◎ 唐 倩，劉斌杰

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.三明醫(yī)學(xué)科技職業(yè)學(xué)院，福建 三明 365000）

茶菌，又名康普茶，是起源于中國的一種發(fā)酵茶飲料。傳統(tǒng)的茶菌以紅茶和白糖為主要原料，經(jīng)過酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的混合發(fā)酵而制成[1]。用于制作茶菌的原料（如不同茶葉、不同糖類）是影響茶菌風(fēng)味、品質(zhì)和生理功能的決定性因素之一[2]。發(fā)酵原料所提供的碳、氮營養(yǎng)不僅是茶菌微生物生長所必需的營養(yǎng)因子，同時(shí)是影響發(fā)酵微生物菌株互作關(guān)系和菌群動(dòng)態(tài)的重要因素[3]。在碳源營養(yǎng)方面，李璐璐[4]通過比較不同碳源物質(zhì)對(duì)茶菌發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)10%葡萄糖作為碳源時(shí)發(fā)酵液的pH 值下降最快；添加無機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵液pH 值和總酸的變化沒有顯著影響。BRUNA 等[5]發(fā)現(xiàn)以綠茶為發(fā)酵基質(zhì)制備茶菌，發(fā)酵液乙酸產(chǎn)量和抗高血壓活性值較高，而pH 值和乙醇值較低；以紅茶為發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵液總多酚含量較高；以馬黛茶為發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵液pH 值較高而抗高血壓活性值較低。CAMILA 等[6]分析碳源成分對(duì)不同酵母菌株的影響，發(fā)現(xiàn)真貝釀酒酵母（Saccharomyces eubayanus）在不同碳源的培養(yǎng)條件下生長速度不同，葡萄糖和蔗糖的混合有利于菌株的生長。這些研究大多分析不同營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)茶菌發(fā)酵液成分和功能的影響，對(duì)發(fā)酵菌株生長和代謝的作用研究很少。茶菌發(fā)酵過程中，微生物所需氮素營養(yǎng)主要來源于茶葉或其他植物原料。由于植物含氮物質(zhì)豐富，種類各異，和碳源營養(yǎng)相比，有關(guān)氮源營養(yǎng)對(duì)茶菌發(fā)酵液和發(fā)酵菌株的影響，研究更為缺乏。

布魯塞爾酒香酵母和葡萄糖醋桿菌是茶菌發(fā)酵的核心菌株[7-9]。本研究分析碳、氮營養(yǎng)對(duì)布魯塞爾酒香酵母和葡萄糖醋桿菌單獨(dú)培養(yǎng)條件下菌株生長、發(fā)酵液pH 值和酸度的影響，為進(jìn)一步研究兩菌株的互作關(guān)系，以及利用兩菌株構(gòu)建人工混合菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

酵母菌菌株Q3（布魯塞爾酒香酵母Brettanomyces bruxellensis）和醋酸菌菌株Q4（葡萄糖醋桿菌Komagataeibacter rhaeticus）均為前期從紅茶菌中分離得到的菌株[10-11]，保藏于中國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

酵母菌培養(yǎng)基、醋酸菌培養(yǎng)基和紅茶糖水液體培養(yǎng)基參照汪鵬輝等[11]的配方和方法。酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，自配[無氨基和硫酸銨酸酵母氮源（Yeast Nitrogen Base，YNB）6.7 g·L-1，葡萄糖35 g·L-1，配制10×YNB 基礎(chǔ)母液，0.22 μm 濾膜過濾除菌，置于2～8 ℃保存]。紅茶，福建省福州市好茗天茶葉有限公司；硝酸鉀、亞硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、無水葡萄糖、無水乙醇、碳酸鈣和氫氧化鈉（分析純），西隴化工股份有限公司；乳糖、半乳糖、麥芽糖、酵母浸膏和瓊脂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果糖、纖維二糖，上海麥克林生化科技有限公司；YNB 培養(yǎng)基（基礎(chǔ)母液），上海生工生物工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化及培養(yǎng)條件

保藏于4 ℃條件下的菌株Q3 和Q4，無菌操作將菌株Q3 轉(zhuǎn)接到酵母菌培養(yǎng)基、菌株Q4 轉(zhuǎn)接到醋酸菌培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫下活化培養(yǎng)2～3 d。后挑取兩菌株單菌落分別接種至酵母菌液體培養(yǎng)基和醋酸菌液體培養(yǎng)基中，于28 ℃ 180 r·min-1培養(yǎng)48 h。隨后，參照汪鵬輝等[11]的方法進(jìn)行菌株Q3 和Q4 的單獨(dú)培養(yǎng)。

1.3.2 碳源對(duì)菌株Q3、Q4 生長的產(chǎn)酸的影響

以未接菌的紅茶糖水培養(yǎng)液作為對(duì)照組，將對(duì)照組中的白糖分別換成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的不同碳源物質(zhì)（纖維二糖、果糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖），各取150 mL 不同碳源的培養(yǎng)液分裝于250 mL 的錐形瓶中，冷卻至室溫，分別接入活化的菌株Q3 和Q4，置于28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)12 d。培養(yǎng)過程中，每隔2 d取一次樣，測定發(fā)酵液OD600值（表征菌株生長情況）、pH 值和總酸含量。每組試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每份樣品測定3 次取平均值。

1.3.3 氮源對(duì)菌株Q3、Q4 生長和產(chǎn)酸的影響

以未接菌的YNB 培養(yǎng)液作對(duì)照組，在YNB 培養(yǎng)液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的不同氮源物質(zhì)（茶氨酸、谷氨酸、硝酸鉀、亞硝酸鈉、氯化銨和硫酸銨），各取150 mL YNB 培養(yǎng)液分裝于250 mL 的錐形瓶中，冷卻至室溫，分別接入活化的菌株Q3 和Q4，于28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)12 d。在培養(yǎng)過程中，每隔2 d 取一次樣，測定發(fā)酵液OD600值（表征菌株生長情況）、pH 值和總酸含量。每組試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每份樣品測定3 次取平均值。

1.4 測定方法

（1）OD600測定方法。參考汪鵬輝等[11]的測定方法，使用紫外可見光分光光度計(jì)，在波長600 nm 下測定菌液的OD600[11]。

（2）pH 的測定。用Starter 2100 pH 計(jì)測定發(fā)酵液的pH 值。

（3）總酸的測定。參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》（GB/T 12456—2021）的方法操作，采用氫氧化鈉滴定法測定總酸含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用Origin 2021 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)菌株Q3 生長和產(chǎn)酸的影響

2.1.1 碳源對(duì)菌株Q3 生長的影響

由圖1 可知，供試的7 種碳源物質(zhì)均能促進(jìn)菌株Q3 的生長，但促進(jìn)作用的程度存在差異。添加乳糖和半乳糖為碳源時(shí)，菌株Q3 生長速度較為緩慢。果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和纖維二糖為碳源時(shí)，菌株Q3的生長趨勢一致。菌株Q3 的生長速度總體表現(xiàn)為果糖＞葡萄糖＞蔗糖＞麥芽糖＞纖維二糖＞半乳糖＞乳糖。

圖1 碳源物質(zhì)對(duì)菌株Q3 單獨(dú)培養(yǎng)OD600 的影響圖

2.1.2 碳源對(duì)菌株Q3 發(fā)酵液pH 值的影響

由圖2 可知，在發(fā)酵0～2 d 時(shí)，不同碳源營養(yǎng)的菌株發(fā)酵液pH 值下降趨勢較明顯。發(fā)酵6～12 d，以乳糖為碳源的發(fā)酵液pH 值趨于穩(wěn)定，維持在4.75～4.80。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，以其他糖類為碳源的發(fā)酵液pH 值持續(xù)下降。培養(yǎng)至12 d，除乳糖外，其他糖類的發(fā)酵液pH 值在4.20～4.40，差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 碳源物質(zhì)對(duì)菌株Q3 單獨(dú)培養(yǎng)pH 值的影響圖

2.1.3 碳源對(duì)菌株Q3 發(fā)酵液總酸的影響

由圖3 可知，除乳糖外，其他糖類為碳源的菌株Q3 發(fā)酵液酸度均隨發(fā)酵時(shí)間延長逐漸上升。發(fā)酵12 d后，以乳糖為碳源的菌株發(fā)酵液總酸含量為0.28 g·L-1，與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；其他糖類為碳源的發(fā)酵液總酸濃度在1.00～1.20 g·L-1，與對(duì)照相比差異極極顯著（P＜0.001）。

圖3 碳源物質(zhì)對(duì)菌株Q3 單獨(dú)培養(yǎng)總酸的影響圖

2.2 碳源對(duì)菌株Q4 生長和產(chǎn)酸的影響

2.2.1 碳源對(duì)菌株Q4 生長的影響

由圖4 可知，菌株Q4 在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長迅速，培養(yǎng)至6 d 時(shí)發(fā)酵液OD600達(dá)到最大值0.46，隨后，OD600值急劇下降，培養(yǎng)12 d 時(shí)發(fā)酵液OD600值為0.18。與葡萄糖相比，菌株Q4 在其他6 種碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d 后生長較為緩慢，菌體濃度的變化趨勢相似，均大體呈上升態(tài)勢，OD600值沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖4 碳源物質(zhì)對(duì)菌株Q4 單獨(dú)培養(yǎng)OD600 的影響圖

2.2.2 碳源對(duì)菌株Q4 發(fā)酵液pH 值的影響

由圖5 可知，菌株Q4 在不同碳源營養(yǎng)的培養(yǎng)液中發(fā)酵后，發(fā)酵液pH 值隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢。其中，以葡萄糖為碳源的發(fā)酵液pH 值下降快，與對(duì)照和其他碳源的發(fā)酵液相比差異極極顯著（P＜0.001）。

圖5 碳源物質(zhì)對(duì)菌株Q4 單獨(dú)培養(yǎng)pH 的影響圖

2.2.3 碳源對(duì)菌株Q4 發(fā)酵液總酸的影響

由圖6 可知，培養(yǎng)4 d 后，以葡萄糖為碳源的菌株Q4 發(fā)酵液總酸含量急劇上升，培養(yǎng)到12 d，發(fā)酵液總酸含量達(dá)到4.94 g·L-1，與對(duì)照和其他碳源的發(fā)酵液相比差異極極顯著（P＜0.001）。其余6 種碳源的菌株發(fā)酵液總酸含量低于0.50 g·L-1，與對(duì)照相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 碳源物質(zhì)對(duì)菌株Q4 單獨(dú)培養(yǎng)總酸的影響圖

2.3 氮源對(duì)菌株Q3 生長和產(chǎn)酸的影響

2.3.1 氮源對(duì)菌株Q3 生長的影響

由圖7 可知，菌株Q3 能夠在以硫酸銨、氯化銨、茶氨酸、硝酸鉀和谷氨酸為氮源的培養(yǎng)基中生長，但在以亞硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中幾乎不生長。硫酸銨、氯化銨和茶氨酸為氮源能明顯促進(jìn)菌株Q3 生長；特別是兩種銨鹽，與其他氮源相比對(duì)菌株Q3 生長促進(jìn)作用極極顯著（P＜0.001）。

圖7 氮源物質(zhì)對(duì)菌株Q3 單獨(dú)培養(yǎng)OD600 的影響圖

2.3.2 氮源對(duì)菌株Q3 發(fā)酵液pH 值的影響

由圖8 可知，添加亞硝酸鈉為氮源時(shí)，pH 值高于對(duì)照組；其他5 種氮源發(fā)酵液的pH 值低于對(duì)照組。添加亞硝酸鈉為氮源時(shí)，菌株Q3 發(fā)酵液pH 值呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢；以谷氨酸為氮源時(shí)，發(fā)酵液的pH 值變化不明顯；添加其他4 種氮源物質(zhì)發(fā)酵液pH 值逐漸下降。與對(duì)照組相比較，以兩種銨鹽為氮源，發(fā)酵液pH 值下降最明顯（P＜0.001）。

圖8 氮源物質(zhì)對(duì)菌株Q3 單獨(dú)培養(yǎng)pH 的影響圖

2.3.3 氮源對(duì)菌株Q3 發(fā)酵液總酸的影響

由圖9 可知，除亞硝酸鈉外，添加其他氮源物質(zhì)的菌株Q3 發(fā)酵液總酸含量呈現(xiàn)上升的趨勢。發(fā)酵12 d后，發(fā)酵液總酸量表現(xiàn)為谷氨酸＞氯化銨＞硫酸銨＞茶氨酸＞硝酸鉀＞亞硝酸鈉。

圖9 氮源物質(zhì)對(duì)菌株Q3 單獨(dú)培養(yǎng)總酸的影響圖

2.4 氮源對(duì)菌株Q4 生長和產(chǎn)酸的影響

2.4.1 氮源對(duì)菌株Q4 生長的影響

由圖10 可知，菌株Q4 在以茶氨酸為氮源的培養(yǎng)基中生長迅速，12 d 后菌體濃度極極顯著大于其他5 種供試氮源物質(zhì)（P＜0.001）。在培養(yǎng)后期，以茶氨酸和谷氨酸為氮源的瓶中產(chǎn)生絮狀物質(zhì)（醋酸纖維），分析原因，可能是茶氨酸和谷氨酸這兩種氨基酸為菌株Q4 提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)刺激菌株Q4 分泌胞外多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)產(chǎn)生絮狀物質(zhì)。

圖10 氮源物質(zhì)對(duì)菌株Q4 單獨(dú)培養(yǎng)OD600 的影響圖

2.4.2 氮源對(duì)菌株Q4 發(fā)酵液pH 值的影響

由圖11 可知，以亞硝酸鈉為氮源的發(fā)酵液pH 值維持在5.78～5.99，以其他5 種物質(zhì)為氮源的菌株發(fā)酵液pH 值均呈緩慢下降趨勢，菌株以谷氨酸為氮源的發(fā)酵液初始pH 值最低。

圖11 氮源物質(zhì)對(duì)菌株Q4 單獨(dú)培養(yǎng)pH 的影響圖

2.4.3 氮源對(duì)菌株Q4 發(fā)酵液總酸的影響

由圖12 可知，以茶氨酸、谷氨酸、氯化銨和硫酸銨為氮源培養(yǎng)時(shí)，菌株Q4 發(fā)酵液總酸含量隨時(shí)間變化而逐漸升高；培養(yǎng)10 d 后，以茶氨酸為氮源的發(fā)酵液總酸達(dá)到最大值5.30 g·L-1，極極顯著高于對(duì)照組發(fā)酵液的總酸含量（P＜0.001）。以亞硝酸鈉和硝酸鉀為氮源時(shí)，菌株發(fā)酵液的總酸含量變化較小，相對(duì)平穩(wěn)。

圖12 氮源物質(zhì)對(duì)菌株Q4 單獨(dú)培養(yǎng)總酸的影響圖

3 結(jié)論與討論

布魯塞爾酒香酵母和葡糖醋酸桿菌是茶菌自然發(fā)酵的優(yōu)勢菌株[1,3]。與葡萄酒、果醋和生物乙醇發(fā)酵相比，布魯塞爾酒香酵母和葡糖醋酸桿菌菌株的營養(yǎng)需求和發(fā)酵性能在茶菌發(fā)酵系統(tǒng)中了解很少。

果糖、葡萄糖和蔗糖是菌株Q3 生長和產(chǎn)酸的良好碳源物質(zhì)；硫酸銨、氯化銨是良好的氮源營養(yǎng)，而乳糖、硝酸鉀對(duì)菌株Q3 生長和產(chǎn)酸促進(jìn)作用弱，亞硝酸鈉不利于菌株Q3 的生長和產(chǎn)酸。酒香酵母屬的菌株碳源譜廣，可利用豐富的碳水化合物，以葡萄糖作碳源較為適合[8]。在有氧和營養(yǎng)缺乏的條件下，酒香酵母可以利用乙醇和乙酸作為唯一碳源而生存；但在無氧條件下，酒香酵母又可以成為優(yōu)良的乙醇生產(chǎn)菌株，可以耐受15%的乙醇含量和pH=3 的酸性環(huán)境[12]。酒香酵母可利用的氨基酸氮源廣泛，以谷氨酰胺較好[13]。在單獨(dú)培養(yǎng)條件下，菌株Q3 在茶糖水培養(yǎng)液中發(fā)酵產(chǎn)酸能力強(qiáng)于菌株Q4，尤其是谷氨酸對(duì)菌株Q3 產(chǎn)酸的促進(jìn)作用，值得進(jìn)一步關(guān)注。

相較于菌株Q3，菌株Q4 對(duì)供試碳源和氮源物質(zhì)的選擇更為嚴(yán)格；葡萄糖和茶氨酸分別是促進(jìn)菌株Q4生長的最佳碳源和氮源物質(zhì)。KOLESOVS 等[14]發(fā)現(xiàn)對(duì)菌株K.rhaeticusMSCL 1463 產(chǎn)膜有利的碳源成分是葡萄糖，而乳糖和半乳糖不利于產(chǎn)膜。簡單碳源如甘露醇、甘油、葡萄糖和果糖有利于醋酸菌生長和產(chǎn)細(xì)菌纖維素膜[15]。在產(chǎn)纖維素醋酸菌的研究中，相對(duì)于碳源成分，對(duì)K.rhaeticus菌株氮源成分的研究明顯不夠。ASWINI 等[16]發(fā)現(xiàn)豐富氮源如酵母浸膏和牛肉浸膏對(duì)醋酸菌的產(chǎn)膜有利，而硝酸銨、硝酸鈣和硝酸鈉等硝態(tài)氮、胺態(tài)氮不利于纖維素的生產(chǎn)。

不同菌株的營養(yǎng)需求差異可能是茶菌發(fā)酵過程中菌株互作關(guān)系和菌群動(dòng)態(tài)變化的基礎(chǔ)[2]。茶菌發(fā)酵過程中微生物對(duì)茶葉成分的生物轉(zhuǎn)化研究較多，茶葉成分的轉(zhuǎn)化是形成茶菌營養(yǎng)、風(fēng)味和生理功能的基礎(chǔ)[1-2]。但是，營養(yǎng)成分如何影響發(fā)酵過程中微生物的生長、代謝和種群更迭，研究很缺乏。因此，分析碳、氮營養(yǎng)對(duì)菌株Q3 和Q4 生長和產(chǎn)酸特性的作用，可以為今后人工菌群的構(gòu)建和發(fā)酵基質(zhì)的開發(fā)打下基礎(chǔ)。