陳泰裕，曾海文，丁志榮（通信作者）

泉州市第一醫(yī)院 （福建泉州 362000）

膿毒癥是一種多因素導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其發(fā)病率和病死率逐年增加[1-3]。急性肺損傷是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥，患者常表現(xiàn)為肺水腫、呼吸窘迫等癥狀。目前，膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷治療方法較少，且效果欠佳。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥主要由嚴(yán)重感染所致的免疫抑制所引發(fā)[4-5]。李康等[6]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者外周血T 細(xì)胞及Treg 細(xì)胞表面程序性死亡受體1（Programmed cell death protein 1，PD-1）呈明顯高表達(dá)，與膿毒癥病情進(jìn)展及不良預(yù)后密切相關(guān)，且T 細(xì)胞PD-1 的高表達(dá)與膿毒癥的病情嚴(yán)重程度和不良預(yù)后呈正相關(guān)[7-9]。雖然目前T 細(xì)胞亞群和PD-1 在膿毒癥患者中的研究較多，但臨床對(duì)于膿毒癥急性肺損傷患者的研究較少。因此，本研究旨在探討PD-1 與T 細(xì)胞及其亞群比率對(duì)膿毒癥肺損傷患者的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年1 月至2022 年1 月我院收治的30 例膿毒癥急性肺損傷患者為研究組，選取同期30 例膿毒癥無急性肺損傷患者為對(duì)照組、30 名健康體檢者為空白組。研究組男18 例，女12 例；年齡50～65 歲，平均（58.49±5.51）歲；急性生理學(xué)及慢性健康狀況評(píng)估系統(tǒng)Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ）評(píng)分為（18.72±0.89）分。對(duì)照組男20 例，女10 例；年齡51～64 歲，平均（57.34±6.18）歲；APACHE Ⅱ評(píng)分為（17.62±1.62）分。兩組的年齡、性別、APACHE Ⅱ評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性?？瞻捉M男18 例，女12 例；年齡49～65 歲，平均（56.41±7.35）歲。所有入選者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（泉一倫[2020]221 號(hào)）。膿毒癥診斷符合2016 Sepsis3.0 指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，急性肺損傷西醫(yī)診斷符合《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南2006》[11]。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；存在感染灶擴(kuò)散疾?。荒挲g40～70 歲；精神狀況正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有惡性腫瘤、自身免疫性疾病、風(fēng)濕性疾病等免疫相關(guān)疾?。婚L期使用免疫抑制性藥物和細(xì)胞毒藥物；不能配合檢查，有明顯精神障礙且難以正常交流。

1.2 方法

抽取研究對(duì)象空腹靜脈血5 ml，離心取上清液，通過酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定炎癥因子[腫瘤壞死 因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin- 6，IL-6）和C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）]水平。按照淋巴細(xì)胞亞群分析試劑及單克隆ELISA 試劑盒的具體說明書，于計(jì)數(shù)管分別滴加TriTEST CD4+、CD8+、CD4+CD25+及PD-1 試劑及抗凝血試劑混勻，黑暗條件下孵育25 min 后滴加溶血?jiǎng)?，再次孵?5 min，然后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+、CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的百分比及細(xì)胞表面PD-1 水平。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

（1）收集3 組入院第1 天血清TNF-α、IL-6 和CRP 水平。（2）收集3 組第1、3、5、7 天的外周靜脈血，采用流式細(xì)胞術(shù)分析3 組7 d 內(nèi)CD4+、CD8+和CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的比例。（3）比較3 組PD-1 陽性表達(dá)情況，并采用序貫器官衰竭評(píng)估系統(tǒng)（sequential organ failure assessment，SOFA）評(píng)分和APACHE Ⅱ評(píng)分評(píng)估患者感染和病情嚴(yán)重程度，評(píng)分與嚴(yán)重程度成正比。（4）分析不同細(xì)胞亞群PD-1 的表達(dá)與SOFA 評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分及預(yù)后的相關(guān)性。（5）分析比較不同預(yù)后的膿毒癥急性肺損傷患者T 細(xì)胞亞群細(xì)胞表面PD-1 水平。（6）30 例膿毒癥急性肺損傷患者按28 d 預(yù)后分為死亡組（8 例）與生存組（22 例），分析膿毒癥急性肺損傷患者CD4+、CD8+和CD4+CD25+Treg 細(xì)胞表面PD-1 水平預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后的價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組炎癥指標(biāo)比較

對(duì)照組、研究組IL-6、CRP、TNF-α 水平明顯高于空白組，且研究組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 3 組炎癥指標(biāo)比較（±s）

表1 3 組炎癥指標(biāo)比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05；IL-6 為白介素6，CRP 為C 反應(yīng)蛋白，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α

組別 例數(shù) IL-6（ng/L） CRP（mg/L） TNF-α（ng/L）對(duì)照組 30 44.31±1.92a 42.42±11.27a 67.73±13.72a研究組 30 51.62±11.21ab 52.28±11.26ab 88.72±12.73ab空白組 30 22.28±4.28 19.31±9.18 31.21±8.83 F 142.169 76.240 177.988 P<0.001 <0.001 <0.001

2.2 3 組外周血CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例比較

入院后第7 天，對(duì)照組、研究組中CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞水平顯著升高，CD4+計(jì)數(shù)顯著下降；與空白組比較，對(duì)照組和研究組CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 3 組外周血CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例比較（%，±s）

表2 3 組外周血CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例比較（%，±s）

注：與空白組比較，aP<0.05

組別 例數(shù) CD4+ CD8+ CD4+CD25+Treg入院第1 天對(duì)照組 30 5.24±1.62 12.19±1.51 8.82±2.11研究組 30 4.31±1.92 12.38±1.85 8.79±2.52空白組 30 6.58±2.51 7.19±1.85 4.79±2.13入院后第3 天對(duì)照組 30 5.47±1.12 13.56±1.83 8.91±2.72研究組 30 5.27±1.71 13.71±2.19 8.98±2.34空白組 30 6.43±1.11 7.28±1.37 4.63±1.94入院后第5 天對(duì)照組 30 5.19±1.93 12.74±1.54 9.42±2.13研究組 30 4.83±1.65 14.17±2.18 9.78±3.19空白組 30 6.38±1.79 7.83±1.71 4.37±1.93入院后第7 天對(duì)照組 30 5.28±1.89a 13.18±2.42a 9.83±2.79a研究組 30 4.37±2.17a 14.32±3.18a 9.18±2.93a空白組 30 6.72±2.16 7.82±1.39 4.17±2.56

2.3 3 組不同細(xì)胞表面PD-1 情況與APACHE Ⅱ、SOFA 評(píng)分

對(duì)照組和研究組CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞表面PD-1 的表達(dá)水平高于空白組，且研究組CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞表面PD-1 的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。研究組SOFA 評(píng)分為（9.05±1.89）分、APACHE Ⅱ評(píng)分為（21.12±3.79）分，明顯高于對(duì)照組（6.87±1.68）分、（14.03±3.65）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 3 組不同細(xì)胞表面PD-1 表達(dá)情況比較（±s）

表3 3 組不同細(xì)胞表面PD-1 表達(dá)情況比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05；PD-1 為程序性死亡受體1，SOFA 為序貫器官衰竭評(píng)估系統(tǒng)，APACHE Ⅱ?yàn)榧毙陨韺W(xué)及慢性健康狀況評(píng)估系統(tǒng)Ⅱ

CD4+CD25+PD-1（%）對(duì)照組 30 47.72±4.97a 41.72±5.98a 6.87±1.39a研究組 30 58.25±8.08ab 48.38±6.82ab 9.87±2.36ab空白組 30 10.73±2.99 8.82±2.18 3.19±0.86 F 566.672 463.962 122.247 P<0.001 <0.001 <0.001組別 例數(shù) CD4+PD-1（%）CD8+PD-1（%）

2.4 不同細(xì)胞表面PD-1 與APACHE Ⅱ及SOFA評(píng)分的相關(guān)性分析

CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞表面PD-1 水平與APACHE Ⅱ、SOFA 評(píng)分呈正相關(guān)（P<0.05），見表4。

表4 不同細(xì)胞表面PD-1 與APACHE Ⅱ及SOFA 評(píng)分的相關(guān)性分析

2.5 不同預(yù)后膿毒癥急性肺損傷患者T 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞表面PD-1 水平比較

死亡組CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD4+CD25+PD-1水平高于生存組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表5。

表5 不同預(yù)后細(xì)胞表面PD-1 水平比較（%，±s）

表5 不同預(yù)后細(xì)胞表面PD-1 水平比較（%，±s）

注：PD-1 為程序性死亡受體1

組別 例數(shù) CD4+PD-1 CD8+PD-1 CD4+CD25+PD-1死亡組 8 59.18±10.28 47.81±9.17 9.29±1.89生存組 22 39.62±8.27 31.17±5.91 7.72±1.08 t 5.374 5.865 2.860 P<0.001 <0.001 0.008

2.6 不同細(xì)胞表面PD-1 水平預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后的價(jià)值分析

CD4+PD-1 預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后的靈敏度、特異度分別為72.19%、84.61%；CD8+PD-1 預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后的靈敏度、特異度分別為84.61%、72.26%；CD4+CD25+PD-1 預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后的靈敏度、特異度分別為60.31%、81.43%，見表6。

表6 不同細(xì)胞表面PD-1 水平預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后的診斷價(jià)值

3 討論

膿毒癥急性肺損傷以炎癥反應(yīng)和免疫功能紊亂為主要特征。目前，臨床對(duì)于該病的機(jī)制研究主要集中在免疫紊亂機(jī)制、炎癥機(jī)制、凝血系統(tǒng)機(jī)制、氧化應(yīng)激機(jī)制及遺傳機(jī)制[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1/PD-1 是膿毒癥免疫應(yīng)答重要的調(diào)節(jié)因子，在膿毒癥免疫抑制中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中潛在的免疫檢查靶點(diǎn)。而PD-1 主要表達(dá)于活化T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞等免疫細(xì)胞中[14-16]。過表達(dá)的PD-1 會(huì)抑制T 細(xì)胞功能，從而增加膿毒癥患者的病死率[17]。李少洪等[18]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者的外周血CD4+PD-1 表達(dá)升高，且膿毒癥患者的病情程度與外周血CD4+PD-1 表達(dá)呈正相關(guān)。外周血CD4+PD-1 表達(dá)可作為膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。鐘堅(jiān)等[19]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者CD4+PD-1、CD8+PD-1 表達(dá)均升高，且PD-1 的表達(dá)隨APACHE Ⅱ、SOFA 評(píng)分的增加而增高，與患者膿毒癥病情程度密切相關(guān)。曲冰杰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者CD4+和CD8+比例降低，且隨著病情發(fā)展，比例會(huì)進(jìn)一步下降；CD4+和CD8+的PD-1 表達(dá)升高，隨著病情發(fā)展，PD-1 表達(dá)水平進(jìn)一步上升，可見膿毒癥患者外周血CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)量變化與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。而在膿毒癥急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展中，有研究顯示，膿毒癥小鼠肺中CD4+細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的PD-1 表達(dá)增加[21]；且膿毒癥急性肺損傷死亡小鼠的外周血T 細(xì)胞PD-1 表達(dá)水平比存活小鼠明顯增加，但PD-1 敲除小鼠可降低膿毒癥急性肺損傷的病死率，且能減輕膿毒癥后多器官功能衰竭[22]。由此可見，CD4+和CD8+的PD-1 表達(dá)與膿毒癥急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)；但在急性肺損傷患者中，PD-1 與T 細(xì)胞及其亞群比率的變化對(duì)膿毒癥性肺損傷患者預(yù)后的影響還不甚明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，膿毒癥肺損傷患者血清中IL-6、CRP、TNF-α 的表達(dá)水平顯著升高，考慮是膿毒癥患者炎癥反應(yīng)明顯，炎癥因子高表達(dá)[23-24]。另外，對(duì)照組、研究組中CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的表達(dá)水平顯著升高，CD4+計(jì)數(shù)顯著下降；研究組CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞表面PD-1 水平與APACHE Ⅱ、SOFA 評(píng)分均高于對(duì)照組，且CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞表面PD-1 水平均與APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA 評(píng)分呈正相關(guān)，考慮原因?yàn)槟摱景Y患者持續(xù)性感染、病毒刺激導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損，誘導(dǎo)CD4+細(xì)胞凋亡，機(jī)體釋放大量CD4+CD25+Treg 細(xì)胞，影響機(jī)體免疫應(yīng)答，進(jìn)而造成患者出現(xiàn)免疫缺陷[20]。且CD4+、CD8+及CD4+CD25+Treg 細(xì)胞表面PD-1 水平升高提示PD-1 可能參與膿毒癥病情進(jìn)展過程。此外，死亡組CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD4+CD25+PD-1 水平高于生存組；CD4+PD-1 預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后的靈敏度、特異度為72.19%、84.61%；CD8+PD-1 的靈敏度、特異度為84.61%、72.26%；CD4+CD25+PD-1的靈敏度、特異度為60.31%、81.43%，提示CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD4+CD25+PD-1 水平對(duì)膿毒癥急性肺損傷患者預(yù)后存在一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，膿毒癥急性肺損傷患者CD4+、CD8+、CD4+CD25+Treg 細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著改變，CD4+PD-1、CD8+PD-1、CD4+CD25+PD-1 表達(dá)水平增加且對(duì)患者預(yù)后存在一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。