邢益俊，劉傳栩，楊愛君，何 瑛，紀(jì)坤發(fā)

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 510507

0 引言

鈣是人體含量最多的礦物質(zhì)元素，也是骨骼健康不可缺少的元素，適當(dāng)補充鈣能促進(jìn)青少年生長發(fā)育，預(yù)防中老年骨質(zhì)疏松、牙齒松動和心血管疾病[1]。牛乳含豐富的鈣，很容易吸收，是人體補充鈣的最佳選擇之一[2]。市場中乳制品品類多樣，消費者也比較關(guān)注營養(yǎng)成分含量。鈣作為重要的營養(yǎng)指標(biāo)之一，乳中鈣含量是實驗室日常檢測的重要項目。如何準(zhǔn)確檢測乳中鈣含量，是實驗室工作人員首先考慮的問題。受環(huán)境、儀器設(shè)備和人員操作方法等多因素影響，可能導(dǎo)致測量結(jié)果不準(zhǔn)確和誤差[3]。測量不確定度是測量系統(tǒng)最基本、最重要的特性指標(biāo)，是測量結(jié)果的重要標(biāo)志。測量不確定度越小，說明測定結(jié)果越準(zhǔn)確[4，5]。

本試驗采用GB 5009.92—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)_食品中鈣的測定》標(biāo)準(zhǔn)中第一法，用火焰原子吸收光譜法測定牛乳中鈣含量。該方法靈敏度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、快速，是目前測定牛乳中鈣含量最常用方法之一[6]。按照CNAS-GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[7]和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[8]評定試驗的不確定度，分析與評定牛乳中鈣含量檢測結(jié)果帶來不確定度的關(guān)鍵因素，為檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可信度提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生牛乳，來源自陽江紅五月良種奶牛場。

1.2 試劑

鈣單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 μg/mL），購自中國計量科學(xué)研究院；硝酸（65%，優(yōu)級純），購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；氧化鑭（4N，高純），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純），購自廣州化學(xué)試劑廠；試驗用水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)則和試驗方法》中規(guī)定的一級水。

1.3 儀器設(shè)備

Aanalyst原子吸收光譜儀（配有鈣空心陰極燈），美國珀金埃爾默公司；Multiwave PRO微波消解儀，安東帕（上海）商貿(mào)有限公司；趕酸機，上海博通化學(xué)科技有限公司；Mili-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；單道移液器和容量瓶（A級），德國Brand公司；METTER TOLEDO 204T電子天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 檢測原理

牛乳試樣經(jīng)微波消解儀消解后，加入氧化鑭溶液作為釋放劑，定容，直接吸入空氣-乙炔火焰中原子化，在422.7 nm處測定共振線，在一定范圍內(nèi)鈣含量與吸收值成正比。

1.4.2 檢測過程

使用火焰原子吸收光譜法測定牛乳中鈣含量的步驟見圖1。

圖1 火焰原子吸收光譜法測定牛乳中鈣含量

1.4.3 試劑及標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

氧化鑭溶液（50 g/L）配制：稱取29.32 g氧化鑭于干凈燒杯中，用少量水濕潤后加入125 mL鹽酸溶解，轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，多次用一級水潤洗燒杯，逐一轉(zhuǎn)入容量瓶中，定容至500 mL，搖勻備用。

鈣溶液標(biāo)準(zhǔn)儲備液（50 μg/mL）配制：用5 mL移液器準(zhǔn)確吸取鈣單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 μg/mL）2.5 mL于50 mL容量瓶中，用一級水定容至50 mL搖勻備用。

鈣溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液配制：用移液器準(zhǔn)確吸取鈣溶液標(biāo)準(zhǔn)儲備液（50 μg/mL）0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加入2.0 mL氧化鑭溶液，再加入1 mL硝酸，用一級水定容至50 mL，配制濃度0 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL。

1.4.4 樣品制備

準(zhǔn)確稱取牛乳0.25 g于微波消解內(nèi)管中，加入5 mL硝酸，緩慢旋緊螺蓋，按照微波消解儀程序步驟消解（表1）。冷卻后取出消解內(nèi)管，置于趕酸機中140 ℃趕酸至約剩1 mL，待消解液冷卻后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶（A級）中，用一級水沖洗內(nèi)蓋，一并轉(zhuǎn)移至該容量瓶中，再加入4 mL氧化鑭（50 g/L）溶液，最后用一級水定容至100 mL刻度，混勻備用，同時做空白試驗。

表1 微波消解儀程序步驟

1.4.5 檢測儀器工作條件參數(shù)設(shè)定

原子吸收光譜儀工作條件參數(shù)見表2。

表2 原子吸收光譜儀工作條件參數(shù)

1.4.6 檢測結(jié)果計算

根據(jù)GB 5009.92—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測定》，該方法的計算數(shù)學(xué)模型：

式（1）中：

X—試樣中鈣的含量，單位mg/100 g；

p—試樣待測液中鈣的質(zhì)量濃度，單位mg/L；

p0—空白溶液中鈣的質(zhì)量濃度，單位mg/L；

f —試樣消化液的稀釋倍數(shù)為1：

100、1 000—稀釋倍數(shù)；

V—試樣消化液的定容體積，單位mL；

m —試樣重量，單位g。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣含量測定不確定度分量的來源與分類

根據(jù)數(shù)學(xué)模型，引入不確定度的主要來源如下（表3和圖2）:

表3 鈣含量測定不確定度分量的來源與分類

圖2 測定不確定度因果關(guān)系

（1）樣品稱量（m）產(chǎn)生的不確定度；

（2）試樣消化液定容體積（V）產(chǎn)生的不確定度；

（3）鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液質(zhì)量濃度；

（4）重復(fù)測定試樣的不確定度。

2.2 鈣含量測定不確定度分量的量化

2.2.1 試樣稱樣量（m）不確定度

使用萬分之一天平（最大稱樣量220 g、感量0.1 mg）準(zhǔn)確稱量牛乳樣品0.250 g，檢定證書標(biāo)明測量結(jié)果的擴展不確定度U=0.5 mg，k=2，樣品稱樣量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（m）：

2.2.2 消化液定容體積（V）的不確定度

該消化液定容體積主要受兩個因素影響：校準(zhǔn)和溫度影響。

（1）微波消解后，消化液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶（A級），定容至刻度，依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，100 mL容量瓶（A級）的檢定證書上標(biāo)明，測量結(jié)果擴展不確定度U為0.050 mL，k=2。因此該容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（2）使用時和校準(zhǔn)時，溫度不同對溶液和容量瓶體積影響引入的不確定度按矩形分布計算。水膨脹系數(shù)2.1×10-4/℃，玻璃容器膨脹系數(shù)9.75×10-6/℃，從證書看到，該玻璃容器校準(zhǔn)時溫度20 ℃，而本實驗室溫度變動為±4 ℃，容器瓶容積膨脹遠(yuǎn)小于液體體積膨脹，容量瓶膨脹可忽略不計。產(chǎn)生的體積變化為±（50×4×2.1×10-4）=±0.042 mL，采用矩形分布將溫度變化分量轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

由上述兩個分量合成可得試樣消化液定容的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

試樣消化液定容體積（V）的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的不確定度

（1）鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液引入的不確定度

本試驗所用鈣單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 μg/mL），由中國計量科學(xué)研究院提供，GBW（E）080118國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書（批次號：23012）注明其相對擴展不確定度U為5 μg/mL（k=2），鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（2） 鈣溶液標(biāo)準(zhǔn)儲備液及工作曲線溶液稀釋配制過程中移液器引入的不確定度

A：5 mL單道移液器的檢定證書標(biāo)明，該移液器容量相對誤差測量結(jié)果擴展不確定度為0.1%，U為5 μL（k=2），因此，5 mL可調(diào)移液器標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量（表4）：

表4 5 mL 移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

5 mL可調(diào)移液器相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

B：1 mL單道移液器的檢定證書標(biāo)明，該移液器容量相對誤差測量結(jié)果擴展不確定度為0.15%，U為1.5 μL（k=2），因此，1 mL可調(diào)移液器標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量（表4）：

1 mL可調(diào)移液器相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

C：配制鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液需要移取2.5 mL鈣單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液；配制鈣標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液。根據(jù)公式（13），可得單道可調(diào)移液器分別移取1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL液體體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度（表4）。

（3）鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液和鈣標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定容引入的不確定度

A：由于鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液、鈣標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制都用同批次的50 mL容量瓶（A級），其檢定證書標(biāo)明，測量結(jié)果擴展不確定度U為0.030 mL，k=2。該容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

B：使用時和校準(zhǔn)時溫度不同對溶液和容量瓶體積影響引入的不確定度，按矩形分布計算，水產(chǎn)生的體積變化為±0.042 mL，采用矩形分布將溫度變化分量轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

上述兩個分量合成可得50 mL容量瓶定容后的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

50 mL容量瓶定容后的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（4）鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的不確定度

使用5 mL的單道移液器準(zhǔn)確移取2.5 mL鈣單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 μg/mL）于50 mL容量瓶（A級）中，用一級水定容至刻度。配制濃度50 μg/mL的鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液。則鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（5）鈣標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液配制引入的不確定度

分別使用1 m L 和5 m L 單道移液器準(zhǔn)確移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL濃度50 μg/mL的鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液于5 個50 mL容量瓶（A級），加入2 mL氧化鑭（50 g/L）溶液，用一級水定容至刻度。配制濃度1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL和5.0 μg/mL的鈣標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。由于配制鈣標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液使用5 次鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液，鈣標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線共6 個濃度點，每個濃度點分別用原子吸收光譜儀檢測1 次，得到相應(yīng)吸光度A，以濃度為橫坐標(biāo)x，縱坐標(biāo)y為對應(yīng)吸光度，擬合后得曲線方程y=0.037 8x+0.001，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 8，將標(biāo)準(zhǔn)工資曲線各濃度值c帶入方程后結(jié)果見表5

根據(jù)公式再把表5里各個點的數(shù)值代入以下公式：

式中： u——擬合曲線的不確定度；

p——試樣的測量次數(shù)，p=1；

n——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度的個數(shù)，n=6；

x——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線實際檢測出的平均濃度，c0=2.500 2 μg/mL；

xi——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線各個濃度點實際檢測出的濃度，μg/mL；

a——曲線的斜率，=0.037 8；

SR——回歸曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差（殘差的標(biāo)準(zhǔn)差）；

y——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線各個濃度實際檢測出的吸光度；

yi——根據(jù)擬合曲線公式算出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線各個濃度的吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合帶來的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

鈣標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液質(zhì)量濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.5 試樣的重復(fù)性測定（Rep）引入的不確定度

在同樣條件下重復(fù)檢測牛乳試樣10 次，檢測結(jié)果見表6。

表6 牛乳試樣中鈣含量重復(fù)性試驗檢測數(shù)據(jù)

重復(fù)性試驗(Rep)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

即重復(fù)性試驗（Rep）引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

式中，n為牛乳試樣測定的重復(fù)次數(shù)，為測定牛乳試樣中鈣含量的平均值。

2.3 鈣含量測定合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定的分量

各不確定度分量值見表7。

表7 牛乳中鈣含量的不確定度來源匯總

試樣中鈣含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

試樣中鈣含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc（試樣）

2.4 鈣含量的擴展不確定度

取置信概率P為95%時，k=2，則該牛乳中鈣含量的擴展不確定度：

3 結(jié)果報告

取95%置信概率P，k=2，該牛乳樣品中鈣含量的測定結(jié)果可表示X= +U=（123.8±3.22）mg/100 g。

4 結(jié)論

從不確定度的評定過程可看出，鈣標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液質(zhì)量濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度較大，其次是重復(fù)性測定引入的不確定度，試樣稱量與溶液定容體積引入的不確定度較小。鈣標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液質(zhì)量濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度較大的主要因素：鈣標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制和其擬合引入的不確定度。因此，配制儲備液時盡量減少稀釋次數(shù)，配制鈣標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的濃度點不宜過多，對檢測儀器和移液器定期校準(zhǔn)、維護(hù)保養(yǎng)，保持性能良好。