龔虎程，王 宇，羅 靜，張家旭，田樹(shù)林，邊名鴻，高 健，韓保林*

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005；2.成都蜀之源酒業(yè)有限公司，四川 成都 611335）

中國(guó)白酒是世界六大蒸餾酒之一，不僅在國(guó)內(nèi)聞名，同時(shí)在國(guó)外也享有一定的地位[1-2]。其中濃香型白酒具有綿甜甘冽、香味協(xié)調(diào)、尾凈香長(zhǎng)等風(fēng)味特點(diǎn)，年產(chǎn)量占據(jù)我國(guó)白酒市場(chǎng)的70%以上，在國(guó)內(nèi)白酒行業(yè)處于領(lǐng)先地位，深受人們的喜愛(ài)[3]。泥窖發(fā)酵是濃香型白酒最典型的特征，是區(qū)別于其他香型白酒的關(guān)鍵所在，窖泥的質(zhì)量也成為決定其品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[4-5]。窖泥由特殊土質(zhì)、麩曲粉、黃水、己酸菌液、酒尾等構(gòu)成，含有豐富的細(xì)菌、古菌和真菌微生物資源，是濃香型白酒生產(chǎn)釀造的基礎(chǔ)[6-8]。窖泥內(nèi)部的酯化菌能夠代謝產(chǎn)生酯化酶，從而將乙醇與小分子有機(jī)酸如己酸、乙酸、乳酸、丁酸等酯化縮合生成相應(yīng)的乙酯類(lèi)化合物，增加濃香型白酒主體香成分，發(fā)揮生香的作用[9-10]。

微生物會(huì)根據(jù)自身的生長(zhǎng)特性來(lái)選擇適宜的條件進(jìn)行生長(zhǎng)、代謝、繁殖，在窖泥的特殊環(huán)境下，大多數(shù)霉菌會(huì)被逐漸淘汰，而細(xì)菌則會(huì)逐漸成為窖泥微生態(tài)環(huán)境中的主體部分[11]。并且窖內(nèi)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境表明，一系列的生香反應(yīng)不是單個(gè)菌株作用的結(jié)果，而是多種微生物協(xié)同作用完成的。當(dāng)前已有一些學(xué)者對(duì)窖泥中酯化菌和協(xié)同發(fā)酵進(jìn)行了研究，并且表明細(xì)菌是窖泥中主要的酯化菌[12-13]。趙志軍等[14]優(yōu)化酯化菌的產(chǎn)酶條件，最終獲得最優(yōu)的工藝，并且酯化酶活力明顯提升。衛(wèi)春會(huì)等[15]研究發(fā)現(xiàn)，傳代富集能夠增加酯類(lèi)物質(zhì)的含量和數(shù)量，并且利于厭氧酯化菌的篩選。黃治國(guó)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，將3株酯化菌復(fù)配發(fā)酵能顯著提升己酸乙酯和丁酸乙酯的含量。郭燕等[17]探究酵母菌和酯化菌的混菌協(xié)同發(fā)酵，最終獲得最優(yōu)的工藝條件，并且己酸乙酯和丁酸乙酯的含量明顯提升。

本研究以40年窖泥為研究對(duì)象，分離篩選酯化酶活力較高的細(xì)菌，利用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定。將篩選菌株與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）JM-4協(xié)同發(fā)酵，以酯化酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化協(xié)同發(fā)酵條件，并采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（headspace solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）技術(shù)分析發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性化合物。以期為改良衰退窖泥、養(yǎng)護(hù)窖池和人工窖泥的培養(yǎng)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌株

窖泥：無(wú)菌操作采集于宜賓、邛崍兩個(gè)知名酒企40年窖池上層（距窖口50 cm）、中層（窖池中部）、下層（距窖底50 cm）窖泥，無(wú)菌袋中立即混勻于干冰中貯存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存待用。

異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）JM-4：篩選自邛崍某知名酒企大曲，本實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保藏。

1.1.2 試劑

牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、聚乙烯醇1788、革蘭氏染液、三丁酸甘油酯（均為分析純）、酵母粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

水瓊脂培養(yǎng)基：水瓊脂20 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YPD液體培養(yǎng)基：YPD固體培養(yǎng)基不添加瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂粉20 g/L，加入三丁酸甘油酯1%。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏20 g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硫酸銨1 g/L，七水硫酸鎂1 g/L，氯化鈉0.5 g/L，七水硫酸亞鐵0.01 g/L，調(diào)pH至7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250BE生化培養(yǎng)箱：上海力辰邦西儀器科技有限公司；CP124C電子天平：美國(guó)OHAUS公司；Stab MiniL搖床：上海潤(rùn)度生物科技有限公司；MX-S混勻儀：北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；DHG-9140A烘箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TG16.5高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TOUCH BGLN光學(xué)顯微鏡：寧波天宇光電科技有限公司；DGL-50B滅菌鍋：江蘇登冠醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離與純化

分別稱(chēng)取兩個(gè)窖泥樣品各10 g于100 mL無(wú)菌生理鹽水中充分振蕩混勻，取上清液以10倍梯度稀釋法逐級(jí)稀釋?zhuān)玫?0-1～10-7菌懸液。不同稀釋度的菌懸液于篩選培養(yǎng)基上涂布，35 ℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察選取具有透明圈的菌落，之后進(jìn)行分離、純化和保藏。

1.3.2 菌種鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：待純化菌株長(zhǎng)出后，按照《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和革蘭氏染色[18-19]。

分子生物學(xué)鑒定：將純化后的菌株送至成都擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，與已知模式菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對(duì)，選取同源性較高的菌株，采用MEGA X軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[20]。

1.3.3 種子液、發(fā)酵液及粗酶液的制備

將篩選菌株CY-1、CY-2、SY-3分別挑取一環(huán)接種于液體培養(yǎng)基中，于35 ℃、150 r/min條件下將活細(xì)胞培養(yǎng)至106CFU/mL，得到菌株CY-1、CY-2、SY-3種子液；將菌株JM-4挑一環(huán)接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、100 r/min條件下將活細(xì)胞培養(yǎng)至106CFU/mL，得到菌株JM-4種子液。將菌株CY-1、CY-2、SY-3和JM-4種子液按照體積比1∶1∶1∶1混合，制備得到混菌種子液[17]。

將菌株CY-1、CY-2、SY-3、JM-4種子液和混菌種子液分別以5%的接種量接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。

發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，除去沉淀，留取上清液即得粗酶液，4 ℃保存。

1.3.4 篩選菌株的透明圈直徑及酯化酶活力測(cè)定

將已滅菌的水瓊脂培養(yǎng)基倒至培養(yǎng)皿下層約10 mL，待其凝固；之后在凝固的培養(yǎng)基表面垂直放上牛津杯輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙；再將篩選培養(yǎng)基倒在底層培養(yǎng)基上，待其凝固后，取出牛津杯，即形成孔洞。向孔洞內(nèi)接種0.1 mL酶液（種子液離心上清液），室溫?cái)U(kuò)散30 min，培養(yǎng)皿正面向上置于35 ℃培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)孔周?chē)该魅Υ笮?。參照劉延波等[21]的測(cè)定方法測(cè)定篩選菌株單菌發(fā)酵及混菌（菌株CY-1、CY-2、SY-3和JM-4種子液按照體積比1∶1∶1∶1）協(xié)同發(fā)酵的粗酶液中酯化酶活力，每組3個(gè)平行，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.3.5 協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

探究混菌（菌株CY-1、CY-2、SY-3和JM-4種子液按照體積比1∶1∶1∶1）協(xié)同發(fā)酵接種量（1%、3%、5%、7%、9%）；初始pH值（3、4、5、6、7）；發(fā)酵時(shí)間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）對(duì)酯化酶活力的影響。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量（A），初始pH值（B）及發(fā)酵時(shí)間（C）為影響因素，酯化酶活力為考察指標(biāo)，通過(guò)L9（33）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for conditions optimization of synergistic fermentation

1.3.6 發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性化合物測(cè)定

通過(guò)HS-SPME-GC-MS測(cè)定單菌發(fā)酵和混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性化合物[22-23]。

樣品前處理：取5 mL發(fā)酵液于15 mL頂空瓶中，再加入2 g NaCl和10 μL 2-辛醇（82.2 μg/mL）。樣品先于50 ℃平衡15min，然后插入萃取針頂空萃取30min，之后進(jìn)樣解吸3min。

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序?yàn)椋?5 ℃保持4 min，然后以2 ℃/min升溫到60 ℃不保持，再以6 ℃/min升溫到180 ℃保持15 min；進(jìn)樣口溫度230 ℃；高純氦氣（He）為載氣，不分流進(jìn)樣，流速0.9 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度和連接線溫度均為230 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃；電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量為70 eV；采集模式為全掃描，質(zhì)譜范圍20～550 amu。

定性定量方法：采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）05a.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對(duì)，選擇匹配度均≥80（最大值100）的特征離子進(jìn)行定性分析，并鑒定結(jié)果。以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇配制成質(zhì)量濃度為82.2 μg/mL的2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，于5 mL發(fā)酵液中加入10 μL 2-辛醇，通過(guò)測(cè)定樣品中揮發(fā)性化合物峰面積與2-辛醇峰面積之比以及內(nèi)標(biāo)在樣品中的最終濃度來(lái)計(jì)算揮發(fā)性化合物的含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Origin 2022軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯化菌的分離篩選及鑒定結(jié)果

2.1.1 篩選菌株形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)稀釋平板涂布法和透明圈法從40年窖泥中共篩選到3株酯化菌，分別編號(hào)為CY-1、CY-2和SY-3，其菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和特征描述結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 篩選菌株的菌落、細(xì)胞形態(tài)及特征描述Table 2 Colony and cell morphology and characterization description of screened strains

2.1.2 篩選菌株分子生物學(xué)鑒定

篩選菌株委托成都擎科科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果表明，菌株CY-1與阿氏芽孢桿菌（Priestia aryabhattai）同源性達(dá)到100%；菌株CY-2與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）同源性達(dá)到99%；菌株SY-3與暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）同源性達(dá)到99%。因此，菌株CY-1被鑒定為阿氏芽孢桿菌（Priestia aryabhattai）；菌株CY-2被鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；菌株SY-3被鑒定為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。同時(shí)對(duì)三株菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 基于16S rDNA基因序列篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of screened strains based on 16S rDNA gene sequence

2.2 篩選菌株產(chǎn)酯化酶活力測(cè)定結(jié)果

篩選菌株單菌發(fā)酵及混菌協(xié)同發(fā)酵的粗酶液酯化酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 篩選菌株單菌發(fā)酵及混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)酯化酶活力測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of esterification enzyme activity of single and synergistic fermentation of screened strains

由圖2可知，單菌中酵母菌JM-4的酯化酶活力最大，為36.44 U/mL，而篩選得到的3株酯化菌粗酶液中菌株CY-1的酯化酶活力最大，為35.44 U/mL，菌株SY-3和CY-2的粗酶液中酯化酶活力稍低于CY-1，分別為32.78 U/mL和31.22 U/mL，酯化酶活力結(jié)果與透明圈結(jié)果相一致，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。此外，混菌協(xié)同發(fā)酵的酯化酶活力為42.89 U/mL，明顯高于單菌發(fā)酵。

2.3 混菌協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 接種量對(duì)酯化酶活力的影響

由圖3可知，酯化酶活力隨混菌接種量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為1%～5%時(shí)，酯化酶活力隨之增高；當(dāng)接種量為5%時(shí)，混菌協(xié)同發(fā)酵液的酯化酶活力達(dá)到最大，為44.22 U/mL，并且顯著高于其他水平（P＜0.05）；當(dāng)接種量＞5%之后，酯化酶活力有所下降。因此，確定最適的接種量為5%。

圖3 不同混菌接種量對(duì)酯化酶活力的影響Fig.3 Effect of different mixed strains inoculum on esterification enzyme activity

2.3.2 初始pH值對(duì)酯化酶活力的影響

由圖4可知，酯化酶活力隨初始pH值的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)初始pH值為3～5時(shí)，酯化酶活力隨之增高；當(dāng)初始pH值為5時(shí)，混菌協(xié)同發(fā)酵液的酯化酶活力達(dá)到最大，為50.78 U/mL，并且顯著高于其他水平（P＜0.05）；當(dāng)初始pH值＞5之后，酯化酶活力有所下降。因此，確定最適的初始pH值為5。

圖4 不同初始pH值對(duì)酯化酶活力的影響Fig.4 Effect of different initial pH value on esterification enzyme activity

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酯化酶活力的影響

由圖5可知，酯化酶活力隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24～48 h時(shí)，酯化酶活力隨之增高；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，混菌發(fā)酵液的酯化酶活力達(dá)到最大，為52.11 U/mL，并且顯著高于其他水平（P＜0.05）；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞48 h之后，酯化酶活力有所下降。因此，確定最適發(fā)酵時(shí)間為48 h。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酯化酶活力的影響Fig.5 Effect of different fermentation time on esterification enzyme activity

2.4 混菌協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量（A），初始pH值（B）及發(fā)酵時(shí)間（C）為考察因素，酯化酶活力為考察指標(biāo)，通過(guò)3因素3水平L9（33）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵條件正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions optimization of synergistic fermentation

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，對(duì)混菌協(xié)同發(fā)酵粗酶液酯化酶活力影響最大的因素是初始pH值，其次是發(fā)酵時(shí)間和接種量。通過(guò)極差分析得到最優(yōu)協(xié)同發(fā)酵組合為A3B1C2，即接種量6%、初始pH值為4.5、發(fā)酵時(shí)間48 h。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，酯化酶活力為52.67 U/mL。

由表4方差分析結(jié)果可知，影響混菌協(xié)同發(fā)酵液酯化酶活力因素順序?yàn)槌跏紁H（B）＞發(fā)酵時(shí)間（C）＞接種量（A），與極差分析結(jié)果一致。此外，3個(gè)因素對(duì)酯化酶活力均具有顯著影響（P＜0.05）。

2.5 揮發(fā)性化合物測(cè)定結(jié)果

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)菌株CY-1、CY-2、SY-3、JM-4單菌發(fā)酵和混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性化合物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，所有樣品共檢出37種揮發(fā)性化合物，菌株CY-1、CY-2、SY-3和JM-4單菌發(fā)酵粗酶液中分別共檢出11種、10種、9種和17種揮發(fā)性化合物，混菌協(xié)同發(fā)酵最優(yōu)條件下粗酶液中共檢出17種揮發(fā)性化合物。結(jié)果表明，混菌協(xié)同發(fā)酵揮發(fā)性化合物含量有所提升，在酸類(lèi)物質(zhì)中尤為明顯，同時(shí)生成單菌發(fā)酵不具備的對(duì)白酒起助香作用的化合物，其中己酸乙酯含量最高，并且其是濃香型白酒的主體揮發(fā)性化合物[24]。此外，己酸乙酯和辛酸乙酯的前體物質(zhì)己酸和辛酸在最優(yōu)發(fā)酵條件下產(chǎn)生，說(shuō)明混菌協(xié)同發(fā)酵能夠促進(jìn)己酸和辛酸的生成?；炀鷧f(xié)同發(fā)酵同樣能夠提升2,3-丁二醇和3-羥基-2-丁酮的含量，有研究表明這兩種化合物在白酒中能夠發(fā)揮促進(jìn)產(chǎn)生濃厚、優(yōu)良風(fēng)味的作用[25-27]。

表5 單菌發(fā)酵及混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性化合物測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of volatile compounds fermentation products by single strain fermentation and mixed strains synergistic fermentation

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從窖泥中篩選到3株具有產(chǎn)酯化酶能力的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定，菌株CY-1被鑒定為阿氏芽孢桿菌（Priestia aryabhattai）；菌株CY-2被鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；菌株SY-3被鑒定為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。將這3株篩選菌株與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）JM-4進(jìn)行等比例混菌協(xié)同發(fā)酵，以酯化酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)確定最優(yōu)協(xié)同發(fā)酵條件為接種量6%、初始pH值為4.5、發(fā)酵時(shí)間48 h。在此優(yōu)化條件下，混菌協(xié)同發(fā)酵液酯化酶活力為52.67 U/mL，相較于優(yōu)化前提升了22.80%。此外，混菌協(xié)同發(fā)酵后揮發(fā)性化合物含量明顯增加，說(shuō)明協(xié)同發(fā)酵對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的形成具有積極作用。