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        腺相關病毒衣殼蛋白修飾的研究進展

        2022-04-02 10:36:20陳倩影馬萃嬌呂亞豐曹春雨
        解放軍醫(yī)學院學報 2022年1期

        陳倩影,馬萃嬌,呂亞豐,曹春雨

        三峽大學醫(yī)學院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室,湖北宜昌 443002

        基因治療是以治療或治愈某種疾病為目的,引入、去除或改變遺傳密碼內(nèi)容,基于遞送編碼治療性蛋白質(zhì)或RNA作為基因編輯策略,在基因水平上治療疾病的方法[1]。選擇高效、安全的遞送載體是實現(xiàn)基因治療的首要問題。目前,基因治療主要采用的遞送載體系統(tǒng)有病毒載體[腺病毒載體、慢病毒載體[2]、腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)載體]、納米顆粒和脂質(zhì)體等。其中AAV載體具有基因容量較大、基因組不整合、無致病性等顯著優(yōu)勢,近年來已成為基因治療研究的主要遞送載體[3-4]。2012年以來,美國食品藥物管理局(FDA)批準基于多種AAV載體開發(fā)的基因治療藥物,如Glybera、Luxturna?和Zolgensma?分別用于遺傳性脂蛋白脂肪酶缺乏癥、Leber先天性黑蒙病和脊髓性肌萎縮癥的臨床治療[5]。鑒于衣殼蛋白靶向性修飾在AAV載體研究中的核心作用,本文就AAV及其衣殼蛋白靶向性修飾的新近研究進展做一綜述,并討論AAV衣殼改造在基因治療中的前景及應用。

        1 AAV生物學特性

        1.1 AAV 結構 AAV 屬于細小病毒科,是單鏈DNA病毒,基因組包含兩端的反向末端重復序列(inverted terminal repeats,ITRs)、轉錄調(diào)控區(qū)啟動子(P5、P19、P40)和兩個分別編碼Rep和Cap蛋白的開放閱讀框,全長4.7 kb(圖1)。ITRs是AAV基因組中必需的順式作用元件,其由180個堿基組成,是DNA復制、包裝和整合位點的起始位點并在單鏈DNA復制過程中起“引物”的作用[6]。Rep基因編碼病毒DNA復制和組裝需四種蛋白質(zhì)——Rep40、Rep52、Rep68和Rep78。Cap基因編碼來自兩個交替剪接mRNA的三個病毒衣殼蛋白——VP1、VP2和VP3,同時編碼組裝激活蛋白[7]。AAV衣殼VP1、VP2和VP3蛋白分子組裝成直徑約25 nm的二十面體粒子,其VP1、VP2和VP3蛋白分子的比例為1∶1∶10。

        圖1 AAV的基因組結構示意圖Fig.1 Schematic of AAV genome structure

        1.2 AAV 血清型及其細胞受體 AAV 病毒基因組中,ITR和Rep基因序列相對保守,而Cap基因序列則差異性較大,由此產(chǎn)生具有不同衣殼蛋白的AAV病毒。由于AAV病毒衣殼蛋白的氨基酸組成直接決定其組織親嗜性和感染細胞的能力,研究者以此為標準把近年來鑒定的來自人類或非人靈長類的AAV病毒分為13個血清型,即 AAV1 ~ AAV13[8]。具有代表性的是 AAV1 ~AAV9,比對 AAV1 ~ AAV9 的衣殼蛋白序列發(fā)現(xiàn),這9個AAV血清型的衣殼蛋白氨基酸序列一致性為58% ~ 99%,其中AAV1與AAV9衣殼蛋白氨基酸序列一致性達99%、與AAV2/3/6/7/8衣殼蛋白氨基酸序列一致性達82%以上[9]。這表明AAV衣殼氨基酸組成及結構是決定其組織親嗜性的關鍵,而現(xiàn)有研究已證明細胞表面多糖與AAV衣殼蛋白的結合是影響AAV感染細胞能力的重要因素。AAV成員轉導細胞的能力已被證明是由于其衣殼與不同細胞表面聚糖結合。細胞膜表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)是第一個被鑒定的AAV病毒細胞受體,其通過識別結合AAV2/3/6血清型衣殼突出部蛋白堿性區(qū)域(包含第585位和第588位精氨酸),使病毒附著于細胞表面,由此啟動AAV進入細胞的過程(圖2)[10]。此后,唾液酸和N末端半乳糖基化多糖也被證明是AAV病毒進入細胞的表面多糖受體[11-12]。目前,AAV病毒的細胞表面受體主要是三大類多糖,即HSPG受體(AAV2、AAV3和AAV6)、唾液酸受體(AAV1、AAV4、AAV5和AAV6)和半乳糖基化受體(AAV9)[13]。除多糖受體以外,2016年Pillay等[14]報道了一種介導AAV細胞轉導的蛋白質(zhì)受體AAVR(又稱為KIAA0319L)。AAVR是Ⅰ型跨膜蛋白,通過胞外Ig樣結構域(多囊腎病結構域)直接與鄰近二十面體三重軸的AAV2衣殼刺突蛋白相互作用,由此介導AAV2的入胞作用。

        圖2 AAV血清型受體分類Fig.2 Classification of AAV serotype receptors

        1.3 AAV 的組織嗜性和細胞轉導效率 不同AAV血清型對人體組織的嗜性和轉導效率顯著不同,盡管多數(shù)AAV都能在肝中富集,但AAV8具有脂肪組織嗜性[15]、AAV9具有心臟、肝、骨骼肌組織嗜性并能夠穿越血-腦脊液屏障富集于腦組織[16]。一方面,AAV的組織嗜性和細胞轉導效率主要依賴于衣殼蛋白結構,尤其是VP3與宿主細胞表面受體的相互作用;另一方面,當AAV進入宿主細胞后,AAV遞送基因在細胞內(nèi)的穩(wěn)定表達依賴于AAV從細胞內(nèi)體中釋放并進入細胞核,而這一過程與宿主細胞內(nèi)相關信號分子和衣殼蛋白VP1的相互作用有關[17]。

        2 AAV衣殼靶向性修飾

        如何通過改造AAV衣殼蛋白獲得具有組織或細胞靶向性的高效基因遞送載體是基因治療研究領域的核心問題。近年來,基于合理設計、定向進化和化學方法修飾等基因工程策略的AAV衣殼修飾已廣泛用于AAV基因靶向遞送研究。

        2.1 合理設計 合理設計,即通過基因工程技術改造衣殼蛋白編碼序列,從而賦予AAV靶向性或提高其基因轉導效率。已有大量研究證實,將組織和細胞靶向性短肽或蛋白質(zhì)編碼序列插入衣殼蛋白編碼序列,經(jīng)基因轉錄、翻譯后形成新的重組AAV衣殼蛋白,可獲得具有特定組織或細胞靶向性的重組AAV載體[18-19]。AAV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3由同一個啟動子P40驅(qū)動轉錄,然后分別在各自起始密碼子引導下翻譯,并最終以1∶1∶10的比例組裝形成病毒衣殼,短肽或蛋白質(zhì)的插入可直接改變衣殼蛋白結構,有可能影響病毒衣殼組裝。因此,插入位點通常在VP2起始密碼子后或VP3編碼區(qū)的非保守區(qū)域(可變區(qū)Ⅳ/Ⅴ/Ⅷ在衣殼蛋白表面形成Loop結構并能夠容納外源性多肽的插入),從而使得修飾肽段或蛋白暴露在衣殼蛋白表面并位于蛋白親水區(qū),有利于修飾肽或蛋白介導rAAV的靶向細胞轉導[20]。如肌肉細胞表面高表達胰島素受體,Jackson等[21]將胰島素受體結合肽S519編碼序列插入AAV9衣殼蛋白G543(可變區(qū)Ⅳ)和A589(可變區(qū)Ⅷ)位點,產(chǎn)生表面攜帶S519的rAAV9,成功實現(xiàn)了rAAV9的小鼠肌肉組織靶向基因遞送。

        AAV衣殼蛋白具有泛素化、糖基化、乙酰化、磷酸化、SUMO化等多種翻譯后修飾功能,這些單個或多個氨基酸的翻譯后修飾在AAV的細胞轉導、細胞內(nèi)脫衣殼和細胞核轉運過程中發(fā)揮重要作用[22]。AAV1/2/5/7/9和rh10的VP1、VP3蛋白N端具有乙?;揎?,并影響AAV進入細胞核前的降解和脫殼過程[23]。Frederick等[24]對AAV5衣殼蛋白分別進行S2G、S2P、S194P、S194G、S2G+S194G和S2P+S194P點突變。由于將乙?;稽c絲氨酸突變?yōu)楦拾彼岷透彼幔沟肁AV5的VP1、VP3蛋白N端不發(fā)生乙?;?S-P)或乙?;斤@著下降(S-G),由此可觀察N端乙?;瘜AV5衣殼蛋白組裝和轉導能力的影響。結果表明,VP1、VP3蛋白N端乙?;挥绊懸職さ鞍捉M裝,但S194G突變使得AAV5對小鼠視網(wǎng)膜外核層細胞和脈絡膜細胞轉導效率顯著增加。2021年,Crosson等[25]對AAV2衣殼蛋白進行V387R、W502H、E530K、L583R點突變使衣殼蛋白疏水性增加,結果發(fā)現(xiàn)AAV2的視網(wǎng)膜細胞轉導效率顯著下降。但如果同時進行AAV2衣殼蛋白R585A、R588A點突變(AAV2的HSPG受體結合位點),則顯著提高了AAV2對小鼠和非人靈長類動物恒河猴視網(wǎng)膜細胞的轉導效率。因此,突變AAV衣殼蛋白的特定翻譯后修飾位點能夠通過改變其表面電荷性質(zhì)、親/疏水結構等途徑顯著影響AAV的轉導效率、靶向性和遞送基因表達水平。

        2.2 定向進化 定向進化,即通過誘導蛋白質(zhì)編碼基因突變,產(chǎn)生具有定制特性的蛋白質(zhì)。經(jīng)典的AAV定向進化策略包括DNA shuffling、隨機多肽序列插入和噬菌體展示,由此制備AAV衣殼蛋白編碼序列的隨機重排序列文庫,包裝AAV,然后通過多輪體內(nèi)或體外的細胞和組織感染、富集、篩選步驟,獲得具有定制特性的AAV衣殼[26]。Liu等[27]以AAV1/2/3B/4/6/7/8/9衣殼編碼序列為基礎構建DNA shuffling文庫,以AAV2衣殼編碼序列為基礎構建多肽展示文庫,然后等比例混合兩種文庫,感染Tie2-GFP轉基因小鼠(由于該小鼠的內(nèi)皮細胞特異性表達GFP,可直接進行流式細胞術分選),通過提取小鼠心臟內(nèi)皮細胞進行PCR擴增篩選衣殼蛋白編碼序列、建立AAV文庫、感染小鼠內(nèi)皮細胞,并將這一過程多輪重復,最后獲得能夠靶向轉導小鼠心臟內(nèi)皮細胞的AAV 突變體。2020年,De Alencastro等[28]以“Barcode”標記AAV文庫、通過高通量測序跟蹤定向AAV衣殼的進化和轉導,結果發(fā)現(xiàn)這一策略的缺點主要在于:1)隨機效應;2)具有不同衣殼蛋白組成的AAV在轉導同一細胞時具有競爭效應;3)AAV文庫制備中采用的輔助病毒在此過程中將選擇性促進文庫中易復制AAV的生成。由于該策略是篩選AAV基因組DNA而非mRNA,這種多輪篩選策略反而對AAV轉導能力形成負性選擇。為優(yōu)化定向進化策略,2021年Tabebordbar等[29]報道了一種名為 DELIVER(directed evolution of AAV capsids leveraging in vivo expression of transgene RNA)的AAV載體衣殼定向進化方法,該方法基于合理性設計來制備多樣性衣殼蛋白文庫,以該AAV文庫感染小鼠、遞送編碼其自身衣殼蛋白基因并以該衣殼蛋白的mRNA為篩選對象,由此篩選具有組織特異性和高效轉導能力的rAAV衣殼蛋白序列。該研究具體步驟:在AAV9衣殼蛋白Ⅷ疏水區(qū)第588位和589位氨基酸位點中插入隨機組成的七肽(以使插入的肽段暴露于衣殼蛋白表面),構建多樣性衣殼蛋白文庫。將上述插入隨機組成七肽的衣殼蛋白構建于通用啟動子(CMV)驅(qū)動的質(zhì)粒載體,構成多樣性衣殼蛋白編碼基因遞送文庫。將二者結合,經(jīng)293T細胞系包裝、建立遞送編碼其自身衣殼蛋白基因的多樣性衣殼蛋白文庫后,使用C57BL/6J小鼠進行體內(nèi)基因遞送,提取肌肉組織,通過檢測衣殼蛋白DNA和mRNA篩選出靶向并有效轉導肌肉組織的AAV。進一步,將篩選獲得的AAV衣殼蛋白編碼序列構建于兩種小鼠肌肉組織特異性啟動子(CK8、MHCK7)驅(qū)動的帶有ITR序列的質(zhì)粒載體作為遞送基因,將其與前述多樣性衣殼蛋白編碼基因遞送文庫結合制備rAAV,對C57BL/6J小鼠進行體內(nèi)基因遞送。再次通過相同的衣殼蛋白DNA和mRNA篩選步驟,與前述結果比對,該研究成功獲得靶向并有效轉導肌肉組織的AAV衣殼蛋白編碼序列(插入該衣殼蛋白的七肽中,前三個氨基酸為RGD)。該研究同時發(fā)現(xiàn),多樣性衣殼蛋白編碼基因rAAV文庫感染小鼠的組織中,同一種衣殼蛋白編碼的DNA和mRNA水平并不一致,而轉導基因的mRNA水平是鑒定有效的特異性組織或細胞基因轉導的主要指標。這一結果表明,基于AAV衣殼蛋白DNA而非mRNA篩選獲得的AAV很可能不具備有效的特異性組織或細胞轉導能力。

        2.3 化學修飾 外源性多肽或蛋白質(zhì)插入通常受到AAV衣殼蛋白插入位點和容量的限制,也常導致AAV衣殼蛋白無法正確組裝,因此限制了合理設計策略在AAV衣殼靶向性修飾中的應用。為解決上述問題,研究者新近開發(fā)了基于化學修飾的AAV衣殼靶向性修飾策略,該策略同樣基于合理設計,但可通過對AAV衣殼蛋白進行化學修飾,使其能結合靶細胞特異性受體的配體分子或抗體,從而使AAV具備細胞靶向性,由此實現(xiàn)配-受體或抗體介導的AAV靶向轉導。

        亮氨酸拉鏈結構域之間可特異性、高親和力地相互作用形成卷曲螺旋對,Thadani等[30]利用這一特性,將C端融合腸激酶切割基序的亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結合基序插入AAV9衣殼蛋白G453位點之后,制備亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結合基序修飾衣殼的AAV9病毒。具備該衣殼蛋白的AAV9經(jīng)腸激酶處理后,表面展示線性化的亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結合基序,該AAV9可與互補亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結合基序融合的靶細胞配體分子特異性結合,實現(xiàn)配-受體介導的靶向細胞轉導。

        DNA-蛋白質(zhì)相互作用也可用于AAV靶向性修飾。如蛋白標簽HUH能與特定序列單鏈DNA(5’-CCA GTT TCT CGA AGA GAA ACC GGT AAG TGC ACC CTC CCT GAT GA - AmMO-3’)形成共價鍵結合。Zdechlik等[31]將分子量21 kU的HUH-tag引入AAV-DJ衣殼的可變區(qū)IV,制備衣殼表面攜帶HUH的AAV-DJ。由于此AAV-DJ可通過其HUH標簽與單鏈DNA共價修飾的任何抗體結合,從而成為了一種“通用型”靶向AAV。

        上述兩種方案盡管提供了制備“通用型”靶向修飾AAV的方法,但仍需要對衣殼蛋白進行基因重組,有可能導致AAV組裝問題。去唾液酸糖蛋白受體 (asialoglycoprotein receptor,ASGP-R)在肝細胞表面高表達,可特異性識別、結合N-乙酰半乳糖胺。Mével等[32]直接對AAV2衣殼蛋白賴氨酸殘基的氨基基團進行N-乙酰半乳糖胺修飾,使AAV2獲得ASGP-R介導的靶向肝細胞轉導能力。

        3 結語和展望

        目前多個臨床試驗證明AAV作為治療性基因遞送載體具有顯著的優(yōu)勢和良好的應用前景[33]。但AAV載體的臨床應用仍然存在以下問題亟待解決:1) AAV衣殼的固有免疫原性可激活宿主免疫反應,影響基因治療的安全性,導致無法重復給藥,從而影響基因治療的有效性[34-35];2)AAV載體缺乏靶向性,阻礙體內(nèi)基因治療遞送和細胞轉導效率;3)AAV載體具有潛在的宿主基因組整合能力[36]。同時,對于AAV轉導宿主細胞的生物學全過程尚未完全闡明,特別是需要進一步鑒定介導AAV黏附、進入不同宿主細胞的受體分子,研究AAV衣殼蛋白激發(fā)宿主免疫反應的過程?!皺C器學習”無需物理建模可直接基于實驗數(shù)據(jù)進行訓練、獲得工程蛋白質(zhì)的全部潛在多樣性序列組成。2021年,Bryant等[37]通過機器學習模擬單個氨基酸隨機突變,設計了多達5萬多個的有功能的野生型AAV2衣殼蛋白變體。同年,Hie等[38]運用新的“機器學習”算法處理宿主體內(nèi)流感病毒血凝素、HIV-1包膜糖蛋白和新型冠狀病毒的高通量測序數(shù)據(jù),鑒定了能夠保護病毒逃逸免疫系統(tǒng)識別,同時保留其感染性的突變。這些新近研究提示,利用已發(fā)現(xiàn)的天然AAV衣殼蛋白編碼序列、衣殼蛋白翻譯后修飾和衣殼蛋白免疫原性位點的信息,通過“機器學習”有望預測AAV衣殼蛋白的免疫逃逸突變,以此有效優(yōu)化衣殼序列以改善AAV轉導效率并降低其免疫原性。同樣的,將病毒組裝前后的AAV衣殼文庫編碼序列數(shù)據(jù)用于“機器學習”算法有望預測病毒衣殼組裝,從而對衣殼蛋白文庫設計進行改進[39]。

        綜上所述,AAV衣殼是激發(fā)宿主免疫反應的主要免疫原,同時決定AAV組織嗜性和細胞轉導的靶向性,因此衣殼蛋白修飾是當前AAV載體研究的重點。多種AAV衣殼蛋白修飾的研究策略結合“機器學習”,有望篩選出能夠重復給藥并具備靶向性和高轉導能力的AAV載體,進一步促進基因治療的臨床應用。

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