藝下釀造出的黑果腺肋花楸果酒色澤呈深紅色有光澤，澄清無沉淀，花楸果香濃郁、酸甜協(xié)調，酒體豐滿，風格優(yōu)雅，感官評分達87.2分；酒精度、總酸、揮發(fā)酸、總糖分別為9.56%vol、7.62 g/L、0.18 g/L、8.15 g/L，理化和微生物指標均符合NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》標準。

2.5 黑果腺肋花楸果酒的抗氧化活性分析

對黑果腺肋花楸果酒的總多酚、花青素及抗氧化活性進行檢測，結果見圖6和圖7。

圖6 黑果腺肋花楸果汁及果酒的總多酚和花青素的含量Fig.6 Total polyphenols and anthocyanins contents of A. melanocarpa juice and fruit wine

圖7 黑果腺肋花楸果汁及果酒的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of A. melanocarpa juice and fruit wine

由圖6和圖7可知，與黑果腺肋花楸果汁相比，發(fā)酵后的果酒中總多酚含量3 617.3 mg/L、花青素含量697.6 mg/L、DPPH自由基清除率93.8%、ABTS自由基清除率88.4%和羥自由基清除率76.5%，均顯著增加（P＜0.05），與WILKOWSKA A等[23]的研究結果相似。黑果腺肋花楸果酒的DPPH、ABTS自由基清除率與0.3%維生素C（vitamin C，VC）的測定結果無顯著性差異（P＞0.05），羥自由基清除率顯著低于0.3%VC（P＜0.05）。說明在發(fā)酵過程中，酵母菌產生的各種酶系作用可使大分子酚類物質和花青素轉化成可溶性的小分子物質，黑果腺肋花楸果實和果皮中的總多酚和花青素等抗氧化物質能更有效的釋放溶出[24]，同時發(fā)酵產生的酒精也有助于酚類物質和花青素的溶出[25]，故果酒中抗氧化活性成分含量升高，抗氧化活性顯著提升。

3 結論

本研究采用單因素和響應面試驗對黑果腺肋花楸果酒的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝條件為釀酒酵母接種量1.0%、初始糖度21.8 °Bx、初始pH值4.5、發(fā)酵時間6.4 d，所制得的果酒呈深紅色有光澤，澄清無沉淀，花楸果香濃郁，酸甜協(xié)調，感官評分達87.2分，酒精度為9.56%vol，多酚含量為3 617.3 mg/L，花青素含量697.6 mg/L，DPPH自由基清除率93.8%，ABTS自由基清除率88.4%，羥自由基清除率76.5%，各項理化和微生物限量均符合NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》標準。成品果酒中總多酚含量、花青素含量、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羥自由基清除率均顯著高于未發(fā)酵的果汁，具有較強的抗氧化活性，可為高品質黑果腺肋花楸果酒的開發(fā)提供依據(jù)。后期將進一步對黑果腺肋花楸果酒的生理功能進行研究。