陳易尋 羅家偉 朱 儉 孟 艷 季 敏 管懷進

白內(nèi)障為眼科常見疾病,是眼病患者主要的致盲原因之一。晶狀體混濁是其突出的臨床特征,常導(dǎo)致患者視力損害和失明。2012年據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,白內(nèi)障是僅次于屈光不正(43%)的第二大視力損害眼病(33%)[1]。糖尿病是一種嚴重危害人類健康的內(nèi)分泌代謝性疾病,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢,據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會預(yù)測,到2030年全球?qū)⒂?.39億糖尿病患者[2]。糖尿病發(fā)病率的增加也使得糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生率同樣上升,作為糖尿病常見的眼部并發(fā)癥,糖尿病性白內(nèi)障已成為人們視力損害的重要因素[3]。研究表明,糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生率較正常人高2～5倍,其發(fā)病率還會隨著糖尿病病程的發(fā)展而顯著增加,且糖尿病性白內(nèi)障的病理改變較年齡相關(guān)性白內(nèi)障出現(xiàn)得更早且更嚴重。因此,明確糖尿病性白內(nèi)障病理過程中關(guān)鍵的分子生物學(xué)機制,尋求早期發(fā)現(xiàn)及早期干預(yù)的最新手段,切實提高患者的生活質(zhì)量,具有極大的臨床與社會價值[4]。

目前人們認為,糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病是一個多因素參與的過程,涉及其中的機制包括多元醇代謝異常/滲透失衡、氧化應(yīng)激損傷以及蛋白質(zhì)糖基化等。不同的機制均會引起晶狀體相關(guān)蛋白表達、修飾以及蛋白間相互作用的改變。糖基化是用糖類修飾生物分子的過程,蛋白質(zhì)糖基化是一種對蛋白質(zhì)功能和折疊至關(guān)重要的翻譯后修飾,因為聚糖的附著改變了多肽的生物物理性質(zhì)。糖基化是一個極其復(fù)雜的調(diào)控過程,由于糖基化常發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi),核苷酸糖前體的可用性、糖基轉(zhuǎn)移酶水平和這些細胞器的活性共同參與了蛋白質(zhì)糖基化的發(fā)生和發(fā)展。因此,了解糖基化的過程對糖尿病性白內(nèi)障生物標志物的發(fā)現(xiàn)以及新的治療方法的挖掘至關(guān)重要。狹義上的糖基化指的是一個酶調(diào)節(jié)的過程,即糖分子在酶促作用下通過不同的化學(xué)連接結(jié)合到蛋白質(zhì)的氨基酸殘基形成糖苷鍵。廣義上的糖基化則包含了酶促糖基化及非酶糖基化。非酶糖基化又稱為糖化,是無需酶催化的條件下,蛋白質(zhì)和葡萄糖之間自發(fā)形成糖基化蛋白質(zhì)的過程[5]。本文就糖基化參與糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病的機制及其干預(yù)方法進行綜述,希望為糖尿病性白內(nèi)障的預(yù)防和治療提供參考。

1 酶促糖基化對晶狀體蛋白質(zhì)的影響

酶促糖基化主要可分為以下3種類型,分別是N-糖基化、O-糖基化與O-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)糖基化,其中又以N-糖基化和O-糖基化這兩種糖基化機制研究得較為深入。N-糖基化過程總是含有一個由兩個N-GlcNAc殘基和三個甘露糖殘基組成的五糖核心,而在O-糖基化中,聚糖可以附著在絲氨酸或蘇氨酸殘基上。O-GlcNAc糖基化過程是一種比其他聚糖類型更動態(tài)的修飾,因為它可以被O-GlcNAcase 酶可逆地去除。在O-GlcNAc糖基化過程中,單個GlcNAc單糖通過O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的β-連鎖連接到靶蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基上。與此同時,GlcNAc也可以通過O-GlcNAcase酶的活性從蛋白質(zhì)中去除,使其成為比其他聚糖更短暫的修飾[6]。

以上3種糖基化類型均能通過調(diào)節(jié)蛋白在細胞中的定位、蛋白穩(wěn)定性以及蛋白-蛋白相互作用來改變靶蛋白功能。在2型糖尿病患者的前囊膜中,除了膜和細胞質(zhì)標記外,還存在具有高刀豆蛋白A標記的核周小泡?？狗杭毎堑鞍卓贵w的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示與刀豆蛋白A共定位且與刀豆蛋白酶A共定位的凝集素印跡在約65 000處顯示出電泳條帶,其分子量大小與人類1型細胞角蛋白相對應(yīng)。這些結(jié)果均提示N-糖苷鍵連接的人1型細胞角蛋白的過度表達可能導(dǎo)致囊膜中斷,中斷的囊膜的選擇性通透能力下降,從而不同分子量的蛋白有機會進入晶狀體,促進了白內(nèi)障的發(fā)生與發(fā)展[7]。

此外,蛋白質(zhì)糖基化不足也會引起眼部病變,如先天性糖基化障礙(CDG)是一組遺傳性多系統(tǒng)疾病。I型CDG患者體內(nèi)脂鏈寡糖的組裝存在缺陷或被轉(zhuǎn)移到新生糖蛋白上,從而導(dǎo)致患者生理狀態(tài)下的糖基化修飾缺陷。約70%的Ia型CDG患者存在眼部異常,包括白內(nèi)障[8]。

2 非酶糖基化對晶狀體蛋白質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)的非酶糖基化是一系列復(fù)雜的非酶促反應(yīng)過程,蛋白質(zhì)中存在的ε-氨基(精氨酸或賴氨酸)和葡萄糖在體內(nèi)發(fā)生非酶促反應(yīng)形成Schiff堿和Amadori等早期糖基化產(chǎn)物,再通過氧化、重排、交聯(lián)等反應(yīng)生成不可逆的非酶糖基化終末產(chǎn)物(AGE)[9]。

高糖狀態(tài)下,AGE將積累于再生能力低、氧化應(yīng)激嚴重的組織,如眼球中。由于AGE具有廣泛且重要的生物學(xué)作用,其對糖尿病性白內(nèi)障的影響已成為近年來研究的熱點。目前研究認為,AGE主要通過以下幾種方式對晶狀體造成損傷:(1)使非酶糖基化修飾的蛋白發(fā)生交聯(lián);(2)與細胞表面AGE受體結(jié)合,干擾細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;(3)促進活性氧的過度產(chǎn)生,經(jīng)糖基化造成氧化應(yīng)激破壞組織;(4)誘導(dǎo)核內(nèi)DNA突變累積。

2.1 以交聯(lián)為手段直接改變蛋白質(zhì)功能

晶狀體中的蛋白質(zhì)壽命極長,且?guī)缀鯖]有更新周轉(zhuǎn),這為表觀遺傳修飾后蛋白質(zhì)的積累提供了可能。同時AGE對蛋白質(zhì)的修飾,可顯著抑制酶的活性[10]。在蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化后,即便患者良好地控制了血糖,蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與糖基化誘導(dǎo)劑之間仍可以通過聚合作用形成更大的分子,從而引起正常生理結(jié)構(gòu)的破壞[11]。除上述糖基化對結(jié)構(gòu)蛋白的改變外,AGE還促進了許多重要的細胞外基質(zhì)的增生和交聯(lián)。Hong等[12]發(fā)現(xiàn),AGE可誘導(dǎo)纖連蛋白、I 型膠原蛋白的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達。Twigg等[13]還發(fā)現(xiàn)AGE可上調(diào)結(jié)締組織生長因子和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白2的表達,它們是細胞外基質(zhì)合成和血管生成的有效誘導(dǎo)劑。這些發(fā)現(xiàn)表明 AGE可能會誘導(dǎo)與晶狀體上皮細胞纖維化相關(guān)的 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達,從而引起糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生與發(fā)展。

2.2 改變多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)免疫球蛋白家族跨膜蛋白是細胞外AGE以及其他種類蛋白質(zhì)和分子的主要受體。AGE-RAGE系統(tǒng)導(dǎo)致至少三種主要信號通路的激活:Ras/MAPK/NF-κB、JAK/STAT和Rac1/CdC42。這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑又通過NADPH氧化酶啟動活性氧的產(chǎn)生,并導(dǎo)致促炎細胞因子(如IL-6、TNF-α)、促血管生成因子(如VEGF-A、VCAM1)以及RAGE自身的表達增加[14]。

同時糖尿病性白內(nèi)障的進展還涉及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),EMT可能在上皮細胞纖維化中發(fā)揮作用,并參與晶狀體后囊膜混濁的病理過程。細胞外基質(zhì)-AGE通過激活 AKT/Snail 通路增強了 TGF-β2 介導(dǎo)的EMT反應(yīng),其中αB-晶狀體蛋白作為TGF-β2和AGE介導(dǎo)的信號通路之間的接頭發(fā)揮重要作用[15]。在人類晶狀體上皮細胞中,AGE-RAGE相互作用也可以啟動促炎信號級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致RAGE上調(diào)和NF-κB活化,進而誘導(dǎo)TGF-β的合成和TGF-β2介導(dǎo)的EMT[16]。

所以調(diào)控AGE-RAGE系統(tǒng)將成為開發(fā)新型臨床藥物可選擇的有效靶點。已有研究表明,槲皮素可通過抑制 TGF-β2/PI3K/Akt 的激活發(fā)揮增強細胞抗氧化能力、抑制醛糖還原酶AR活性和減少AGE產(chǎn)生的作用,有效改善高糖誘導(dǎo)的SRA01/04細胞的EMT[17]。Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn),3H-1,2-Dithiole-3-Thione(D3T) 能夠通過激活A(yù)MPK信號通路及消除 AKR1B1 誘導(dǎo)的糖尿病氧化應(yīng)激,保護晶狀體上皮細胞免受果糖誘導(dǎo)的EMT。

2.3 促進晶狀體蛋白質(zhì)的氧化

超氧化物歧化酶是晶狀體中主要的抗氧化酶,可通過將超氧化物自由基(O2-) 轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣起到抗氧化的作用。在糖尿病模型中人們發(fā)現(xiàn),超氧化物歧化酶能夠保護晶狀體對抗白內(nèi)障的發(fā)展[19]。因此抗氧化酶及還原物質(zhì)活性降低是白內(nèi)障發(fā)生的風(fēng)險因素之一。糖基化介導(dǎo)的抗氧化酶失活可能導(dǎo)致細胞內(nèi)抗氧化防御機制的紊亂,進而引發(fā)細胞內(nèi)的促氧化狀態(tài)并最終引起與糖尿病長期并發(fā)癥相關(guān)的各種病理變化[20]。與正常人晶狀體相比,糖尿病患者的晶狀體更容易受到氧化應(yīng)激的影響。糖基化誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變將使得未暴露的巰基被氧化,在糖尿病患者的晶狀體中,多元醇途徑的活性增加可能與糖基化過程協(xié)同作用共同導(dǎo)致二硫鍵的加速形成,最終引起還原型谷胱甘肽GSH水平降低[21]。還原型谷胱甘肽的減少則導(dǎo)致了晶狀體的氧化還原失衡。

對氧磷酶(PON)是一種具有芳基酯酶和硫乳糖酶活性的抗氧化酶, PON1和PON2在所有眼組織中均有表達,在眼球中起到了抗氧化的作用。生物信息學(xué)研究和體內(nèi)外實驗表明,AGE可能會降低PON芳基酯酶和PON硫乳糖酶活性,導(dǎo)致白內(nèi)障晶狀體的PON硫乳糖酶活性被顯著抑制,引發(fā)組織氧化還原失衡[22]。

各類抗氧化酶通常作為一個整體發(fā)揮作用,保護過氧化氫酶和過氧化物酶免受O2-的抑制,而過氧化氫酶和過氧化物酶保護超氧化物歧化酶免受過氧化氫的失活作用。如果抗氧化酶本身被糖基化誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激破壞,則會大大加劇氧化應(yīng)激帶來的損害。

2.4 核內(nèi)DNA突變累積

據(jù)報道,3-磷酸甘油醛和賴氨酸反應(yīng)生成的糖基化產(chǎn)物至少會對DNA造成三種不同的損傷:修飾的DNA堿基、無嘌呤/無嘧啶位點和鏈斷裂。其中,無嘌呤/無嘧啶位點具有潛在的致突變性[23]。

3 非酶糖基化對主要晶狀體蛋白質(zhì)的作用

晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白占總可溶性晶狀體蛋白的80%～90%,分為3種基本類型,分別是α-晶狀體蛋白、β-晶狀體蛋白和γ-晶狀體蛋白。晶狀體蛋白緊密堆積的空間排列順序?qū)S持晶狀體的透明性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。通過高效液相色譜HPLC分離糖化晶狀體蛋白,發(fā)現(xiàn)晶狀體蛋白糖化速率的排序為:α-晶狀體蛋白>β-晶狀體蛋白>γ-晶狀體蛋白[24]。

3.1 α-晶狀體蛋白

α-晶狀體蛋白是最主要的結(jié)構(gòu)蛋白,由αA和αB兩個亞基構(gòu)成,其在晶狀體內(nèi)的占比可達到總蛋白的50%,被認為是維持晶狀體透明度的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)及功能單位,它的伴侶功能可以與部分未折疊的蛋白質(zhì)相互作用以阻止聚集,保護其他蛋白質(zhì)免受熱聚集,同時這也有利于防止光散射聚集體的形成,保持眼睛晶狀體的透明度[25]。由于晶狀體蛋白質(zhì)在生物體的整個生命周期中會經(jīng)歷各種蛋白質(zhì)修飾,這使其高度易變和易聚集,因此這一作用對于防治白內(nèi)障至關(guān)重要[26]。對人晶狀體α-晶狀體蛋白的分析結(jié)果顯示,與年齡匹配的對照組相比,所有糖尿病患者晶狀體中的伴侶活性都較低。在半乳糖血癥大鼠晶狀體中同樣發(fā)現(xiàn)α-晶狀體蛋白伴侶活性受損。體外研究表明甲基乙二醛(一種糖酵解和氧化應(yīng)激途徑的中間產(chǎn)物)也會對人類α-晶狀體蛋白產(chǎn)生影響,暴露于甲基乙二醛會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開、疏水裂縫的破壞、熱穩(wěn)定性和熱力學(xué)穩(wěn)定性的降低以及蛋白質(zhì)伴侶活性的喪失[27]。

3.2 β-晶狀體蛋白

針對晶狀體中的糖基化β-晶狀體蛋白和γ-晶狀體蛋白及其循環(huán)自身抗體(IgG),Ranjan等[28]開發(fā)了一種非競爭性酶免疫分析法,檢測鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清,發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠晶狀體在第8周末時,抗γ-糖化晶狀體蛋白抗體的濃度比β-糖化晶狀體蛋白抗體的濃度高1.2倍。

3.3 γ-晶狀體蛋白

晶狀體核中含有豐富的可溶性γ-晶狀體蛋白,其穩(wěn)定的構(gòu)象可以承受壓力。但γ-晶狀體蛋白的糖基化可以導(dǎo)致其伴侶活性喪失,使得蛋白質(zhì)更容易被修飾,進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和或共價交聯(lián),最終引起白內(nèi)障[29]。對人γB-晶狀體蛋白糖基化傾向的理論研究表明,葡萄糖優(yōu)先與Gly1或Lys2結(jié)合[30]。體外由核糖、半乳糖、甲基乙二醛和甘油醛誘導(dǎo)的γB-晶狀體蛋白主要通過Lys-Arg和Lys-Lys殘基之間的交聯(lián)在N端糖基化α-氨基[31]。

4 結(jié)束語

目前人們對于糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機制仍未完全清楚。在糖尿病性白內(nèi)障中,糖基化修飾對晶狀體中各種蛋白質(zhì)及酶的影響與糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生與發(fā)展有著千絲萬縷的聯(lián)系。因此,明確糖基化過程對揭示糖尿病性白內(nèi)障病理進展的分子生物學(xué)機制以及有針對性地開發(fā)新型藥物尤為重要,具有很大的臨床意義。