張 琴，楊漫漫，張?jiān)?，李雪梅，楊潞，田志革，胡曉亮（通信作者），崔鵬博

（1.四川國際旅行衛(wèi)生保健中心（成都海關(guān)口岸門診部），四川成都 610042；2.成都海關(guān)，四川成都 610042；3.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川宜賓 644000；宜賓市動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫工程技術(shù)研究中心，四川宜賓 644000）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）為單鏈環(huán)狀DNA 病毒，無囊膜，是已知最小的動(dòng)物病毒之一。PCV 有4 種病毒類型，分別為PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4[1]。PCV1 通常認(rèn)為不具有致病性。PCV2 能夠引起宿主機(jī)體的免疫抑制，導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)生多系統(tǒng)衰弱綜合征、母豬的皮炎與腎病綜合征[2]和繁殖障礙的臨床癥狀[3-4]。2016 年，PCV3 首次發(fā)現(xiàn)于美國密蘇里州、明尼蘇達(dá)州和南達(dá)科塔州，感染后，使宿主患有心肌炎、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，母豬流產(chǎn)率增加，出現(xiàn)產(chǎn)死胎或木乃伊胎現(xiàn)象[5]。PCV3 的基因組全長1999～2001bp，包含3 個(gè)主要的ORFs，ORF1 編碼復(fù)制起始相關(guān)蛋白R(shí)ep 和Rep’由296～297 個(gè)氨基酸組成，是圓環(huán)病毒基因組最保守的區(qū)域。ORF2 編碼圓環(huán)病毒粒子中唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白，由214 個(gè)氨基酸組成，具有免疫原性。ORF3 能夠調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的非結(jié)構(gòu)蛋白，由231 個(gè)氨基酸組成。本研究從四川省宜賓市某豬場(chǎng)患有呼吸困難的仔豬血液中鑒定一株P(guān)CV3，命名為SC-YB2212，通過遺傳變異分析，了解SC-YB2212 的分子特征，為PCV3 分子流行病學(xué)研究和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

臨床樣本來源于2022 年10 月四川省宜賓市某養(yǎng)殖場(chǎng)，發(fā)病癥狀主要包括仔豬呼吸困難、氣喘等狀況，采集仔豬的血液。按照DNA 提取試劑盒說明書，提取豬的血液DNA 備用，存于-80℃。

1.2 主要試劑

病毒DNA 提取試劑盒，購自天根生物科技有限公司；膠回收試劑盒，購自愛思進(jìn)生物科技有限公司；pMD18T，DH5α，DL2000 marker、ExTaq酶、均購自TAKARA。

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用豬圓環(huán)病毒3 型鑒定引物R-F：5’-CCCCCATGGGGGGAGCGGTTTC-3’；R-R：5’-ATTCCGGGGCCGGTTTTCTC-3’對(duì)血液DNA 進(jìn)行PCR 鑒定。

1.4 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物由成都擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，鑒定的病毒株命名為SC-YB2212。

1.5 基因序列分析

從GenBank 中選擇不同基因型PCV3 全基因序列。利用DNAStar 軟件中的MegAlign Clustal W 計(jì)算法對(duì)SC-YB2212 的基因組序列進(jìn)行同源性分析，用MEGA6.0 比鄰法進(jìn)行遺傳變異分析，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，分析SC-YB2212 與參考毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。（見圖1）。

2 結(jié)果

2.1 基因序列的比較分析

SC-YB2212 與參考序列之間的同源性最高的為美國株KX898030（97.9%），與德國株MG014368的同源性最低為94.9%，與其他國內(nèi)株同源性較高（97.0%～97.7%）。SC-YB2212 與四川宜賓株SCYB2203 相比，衣殼蛋白同源性為98.6%，這表明宜賓地區(qū)的PCV3 抗原性多樣的情況。

2.2 SC-YB2203 遺傳進(jìn)化分析

使用MEGA6.0 軟件將SC-YB2212 與國內(nèi)外PCV3 核酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示SC-YB2212 與河北株 MF318449 和廣西株MG650174、云南株MG650176 屬于同一分支，與西班牙株MH579746 和美國株MK496280 親緣關(guān)系較近，與四川株MZ449244 和重慶株KY075992 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（見圖2）。

圖2 PCV3 衣殼蛋白遺傳進(jìn)化分析

3 討論

本研究通過采集呼吸困難仔豬的血液，進(jìn)行PCR 方法檢測(cè)和鑒定，獲得一株P(guān)CV3 序列，命名為SC-YB2212。序列分析顯示PCV3 沒有明顯的地域性，與國內(nèi)株P(guān)CV3 序列同源性為97%～97.9%。

遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)SC-YB2212 與河北株MF318449、廣西株MG650174、云南株MG650176 屬于同一分支，與西班牙株MH579746 和美國株MK496280 親緣關(guān)系較近，與四川株MZ449244 和重慶株KY075992 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這說明SCYB2212 與豬只頻繁調(diào)動(dòng)相關(guān)，導(dǎo)致毒株交叉?zhèn)鞑ァCV3 衣殼蛋白作為主要抗原性蛋白，而西南地區(qū)PCV3 存在多基因亞型并存現(xiàn)象，說明抗原性發(fā)生變異，因此，不同基因型存在是否影響致病性需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究鑒定了一株P(guān)CV3，SCYB2212，遺傳分析發(fā)現(xiàn)其與多株國外毒株和廣西株和云南株遺傳關(guān)系較近，與四川株和重慶株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，本研究有助于豐富西南地區(qū)PCV3 的基因型特征，為后續(xù)防控提供依據(jù)。