孟子恒 魏敬遠 宋蓮軍 齊澤倩 喬明武 黃現青 海丹

苯乳酸、甲酸、乙酸、丙酸等是微生物發(fā)酵過程中產生的有機酸的主要成分，這些有機酸可以通過降低微生物生長環(huán)境體系的pH抑制病原菌生長繁殖，并由此發(fā)揮生物防腐作用。在食品行業(yè)，由微生物發(fā)酵代謝產生的次級代謝產物具有提高食品口感、增強營養(yǎng)、延長保質期等優(yōu)點，因此將食品發(fā)酵產生的次級代謝產物提取制備后用于食品相關的生物防腐，能夠有效提高食品的安全性以及消費者的消費信心。

相比于傳統(tǒng)的食品抑菌劑對細菌類微生物的抑制作用，作為食品組成成分的發(fā)酵醋粉對各類食品中微生物均有不同程度的抑制作用，其營造的酸性環(huán)境不利于細菌的生存，可以間接達到殺菌消毒的作用，從而延長保質期并增強產品風味，可廣泛應用于醬鹵肉、香腸、肉餅等熟肉或熟食制品，面包、吐司等烘焙食品，沙拉醬、醬汁、蘸醬等復合調味品，濕面制品，腌漬蔬菜制品，以及各種風味奶酪的加工等。

本研究采用平板計數法，對比研究了河南偉創(chuàng)生物科技有限公司生產的3種發(fā)酵有機酸產品對5種細菌的抑制效果。本實驗中所采用的發(fā)酵有機酸是基于標簽友好成分的天然產品，通過使用非轉基因玉米、大米、食用酒精等一種或幾種為原料，經過一定周期的液態(tài)深層兩步發(fā)酵，通過噴霧干燥或者真空冷凍干燥獲得天然固態(tài)調味料，所制備的物質含有有機酸、多酚、維生素、微量元素、酚酸（原兒茶酸、二氫阿魏酸、二氫芥子酸等）、多肽及類黑精等營養(yǎng)成分，以期為食品工業(yè)中的殺菌工藝和防腐劑復配提供理論支持。

一、材料與設備

1.菌株與試劑。（1）供試菌株：單增李斯特菌ATCC19115（G+）、曲霉菌、酵母菌、大腸桿菌（G-）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（G+）。（2）供試試劑：5°發(fā)酵醋粉、20°發(fā)酵醋粉、液體發(fā)酵醋（河南偉創(chuàng)生物科技有限公司），霉菌和酵母菌培養(yǎng)液體，PDA培養(yǎng)基（霉菌和酵母菌固體培養(yǎng)基），LB培養(yǎng)基，瓊脂粉，無菌水，鹽酸，氫氧化鈉，生理鹽水（0.85%）。0.1mol/L的氫氧化鈉標準滴定溶液：按GB/T 601《化學試劑 標準滴定溶液的制備》，配制與標定0.1mol/L的氫氧化鈉標準滴定溶液，0.01mol/L或0.05mol/L的氫氧化鈉標準滴定溶液（用時當天稀釋）。1%酚酞指示劑溶液：將1g酚酞溶于60mL的95%乙醇（GB/T 679-2002《化學試劑 乙醇》）中，用水稀釋至100mL。

2.儀器與設備。DH420恒溫培養(yǎng)箱（上海樹立儀器儀表有限公司）；FXB303-2恒溫培養(yǎng)箱（上海樹立儀器儀表有限公司）；生物安全柜（1379）；pH計（PHS-3C）；滅菌鍋（KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC KG-SX-500）。

二、試驗與方法

1.醋粉pH值的測定。根據GB 5009.237-2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》中的方法進行測定。

2.含有發(fā)酵醋粉培養(yǎng)基的配制。分別根據空白對照組、0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、2.0%、2.5%的抑菌劑（5°醋粉、20°醋粉、液體醋）添加到已滅過菌的固體培養(yǎng)基中，倒平板，備用。

3.指示懸菌液的制備。將用甘油保存的單增李斯特菌按照1%-2%的接種量接種到LB培養(yǎng)基中，在（30±1）℃條件下，以150r/min培養(yǎng)18-24h；將大腸桿菌接種到LB肉湯培養(yǎng)基中，在（37±1）℃條件下，以150r/min培養(yǎng)18h；將嗜熱芽孢桿菌在（55±1）℃條件下，以180r/min培養(yǎng)10h；將用甘油保存的根曲霉菌和酵母菌按照1%-2%的接種量接種到霉菌液體培養(yǎng)基中，分別在（29±1）℃和（33±1）℃的條件下，以150r/min培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結束后，分別各取1mL菌液，用無菌生理鹽水按照1：10的比例稀釋到合適的濃度（稀釋108）待用。

4.涂布法檢測抑菌劑對微生物的抑制。根據國標GB 4789.2-2016涂布法檢測抑菌液對微生物的抑制情況，稀釋涂布平板法的優(yōu)點是便于計數和觀察菌落特征。

三、結果與分析

1.不同醋粉產品pH值的測定結果。不同醋粉產品pH值的測定結果如表1所示。從表1可以看出，3種產品在100mL無菌水條件下的pH值相同（p＜0.05），添加0.05mL抑菌劑后，20°醋粉和液體醋的pH下降明顯；隨著抑菌劑體積的不斷增加，20°醋粉和液體醋的pH分別持續(xù)下降至5.04和5.05。5°醋粉的pH值變化不明顯，從不添加抑菌劑時的5.88下降到2.5mL抑菌劑下的5.66。三個呈酸性的固體培養(yǎng)基均不影響后續(xù)抑菌結果。

2.不同醋粉產品抑菌率的測定。不同醋粉產品抑菌率的測定結果如圖1所示。從圖1-A可以看出，5°醋粉在0.6%濃度下對大腸桿菌的抑菌率為83%，對嗜熱芽孢桿菌的抑菌率為95%；在2.0%濃度下對酵母菌和霉菌可以達到100%抑菌；針對單增李斯特氏菌，在0.9%濃度下抑菌率為93%，在1.2%濃度下實現100%抑菌。從圖1-B可以看出，20°醋粉在0.6%濃度下可以對大腸桿菌和嗜熱芽孢桿菌實現100%抑菌；在1.5%濃度下對酵母菌的抑菌率達到100%；在2.0%濃度下對霉菌的抑菌率達到100%；針對單增李斯特氏菌，在0.9%濃度下實現100%抑菌。從圖1-C可以看出，液體醋在0.9%濃度下實現對大腸桿菌100%抑菌；在0.9%濃度下實現100%抑菌；在2.5%濃度下對霉菌的抑菌率為55.8%，對酵母菌的抑菌率為56.7%；針對單增李斯特氏菌，在1.5%濃度下實現完全抑菌。

綜上，在pH=7.0的中性介質環(huán)境下，添加0.6%及以上的5°醋粉對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌率可達100%，添加1.5%及以上對曲霉菌的抑菌率可達100%，添加2.0%及以上對酵母菌的抑菌率可達100%；添加0.3%及以上的20°醋粉對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌率可達100%，添加1.5%及以上對曲霉菌的抑菌率可達100%，添加2.0%及以上對酵母菌的抑菌率可達100%；添加0.6%及以上的液體醋產品對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌率可達90%-100%，添加2.5%及以上對曲霉菌和酵母菌的抑菌率分別為55.8%和56.7%。

四、討論與結論

微生物污染是影響食品安全的重要因素，應用防腐劑雖可延長食品的保質期，但是化學合成食品防腐劑因其成分及使用量問題，無法打消消費者對其安全存在的疑慮，因此發(fā)展天然食品防腐保鮮技術成為必然趨勢。有機酸在食品中作為防腐劑和保鮮劑已有數百年的應用歷史，具有調節(jié)食品風味、抑制病源菌增生、延長食品貨架期等多種作用。

本實驗通過使用3種發(fā)酵有機酸，對食品中常見的3種細菌、霉菌和酵母菌進行體外抑菌試驗，結果表明，這3種發(fā)酵有機酸均可抑制單增李斯特菌ATCC19115（G+）、大腸桿菌（G-）和嗜熱脂肪芽孢桿菌（G+）的生長，其中20°醋粉對幾種菌的抑菌效果最好；5°醋粉和20°醋粉在一定濃度下對曲霉菌、酵母菌可以達到100%的滅菌效果；液體醋雖不能達到100%的抑菌效果，但是可以有效抑制霉菌和酵母菌的生存繁殖。值得注意的是，三種產品都需要在較高的濃度范圍才能較好地抑制酵母菌和霉菌的生長，而且隨著pH值的變化，抑菌能力也不同。

綜上所述，本實驗以生活中常見的發(fā)酵醋粉作為原料，制作3種不同的產品，并明確3種不同產品對5種微生物的抑制效果，有助于后續(xù)研發(fā)出更為高效的天然產品抑菌劑。不過，目前對于有機酸作用機理的研究還停留在初級階段，后期仍需要對具體的抑菌作用分子等靶標及其機制進行深入研究。

基金項目：2022年河南省研究生聯合培養(yǎng)基地項目（YJS2022JD16）；河南省研究生教育改革與質量提升工程項目（研究生課程思政示范課項目，YJS2023SZ14）；河南省高等學校重點科研項目（23B550001）；河南農業(yè)大學本科教育教學改革研究與實踐項目：基于“SRPED”四循環(huán)可持續(xù)實踐教學模式的創(chuàng)新與探究。

作者簡介：孟子恒（2000-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物安全控制。

*通信作者：海丹（1987-），女，講師，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全、食品微生物安全控制。