邱 方，單美玲，丁小真，劉曉東，張嚴(yán)焱,2,3，石麗君,2,3*

（1.北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)生理學(xué)教研室，北京 100084；2.北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)與體質(zhì)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；3.國(guó)家體育總局運(yùn)動(dòng)應(yīng)激適應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；4.上海對(duì)外經(jīng)貿(mào)大學(xué)體育健康學(xué)院，上海 201620）

高血壓是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，我國(guó)目前有心血管病患者3.3 億，其中高血壓患者2.45 億（中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告編寫組，2023）。90%的高血壓屬于原發(fā)性高血壓，由環(huán)境因素及遺傳因素相互作用導(dǎo)致（Rossier et al.，2017）。健康與疾病的發(fā)育起源學(xué)說(shuō)（developmental origins of health and disease，DOHaD）認(rèn)為高血壓的疾病根源可追溯到胚胎發(fā)育的胎兒時(shí)期。母親孕期不良環(huán)境暴露（如妊娠期高血壓、肥胖、糖尿病、營(yíng)養(yǎng)不良、缺氧和吸煙等）會(huì)導(dǎo)致胎兒易受到不利的子宮內(nèi)環(huán)境干擾，增加子代成年后罹患高血壓的風(fēng)險(xiǎn)（Guarner-Lans et al.，2020），這一現(xiàn)象被稱為“高血壓的胎兒編程”（fetal programming of hypertension）（Alexander，2006）。表觀遺傳學(xué)是指基因的核苷酸序列不發(fā)生改變，而基因的表達(dá)和功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型變化，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA 調(diào)控，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用（Barker，1998； Wise et al.，2016）。胎兒發(fā)育關(guān)鍵可塑期是表觀遺傳學(xué)修飾的不穩(wěn)定“窗口期”（Safi-Stibler et al.，2020）。在此階段，對(duì)母親孕期生活方式的干預(yù)，如孕期運(yùn)動(dòng)、飲食調(diào)控等，可以重編程胎兒組織并產(chǎn)生永久性“印跡”，從而在一定程度上逆轉(zhuǎn)或延緩子代成年后心血管疾病的發(fā)展（Moholdt et al.，2020）。因此，從生命早期探索高血壓的發(fā)病機(jī)理，尋找診治新策略具有重要意義。

規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)作為治療高血壓、肥胖、2 型糖尿病等疾病的非藥物輔助手段在學(xué)術(shù)界得到廣泛認(rèn)可（Pelliccia et al.，2020）。母親孕期運(yùn)動(dòng)能否改善子代健康也受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究表明，孕期運(yùn)動(dòng)對(duì)母體、胎兒和子代成年后的心血管及代謝健康都具有短期和長(zhǎng)期的積極效應(yīng)（Barakat et al.，2016； Brislane et al.，2021； Harris et al.，2018）。已有證據(jù)表明孕期運(yùn)動(dòng)可預(yù)防母親妊娠期高血壓風(fēng)險(xiǎn)，控制子代出生時(shí)體重，同時(shí)減少子代患有慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)（Barakat et al.，2016）；孕期運(yùn)動(dòng)可以降低胎兒的靜息心率，增加心率變異性，這與訓(xùn)練有素的成人靜息時(shí)心臟反應(yīng)相似（May et al.，2010）；母親孕期運(yùn)動(dòng)可以降低子代12 周齡時(shí)頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度（Brislane et al.，2021），改善子代血管舒張功能（Bahls et al.，2014）。作為一種原發(fā)性高血壓的重編程動(dòng)物模型，關(guān)于自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）的前期研究發(fā)現(xiàn)，母親孕期運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)表觀遺傳學(xué)改變（如DNA 甲基化）重編程SHR 子代成年后的血管功能（Li et al.，2021； Shan et al.，2023），但其潛在機(jī)制尚未完全闡明。

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是動(dòng)脈血管壁的主要細(xì)胞類型，L 型電壓門控鈣通道（Ltype CaV1.2 channel，CaV1.2）是VSMC 膜上重要的Ca2＋通道，控制細(xì)胞外Ca2＋內(nèi)流，在高血壓的血管張力和血管收縮功能調(diào)節(jié)中起著重要作用（Joseph et al.，2013）。AKAP150 是A 激酶錨定蛋白（A-kinase anchoring protein，AKAP）家族成員，可將多種酶類聚集于特定細(xì)胞區(qū)域，從而提高信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率（Diviani et al.，2016）。在VSMC 中AKAP150 可錨定蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）α，靶向激活細(xì)胞膜上CaV1.2，產(chǎn)生持續(xù)性鈣星，通過(guò)“興奮-收縮”耦聯(lián)，增加血管張力，在血壓調(diào)節(jié)中起著重要作用；此外，AKAP150 基因全身敲除小鼠（AKAP150-/-）表現(xiàn)出低血壓特征且血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）無(wú)法誘導(dǎo)高血壓（Navedo et al.，2008）。前期研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制3 月齡SHR 動(dòng)脈平滑肌AKAP150“興奮-收縮耦聯(lián)”途徑，降低CaV1.2 功能，緩解血管張力增高，提示AKAP150 確為運(yùn)動(dòng)改善高血壓動(dòng)脈功能的重要靶點(diǎn)（張嚴(yán)焱 等，2020）。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，AKAP150 基因（Akap5）受表觀遺傳學(xué)調(diào)控，與組蛋白H3K9ac（組蛋白H3第9 位賴氨酸乙?；┬揎椕芮邢嚓P(guān)（Shepard et al.，2020）。但目前尚不清楚母親孕期運(yùn)動(dòng)是否通過(guò)調(diào)控高血壓子代Akap5基因組蛋白乙?；瘜?shí)現(xiàn)對(duì)子代血管功能的重編程。

因此，本研究選用SHR 和正常血壓Wistar-Kyoto（WKY）大鼠建立孕期游泳運(yùn)動(dòng)模型，探討母親孕期運(yùn)動(dòng)是否可重編程高血壓子代的血管功能及Akap5基因組蛋白乙酰化在其中的調(diào)控機(jī)制，旨在為高血壓生命早期的孕期運(yùn)動(dòng)干預(yù)及潛在靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方案

選用SPF 級(jí)、11 周齡雌性、12 周齡雄性的SHR 及其正常血壓對(duì)照WKY 大鼠作為配種鼠，均購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK（京）2021-0053。同品系雌、雄鼠交配，將見栓且見精子的雌鼠確定為孕鼠妊娠第1 天（gestation day 1，GD1）。之后將孕鼠隨機(jī)分為4 組，每組各24 只：WKY 孕期安靜組（p-WKYSED）、WKY 孕期運(yùn)動(dòng)組（p-WKY-EX）、SHR 孕期安靜組（p-SHR-SED）和SHR 孕期運(yùn)動(dòng)組（p-SHR-EX）。運(yùn)動(dòng)組孕鼠需進(jìn)行孕期無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練（水深為40 cm，水溫為34～35 ℃），孕期前4 天為適應(yīng)性訓(xùn)練，從GD1 開始訓(xùn)練20 min/d，之后每天遞增10 min，到GD5 進(jìn)入正式訓(xùn)練，60 min/d，6 天/周，直至GD20 結(jié)束，具體孕期運(yùn)動(dòng)方案參考Volpato 等（2009）。為避免水環(huán)境對(duì)孕鼠的影響，將安靜組孕鼠放置于水深10 cm 的相同水環(huán)境中作為對(duì)照。

由于在高血壓的胎兒編程動(dòng)物模型中，子代雄性患高血壓的風(fēng)險(xiǎn)高于雌性（Dasinger et al.，2016；Grigore et al.，2008），選取雄性子代胚胎21 天（embryonic day 21，ED21）胎鼠和3 月齡（3 month old，3M）大鼠為研究對(duì)象。子代安靜飼養(yǎng)至3M，采用CODA 尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)血壓系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠清醒安靜狀態(tài)下的收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）和平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）。各組孕鼠食用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物繁殖專用飼料，子代大鼠給予國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物專用飼料，自由進(jìn)食、飲水，分籠飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動(dòng)物房，濕度45%～55%，溫度22～24 ℃，12 h 晝夜光照循環(huán)。

1.2 微血管環(huán)張力測(cè)定

子代3M 雄鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，開腹取出腸系膜動(dòng)脈（mesenteric arteries，MAs），剝離周圍脂肪組織并制備3 級(jí)MAs 血管環(huán)，使用鎢絲將其固定于離體微血管環(huán)張力測(cè)定儀（620 M，DMT，丹麥）的浴槽中，槽中含有5 mL Krebs 緩沖液（mmol/L）：131.5 NaCl、5 KCl、1.2 NaH2PO4、1.2 MgCl2、2.5 CaCl2、11.2 glucose、13.5 NaHCO3和0.025 EDTA，pH 為7.4，持續(xù)通95% O2和5% CO2。使用LabChart 軟件系統(tǒng)（AD Instruments，澳大利亞）的DMT 標(biāo)準(zhǔn)化模塊設(shè)定各個(gè)血管環(huán)的最佳初始張力（IC100），平衡60 min 左右。將60 mmol/L KCl 刺激血管收縮的最大張力幅值作為100%最大收縮張力（%Kmax）。在正式藥物加入之前，加入一氧化氮合酶抑制劑Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME，10-4mol/L）孵育20 min，用以排除內(nèi)皮功能的影響。為了觀察CaV1.2 通道在血管張力中的調(diào)節(jié)作用，分別加入CaV1.2 通道激動(dòng)劑Bay K8644（BayK，10-5mol/L）、在去甲腎上腺素（norepinephrine，NE，10-5mol/L）預(yù)收縮達(dá)到平臺(tái)后加入CaV1.2 通道阻斷劑 Nifedipine（Nif，10-9～10-5mol/L）測(cè)定血管反應(yīng)性。

1.3 膜片鉗電生理記錄

子代3M 雄鼠麻醉后，取2～3 級(jí)MAs 采用酶-機(jī)械消化法急性分離VSMC（Shi et al.，2015）。采用傳統(tǒng)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄CaV1.2 通道全細(xì)胞鈣電流，記錄方案為：VSMC 鉗制電壓為-80 mV，-70～＋70 mV給予連續(xù)脈沖電壓，階躍為 10 mV，刺激時(shí)間為200 ms。信號(hào)經(jīng)Axon 700B amplifier 放大，低通濾波為2 kHz，采樣頻率為10 kHz。采用Clampfit 10.2 軟件進(jìn)行A/D、D/A 轉(zhuǎn)換，采用pCLAMP 10.2 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。首先記錄基礎(chǔ)CaV1.2 通道全細(xì)胞電流，之后分別加入Bay K8644（5 μmol/L）及Nifedipine（100 nmol/L）觀察CaV1.2 通道電流變化。電極外液（mmol/L）：10 BaCl2、10 Hepes、5 glucose、1 MgCl2、124 choline chloride，用CsOH 調(diào)pH 至7.4，采用Ba2＋替代Ca2＋作為電荷載體以增大記錄電流。電極內(nèi)液（mmol/L）：130 CsCl、10 Hepes、3 Na2ATP、0.1 Na2GTP、1.5 MgCl2、10 glucose、10 EGTA 和0.5 MgATP，用CsOH 調(diào)pH 至7.3。

1.4 細(xì)胞免疫熒光

將子代3M 雄鼠MAs 采用酶-機(jī)械消化法進(jìn)行急性分離VSMC（Shi et al.，2015），貼壁于玻底培養(yǎng)皿30 min 左右，加入4%多聚甲醛固定 30 min。采用細(xì)胞標(biāo)記物5 μg/mL Alexa FluorTM594-conjugated 小麥胚芽凝集素（Wheat Germ Agglutinin，WGA）避光孵育VSMC 10 min。0.2% Triton X-100 膜打孔10 min；10%山羊血清封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)1 h。免疫反應(yīng)需滴加一抗Rabbit polyclonal to Anti-AKAP150 Antibody（1∶200，Millipore），4 ℃孵育過(guò)夜；次日晨加入熒光二抗Alexa FluorTM488 Goat anti-RabbitIgG antibody（1∶1 000）室溫孵育1 h。用抗淬滅封片劑（prolong gold antifade reagent）封片，24 h 后使用激光共聚焦成像系統(tǒng)（SP8 TCS，Leica，德國(guó)）進(jìn)行拍片：HC PL APO CS2 63×/1.40 油鏡，488/552 nm 激發(fā)光。采用ImageJ軟件進(jìn)行免疫熒光共定位分析，并采用RG2B 插件獲取共定位區(qū)域（Coloc）。

1.5 Western blotting

提取子代3M 雄鼠MAs 的總蛋白，測(cè)定樣品蛋白濃度，制備蛋白2 μg/μL 上樣體系；每個(gè)孔道加入10 μL 上樣蛋白、3%～8% Tris-Acetate 凝膠電泳分離蛋白；使用iBlot2 干轉(zhuǎn)儀將蛋白干轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，根據(jù)marker 剪取目的蛋白條帶，5% BSA 室溫封閉90 min；之后，將PVDF膜條帶分別放入對(duì)應(yīng)的一抗：Anti-AKAP150 Antibody（1∶500，Milipore）、H3K9ac（1∶1 000，Abcam）、H3（1∶1 000，Abcam）、β-actin Antibody（1∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜。第二天，加入對(duì)應(yīng)二抗anti-rabbit IgG-HRP 或anti-mouse IgGHRP（1∶10 000，Proteintech Group）孵育1 h。配制ECL 化學(xué)發(fā)光液（1∶1），均勻地滴加到PVDF 膜上，置于Bio-Rad ChemiDOC XRS＋凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.6 qPCR

根據(jù)TRIzolTMPlus RNA Purification Kit（Cat.No.12183555，Thermo Fisher）說(shuō)明書提取子代3M 雄鼠腸系膜動(dòng)脈組織的總RNA。采用NanoDrop 紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。采用Maxima First Strand DNA Synthesis Kit（K1671，Thermo Fisher）反轉(zhuǎn)為cDNA，配制20 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：25 ℃ 10 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。根據(jù)Power SYBR Green PCR Master Mix（A25742，Thermo Fisher）配制10 μL 擴(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；40 個(gè)循環(huán)（95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s）。引物序列見表1。目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer Sequence of qPCR

1.7 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP-qPCR）

取子代雄性ED21 胎鼠的腸系膜動(dòng)脈組織，使用1%甲醛交聯(lián)15 min，之后采用終濃度125 mmol/L 甘氨酸終止交聯(lián)反應(yīng)。加入蛋白酶抑制劑破碎組織分離細(xì)胞，研磨2 min，收集并裂解細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞核。采用超聲5 min破碎DNA，獲得200～1 000 bp 之間的DNA 片段。之后取20%片段化的染色質(zhì)作為Input 組，置于-20 ℃保存待用。剩余的DNA 片段化用于免疫共沉淀，分別加入ChIP 級(jí)別的抗體H3K9ac（ab10812，Abcam）作為IP 組、加normal rabbit IgG（Cell Signaling Technology，美國(guó)）作為陰性對(duì)照NC組，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入DynabeadsTMProtein G磁珠至IP組和NC組，形成磁珠-抗體-蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物；磁力架沉淀磁珠，用低鹽溶液、高鹽溶液、LiCl 溶液和TE 溶液依次洗滌，棄掉未結(jié)合的DNA 上清，純化并洗脫蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物。之后用蛋白酶K 和ChIP 洗脫緩沖液在62 ℃下孵育2 h，解離交聯(lián)DNA-蛋白復(fù)合物，得到DNA片段。然后用酚/氯仿/異戊醇混合液（25∶24∶1）提取純化DNA，70%乙醇沉淀，風(fēng)干沉淀后，加入20 μL 10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0 溶解沉淀，測(cè)定DNA 濃度。采用qPCR 檢測(cè)純化后DNA 中Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K9ac 富集程度。在大鼠Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)ChIP-qPCR 引物序列為：正向引物5’-ACGGACTACAAGGTCGCCAG-3’，反向引物5’-CCCCAGAAAACCCCTAAAGAA-3’。ChIPqPCR 數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SEM）表示，采用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各年齡段4 組之間的數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（高血壓×運(yùn)動(dòng)），P＜0.05 表示具有顯著差異，P＜0.01 表示具有非常顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 孕期運(yùn)動(dòng)增加高血壓子代胎鼠的胎盤效率

如圖1 所示，p-SHR-SED 組子代雄性ED21 胎鼠體重均明顯低于p-WKY-SED 組，孕期運(yùn)動(dòng)可明顯增加p-SHREX 組雄性ED21 胎鼠體重（P＜0.01）。p-SHR-SED 組ED21胎盤重量明顯高于p-WKY-SED 組，但孕期運(yùn)動(dòng)對(duì)胎盤重量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。p-SHR-SED 組ED21 胎盤效率均明顯低于p-WKY-SED 組，孕期運(yùn)動(dòng)可明顯增加p-SHREX 組胎盤效率（P＜0.01）。

圖1 高血壓子代ED21胎鼠的胎盤效率Figure 1.Placental Efficiency in Hypertensive ED21 Fetal Rats

2.2 孕期運(yùn)動(dòng)降低高血壓子代3M大鼠血壓

如表2 所示，與p-WKY-SED 組相比，子代3M 大鼠雄性p-SHR-SED 組的SBP、DBP 和MAP 均顯著增加（P＜0.01），孕期運(yùn)動(dòng)可明顯降低雄性子代p-SHR-EX 組SBP（P＜0.01）、DBP（P＜0.05）和MAP（P＜0.05）。

表2 高血壓子代3M大鼠血壓Table 2 Blood Pressure in 3M Hypertensive Offspring RatsmmHg

2.3 孕期運(yùn)動(dòng)抑制高血壓子代3M 大鼠CaV1.2 通道功能上調(diào)

如圖2 所示，Bay K8644（10-5mol/L）可誘導(dǎo)各組子代3M 大鼠血管收縮，Bay K8644 誘導(dǎo)的血管張力以%Kmax表示。p-SHR-SED 組子代3M 雄鼠的Bay K8644 誘導(dǎo)血管收縮反應(yīng)明顯高于p-WKY-SED 組（P＜0.01），p-SHR-EX 組Bay K8644 收縮反應(yīng)明顯低于p-SHR-SED 組（P＜0.01）。此外，在NE（10-5mol/L）誘發(fā)血管收縮達(dá)到平臺(tái)期后，給予劑量累積性Nif（10-9～10-5mol/L）可誘導(dǎo)血管舒張。Nif誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)以NE（10-5mol/L）誘導(dǎo)血管收縮作為100%Kmax，用pIC50表示藥物達(dá)到50%抑制效果時(shí)所對(duì)應(yīng)的有效濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，評(píng)價(jià)MAs 對(duì)Nif 藥物敏感性。各組子代3M 雄鼠對(duì)Nif 藥物敏感性（pIC50）表現(xiàn)為：p-SHRSED 組＞p-WKY-SED 組（P＜0.01），p-SHR-SED 組＞p-SHR-EX 組（P＜0.05），p-WKY-EX 組＞p-WKY-SED 組（P＞0.05）。

圖2 CaV1.2通道在調(diào)節(jié)高血壓子代3M大鼠血管張力中的作用Figure 2.Role of CaV1.2 Channels in the Regulation of Vascular Tone in 3M Hypertensive Offspring Rats

如圖3 所示，在各組子代3M 雄鼠中，CaV1.2 通道激動(dòng)劑Bay K8644（5 μmol/L）可增加Ca2＋內(nèi)向電流峰值（＋10 mV），促使峰值Ca2＋電流密度從＋10 mV負(fù)向轉(zhuǎn)移至0 mV，而CaV1.2 通道阻斷劑Nif（100 nmol/L）幾乎完全阻斷了內(nèi)向Ca2＋電流，提示記錄的內(nèi)向Ba2＋電流確實(shí)是通過(guò)CaV1.2 通道開放產(chǎn)生。采用CaV1.2 通道電流相對(duì)膜電容（pA/pF）表示電流密度，以去除由于細(xì)胞表面積不同對(duì)CaV1.2 通道電流造成的影響，得到電流-電壓（I-V）曲線圖。p-SHR-SED組子代3M 雄鼠的CaV1.2 通道全細(xì)胞最大鈣電流密度明顯高于p-WKY-SED 組（P＜0.01）；p-SHR-EX 組CaV1.2 通道電流密度明顯低于p-SHR-SED 組（P＜0.05）。

圖3 高血壓子代3M大鼠CaV1.2通道電流圖Figure 3.CaV1.2 Channel Currents Recorded in 3M Hypertensive Offspring Rats

2.4 孕期運(yùn)動(dòng)下調(diào)高血壓子代3M 大鼠 AKAP150表達(dá)抑制CaV1.2通道功能增強(qiáng)

如圖4a 所示，p-SHR-SED 組子代3M 雄鼠AKAP150蛋白表達(dá)均顯著高于p-WKY-SED 組，p-SHR-EX 組AKAP150 蛋白表達(dá)明顯低于p-SHR-SED 組（P＜0.01）。

圖4 高血壓子代3M大鼠AKAP150 蛋白表達(dá)和VSMC膜定位Figure 4.AKAP150 Protein Expression and VSMC Membrane Localization in 3M Hypertensive Offspring Rats

在免疫熒光激光共聚焦成像中，采用能與細(xì)胞膜糖復(fù)合物結(jié)合的WGA 標(biāo)記VSMC 細(xì)胞膜。如圖4b 和4c 所示，各組子代3M 大鼠均有AKAP150（綠色）與WGA（紅色）的共定位熒光信號(hào)（黃色區(qū)域），AKAP150（綠色）熒光信號(hào)雖然基本分布于VSMC 細(xì)胞膜表面，但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有少量表達(dá)。共定位分析結(jié)果顯示，在MAs VSMC 中，p-SHR-SED 組子代3M 雄鼠AKAP150 與WGA 共定位免疫熒光信號(hào)均顯著高于p-WKY-SED組；p-SHR-EX組AKAP150與WGA 共定位免疫熒光信號(hào)均明顯低于p-SHR-SED 組（P＜0.01）。說(shuō)明高血壓子代AKAP150 在VSMC 肌膜上表達(dá)明顯增加，孕期運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)下調(diào)AKAP150 表達(dá)改善高血壓雄性子代成年大鼠CaV1.2 通道功能。

2.5 孕期運(yùn)動(dòng)降低高血壓子代大鼠AKAP150 mRNA 和蛋白表達(dá)

如圖5 所示，在子代雄性胎鼠ED21 MAs 中，p-SHRSED 組AKAP150 蛋白表達(dá)明顯高于p-WKY-SED 組（P＜0.01），孕期運(yùn)動(dòng)可顯著降低p-SHR-EX 組AKAP150 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。

圖5 高血壓子代大鼠AKAP150 mRNA和蛋白表達(dá)Figure 5.AKAP150 mRNA and Protein Expression in Hypertensive Offspring Rats

qPCR 結(jié)果顯示，在子代雄性胎鼠ED21 和成年3M 大鼠MAs 中，p-SHR-SED 組Akap5mRNA 水平明顯高于p-WKY-SED 組（P＜0.01），孕期運(yùn)動(dòng)可顯著降低p-SHR-EX組Akap5mRNA 表達(dá)（P＜0.05）。

2.6 孕期運(yùn)動(dòng)降低高血壓子代大鼠Akap5 基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac水平

如圖6 所示，在子代雄性胎鼠ED21 和成年3M 大鼠MAs 中，p-SHR-SED 組H3K9ac 表達(dá)明顯高于p-WKY-SED組（P＜0.01），孕期運(yùn)動(dòng)可顯著降低p-SHR-EX 組H3K9ac表達(dá)（P＜0.05）。

圖6 高血壓子代大鼠Akap5基因啟動(dòng)子H3K9ac富集水平Figure 6.the H3K9ac Enrichment Level of Akap5 Gene Promoter in Hypertensive Offspring Rats

采用ChIP-seq 檢測(cè)高血壓大鼠子代ED21 胎鼠MAs H3K9ac 富集的基因，結(jié)果顯示Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)明顯的H3K9ac 富集峰（Peak）區(qū)域，具體位置為chr6：99356367-99357640（位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游-141 bp 至下游＋1132 bp），富集倍率為4.77 倍（P＜0.05），Peak 頂點(diǎn)位置距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為＋282 bp。因此，在Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)Peak 頂點(diǎn)位置處設(shè)計(jì)一對(duì)引物，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)＋242～＋385 bp。采用ChIP-qPCR 驗(yàn)證各組子代雄性胎鼠ED21 MAsAkap5基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K9ac 富集水平，p-SHR-SED 組Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K9ac 富集倍率明顯高于p-WKY-SED 組（P＜0.01），孕期運(yùn)動(dòng)可顯著降低p-SHR-EX 組Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K9ac 富集倍率（P＜0.01）。

3 討論

本研究結(jié)果表明孕期運(yùn)動(dòng)能夠降低高血壓子代MAs中Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac，抑制Akap5基因轉(zhuǎn)錄，下調(diào)AKAP150 蛋白表達(dá)。子代雄性成年3M 大鼠在出生后，由于表觀遺傳“印跡”，血管AKAP150 蛋白表達(dá)依然被抑制，進(jìn)而改善其血管功能，降低血壓。本研究發(fā)現(xiàn)Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac 可能是孕期運(yùn)動(dòng)改善高血壓雄性子代大鼠血管CaV1.2 通道功能的重要機(jī)制之一。

胎盤效率是指胎兒體重/胎盤重量，用于評(píng)價(jià)胎兒生長(zhǎng)情況。流行病學(xué)研究表明，出生體重過(guò)低和胎盤重量增加與子代成年后血壓升高密切相關(guān)，胎盤較大且出生體重較低的嬰兒其成年后血壓更高（Barker et al.，1990）。本研究發(fā)現(xiàn)，與WKY 大鼠相比，SHR 子代ED21 胎鼠體重較低且胎盤重量較大，胎盤效率下降，這與Johnston（1995）研究結(jié)果一致，說(shuō)明SHR 大鼠宮內(nèi)胎鼠生長(zhǎng)受限。這可能與妊娠期高血壓子宮血管阻力增加，導(dǎo)致子宮血流減少，胎盤灌注不良和胎鼠營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足有關(guān)（Hu et al.，2021）。本研究還發(fā)現(xiàn)，孕期運(yùn)動(dòng)可增加高血壓子代胎鼠體重、提高胎盤效率，這與多項(xiàng)前人研究結(jié)果一致（Abate et al.，2012； Gilbert et al.，2012），說(shuō)明孕期運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)高血壓子代胎鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。這可能與孕期運(yùn)動(dòng)能夠創(chuàng)造一種短暫的子宮缺氧環(huán)境有關(guān)，從而刺激胎盤血管新生，代償性增加了胎盤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)及運(yùn)輸功能，增加子宮-胎盤血流，促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育（Abate et al.，2012； Clapp，2003；Son et al.，2019）。

本研究發(fā)現(xiàn)孕期運(yùn)動(dòng)可顯著降低高血壓子代3M 成年雄鼠SBP、DBP 和MAP，這可能是由于孕期運(yùn)動(dòng)改善了宮內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)了胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育，降低了高血壓子代成年后雄性大鼠血壓。宮內(nèi)環(huán)境對(duì)子代成年后高血壓有重要影響，SHR 是人類原發(fā)性高血壓模型，采用SHR 與WKY大鼠之間胚胎移植或交叉哺乳喂養(yǎng)的相關(guān)研究已證明子宮環(huán)境和出生后環(huán)境對(duì)SHR 血壓發(fā)展的影響，將SHR 胚胎移植至WKY 子宮環(huán)境內(nèi)可明顯降低SHR 子代成年后的血壓（Lee et al.，2010）。說(shuō)明子宮環(huán)境改變可影響SHR成年后血壓，宮內(nèi)環(huán)境和遺傳基因共同決定血壓水平。

VSMC 收縮主要依賴于胞漿內(nèi)Ca2＋濃度增加，CaV1.2 是細(xì)胞外Ca2＋內(nèi)流誘發(fā)VSMC 收縮的主要途徑（Joseph et al.，2013）。VSMC 上CaV1.2 通道功能上調(diào)是高血壓的標(biāo)志性特征之一（Cheng et al.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)孕期運(yùn)動(dòng)可明顯抑制SHR 大鼠雄性成年子代CaV1.2 通道功能的上調(diào)，這與前期研究結(jié)果一致（張嚴(yán)焱 等，2018；Shi et al.，2015； Zhang et al.，2020）。SHR 大鼠VSMC CaV1.2 通道功能上調(diào)與其通道活性有關(guān)。Navedo 等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，AKAP150/PKCα 途徑激活是Ang II誘導(dǎo)高血壓VSMC中CaV1.2 通道活性增加并產(chǎn)生持續(xù)性鈣星所必需的，AKAP150 可錨定結(jié)合PKCα，靶向肌細(xì)胞膜上CaV1.2 通道，激活其通道以高活性持續(xù)性模式開放，產(chǎn)生持續(xù)性鈣星，導(dǎo)致動(dòng)脈肌細(xì)胞大量Ca2＋內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2＋濃度增加，進(jìn)而激活肌球蛋白輕鏈，誘導(dǎo)血管收縮，使血管張力增加（Nieves-Cintron et al.，2008）。而未能與AKAP150/ PKCα結(jié)合的CaV1.2 通道只能產(chǎn)生隨機(jī)短暫的低活動(dòng)性鈣星，導(dǎo)致有限的Ca2＋內(nèi)流（Nieves-Cintron et al.，2008； Santana et al.，2009）。且AKAP150-/-小鼠無(wú)法產(chǎn)生持續(xù)性鈣星，導(dǎo)致胞漿Ca2＋濃度下降，Ang II無(wú)法誘導(dǎo)高血壓發(fā)生（Navedo et al.，2008）。因此，AKAP150 是調(diào)節(jié)高血壓時(shí)VSMC 中CaV1.2通道功能上調(diào)所必需的。為了明確血管平滑肌AKAP150在血壓調(diào)控中的作用，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了平滑肌特異性過(guò)表達(dá)AKAP150 基因敲入模式小鼠（AKAP150 smKI），采用金標(biāo)準(zhǔn)的植入式生理信號(hào)無(wú)線遙測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)血壓發(fā)現(xiàn)，AKAP150 smKI小鼠SBP、DBP 和MAP 均顯著高于同齡野生型小鼠，說(shuō)明平滑肌AKAP150 過(guò)表達(dá)引起血壓升高。前期研究結(jié)果表明，在成年SHR 大鼠VSMC 中，AKAP150/PKCα 信號(hào)通路的激活是高血壓CaV1.2 通道活動(dòng)上調(diào)的原因，而有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制高血壓VSMC 中AKAP150 表達(dá)和PKCα 膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而減弱高血壓引起的CaV1.2 通道功能上調(diào)，證實(shí)血管平滑肌上AKAP150 是運(yùn)動(dòng)調(diào)控血壓的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（單美玲 等，2019； 張嚴(yán)焱等，2020）。本研究也發(fā)現(xiàn)，SHR 大鼠VSMC 肌細(xì)胞膜上AKAP150 定位和蛋白表達(dá)均明顯增加，孕期運(yùn)動(dòng)可顯著抑制SHR 雄性子代VSMC 肌膜上AKAP150 定位及蛋白表達(dá)的上調(diào)，提示血管平滑肌AKAP150 是孕期運(yùn)動(dòng)改善高血壓雄性子代CaV1.2 通道功能所必需的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)AKAP150 表達(dá)在高血壓雄性子代胎鼠和成年3M MAs 中均明顯上調(diào)，孕期運(yùn)動(dòng)可明顯抑制高血壓子代AKAP150 表達(dá)的上調(diào)，說(shuō)明孕期運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓子代胎兒時(shí)期AKAP150 表達(dá)的抑制作用一直持續(xù)至成年。孕期運(yùn)動(dòng)可明顯抑制高血壓雄性子代和成年大鼠MAs 中Akap5mRNA 表達(dá)上調(diào)，提示Akap5mRNA 表達(dá)受轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)控?；虮磉_(dá)受基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA 甲基化和組蛋白修飾調(diào)節(jié)。胎兒時(shí)期是表觀遺傳學(xué)修飾的“窗口期”，此時(shí)易受到環(huán)境的影響，對(duì)成年后個(gè)體高血壓的編程具有重要影響（Wise et al.，2016）。最近研究表明母體孕期運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)子代某些組織表觀遺傳學(xué)改變進(jìn)而改善子代長(zhǎng)遠(yuǎn)健康（Kusuyama et al.，2021； Li et al.，2021）。例如，孕期運(yùn)動(dòng)通過(guò)上調(diào)高血壓子代動(dòng)脈Agtr1a基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化進(jìn)而改善SHR 子代血管功能（Shan et al.，2023）。另有研究報(bào)道AKAP150 表達(dá)與組蛋白乙?；揎椕芮邢嚓P(guān)（Shepard et al.，2020）。組蛋白修飾作為另一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾方式，通過(guò)調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和可及性進(jìn)而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，一般認(rèn)為組蛋白乙?；纱龠M(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，而組蛋白去乙酰化則抑制基因轉(zhuǎn)錄（Stoll et al.，2018）。經(jīng)查閱UCSC 基因庫(kù)發(fā)現(xiàn)Akap5基因受表觀遺傳學(xué)調(diào)控，存在組蛋白H3K9ac 修飾，本研究發(fā)現(xiàn)孕期運(yùn)動(dòng)明顯抑制高血壓子代MAs H3K9ac 表達(dá)。由于大鼠基因庫(kù)中缺乏Akap5基因ChIP-seq 數(shù)據(jù)，無(wú)法進(jìn)一步檢測(cè)Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白乙?；疕3K9ac 水平，為了精確設(shè)計(jì)Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac 的ChIPqPCR 引物，本研究采用ChIP-seq 檢測(cè)SHR 胎鼠MAs H3K9ac 富集的基因，發(fā)現(xiàn)Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)明顯的富集峰（Peak），因此針對(duì)該富集Peak 頂點(diǎn)處設(shè)計(jì)ChIP-qPCR 引物。本研究發(fā)現(xiàn)孕期運(yùn)動(dòng)可顯著下調(diào)高血壓子代MAsAkap5基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac 富集水平，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，抑制Akap5基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)AKAP150蛋白表達(dá)。

雖然本研究闡明了Akap5基因組蛋白乙?；谠衅谶\(yùn)動(dòng)改善高血壓子代血管功能的作用，證實(shí)了孕期運(yùn)動(dòng)通過(guò)降低高血壓子代VSMC 中Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac，抑制Akap5基因表達(dá)，改善子代血管功能，但是母體孕期運(yùn)動(dòng)如何引起SHR 子代表觀遺傳學(xué)改變還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

母親孕期運(yùn)動(dòng)可降低高血壓子代腸系膜動(dòng)脈肌細(xì)胞中Akap5基因啟動(dòng)子區(qū)H3K9ac 水平，抑制Akap5基因轉(zhuǎn)錄，下調(diào)AKAP150 蛋白表達(dá)，進(jìn)而改善血管CaV1.2 通道功能，最終降低高血壓子代成年大鼠血壓。