寧亞維，孫 穎，張東春，張雅娟，司海山，康亞朋，王志新，王世杰

（河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018）

白假絲酵母菌是一種條件致病菌，通常存在于正常人口腔黏膜、上呼吸道、腸道及陰道，當機體免疫功能下降或菌群失調時則大量繁殖侵入細胞引起疾病。在口腔中白假絲酵母菌感染可引起鵝口瘡[1]，還會感染口腔黏膜炎病變，導致口咽黏膜炎癥[2]，并且與齲齒、牙周炎等口腔疾病也密切相關[3]。白假絲酵母菌生物膜的形成是導致和加深口腔疾病的重要原因，因為與浮游細胞相比生物被膜細胞具有更大的耐藥性，并且能更加持久的黏附在牙齒或口腔黏膜表面。在口腔中白假絲酵母菌可以與口腔致病菌形成混合生物膜并互相利用，例如與致齲菌變異鏈球菌的相互作用可以增強細菌-真菌的結合，使得形成的雙物種生物膜具有更大的三維復雜性，增加抵抗應激條件的能力，同時增強變異鏈球菌生物膜的致齲性[4-5]；白假絲酵母菌與牙菌斑形成相關的口腔鏈球菌協(xié)同可以增加彼此的數量，口腔鏈球菌還能促進白假絲酵母菌菌絲的形成；白假絲酵母菌與牙周炎致病菌伴放線放線桿菌聚集桿菌也具有協(xié)同的作用，可明顯增強毒力從而破壞牙周組織[6]。

目前對口腔念珠病感染的治療方法包括使用抗真菌藥物、天然植物衍生物、光動力療法等，其中對于治療白假絲酵母菌常用的抗生素類藥物包括氟康唑、兩性霉素B等。近年來抗真菌藥物的大量使用使越來越多的耐藥菌株出現并傳播[7]。為了應對白假絲酵母對抗生素的耐藥性，目前運用植物中提取的化合物替代傳統(tǒng)藥物得到廣泛研究。研究較多的植物衍生物包括提取物、精油、萜烯、生物堿、黃酮類化合物、多酚、凝集素等[8]。光動力療法主要是利用光敏劑被光源激活并與氧氣反應，導致細胞死亡，對耐藥性白假絲酵母也具有效果，但這種療法更適用于深度感染且有術后不良反應[9-10]。

白假絲酵母菌數量的增加會引起多種口腔疾病，造成口腔菌群失衡，細菌與白假絲酵母的特定相互作用可以促進其向致病菌的轉變。因此對于口腔疾病，調節(jié)菌群失衡的防治手段對維護口腔環(huán)境健康十分重要。近幾年益生菌在口腔中的使用和研究越來越受到關注，在各項研究中均表明常見的幾種乳酸菌如鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌等對白假絲酵母菌在口腔中的發(fā)展均有抑制作用[11-12]。而益生菌的作用機制也多種多樣，其中包括通過黏附競爭、產生有機酸、細菌素、生物表面活性劑等抑制病原體[13-14]。因此選取實驗室前期篩選出的對口腔致病菌具有較好抑制作用的植物乳桿菌HB13-2，研究其對白假絲酵母菌的細胞壁、細胞膜、跨膜電勢、微觀結構、活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累以及線粒體膜電位方面影響，分析植物乳桿菌HB13-2上清液對菌體的抑菌作用機制，旨在為植物乳桿菌HB13-2作為口腔益生菌開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌HB13-2分離自農家自制酸菜，白假絲酵母菌ATCC10231由河北科技大學食品生物技術與安全實驗室保藏。

無水乙醇、戊二醛、乙酸異戊酯、異丙醇 天津永大化學試劑公司；Hepes 北京科博生物技術有限公司；Nigericin、Valinomycin、DiSC3(5)、羅丹明-123、2,′7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluo rescein diacetate，DCFH-DA）、熒光增白劑（calcofluor white，CFW）熒光染料 美國Sigma公司；碘化丙啶（propidium iodine，PI）、SYTO-9 美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-5S立式蒸汽滅菌鍋 上海博訊有限公司；3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；ZSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造公司；BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；F-7000-FL 220熒光分光光度計、S-4800-1掃描電鏡 日本日立公司；AccuriC6 Plus流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；Alpha 2-4 L Dplus冷凍干燥機 德國CHRIST公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌HB13-2上清液的制備

將植物乳桿菌HB13-2接種于MRS肉湯中于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。然后，將菌懸液8 000 r/min離心15 min，以使植物乳桿菌與上清液分離。取出上清液后在-40 ℃預凍12 h后置于冷凍干燥機30 h，將凍干后的上清液貯存在-40 ℃，實驗進行前按照不同質量濃度制備上清液并經0.22 μm無菌濾膜過濾處理。

1.3.2 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

采用二倍稀釋法測定植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌的MIC。將植物乳桿菌HB13-2上清液凍干配制成質量濃度為640 mg/mL的上清液，白假絲酵母菌用YPD調節(jié)濃度為106CFU/mL。在96 孔板中先加入100 μL YPD，再將質量濃度為400 mg/mL植物乳桿菌HB13-2上清液加入第1個孔中，吸打混勻后取100 μL加入第2個孔，依次重復，最終實驗組終質量濃度100～5 mg/mL。以200 μL YPD作為陰性對照組，以白假絲酵母菌液與YPD各100 μL作為空白對照組。放入37 ℃培養(yǎng)箱24 h用光密度法觀察，以被抑制的最低抑菌劑濃度作為MIC。

1.3.3 時間-抑菌曲線的測定

將白假絲酵母菌活化后培養(yǎng)至對數期，調節(jié)菌濃度為106CFU/mL，配制不同質量濃度的植物乳桿菌上清液與菌懸液等體積混合，使終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC以及2 MIC，以不加入上清液作為空白對照。分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h用平板計數法進行活菌數計數，并繪制時間-抑菌曲線。

1.3.4 細胞壁完整性的測定

用KOH 和CFW 染色檢測上清液對白假絲酵母菌細胞壁的影響[15]。白假絲酵母菌懸液調整濃度為106CFU/mL，并在37 ℃與終質量濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC的植物乳桿菌上清液孵育6 h。8 000 r/min離心10 min后棄上清液，用0.85%生理鹽水清洗菌體3 次后，將菌體取1 環(huán)放置在載玻片上，用10% KOH和0.1% CFW溶液染色，并用熒光顯微鏡觀察，在每個質量濃度的處理組中至少選擇3 個隨機視野觀察。

1.3.5 細胞膜完整性的測定

采用PI和SYTO-9染色法分析白假絲酵母菌細胞膜完整性[16]。將培養(yǎng)至對數生長期的白假絲酵母菌用0.85%生理鹽水重復清洗3 次，重懸為濃度106CFU/mL的菌懸液，將用生理鹽水配制的不同質量濃度植物乳桿菌上清液與菌懸液等體積混合，使上清液終質量濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC，未經過上清液處理的菌體作陰性對照，用70%異丙醇溶液處理的樣品用作陽性對照，并在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育6 h。離心后收集細胞，清洗3 次以去除上清液，重懸在生理鹽水中，在黑暗條件下用2 μmol/L SYTO-9和12 μmol/L PI染色15 min。再次清洗3 次探針，重懸后用熒光顯微鏡觀察，并用流式細胞儀分析。

1.3.6 細胞膜跨膜電勢的測定

采用DiSC3(5)考察菌體細胞膜跨膜電勢變化[17]。將培養(yǎng)至對數生長期的白假絲酵母菌用含有10 mmol/L葡萄糖的Hepes緩沖液（5 mmol/L）重復清洗3 次，重懸為濃度106CFU/mL的菌懸液，向菌液中加入DiSC3(5)使其終濃度為1 μmol/L，37 ℃避光孵育30 min，加入終濃度100 mmol/L KCl溶液。在比色皿中加入等體積菌懸液和不同質量濃度抑菌劑，使抑菌劑終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC，以0.85%生理鹽水作空白對照。以Valinomycin作為陰性對照，以Nigericin作為陽性對照（終濃度5 mmol/L），以Hepes緩沖液為空白對照組，用熒光分光光度計進行時間掃描，測定熒光強度變化（激發(fā)波長650 nm，發(fā)射波長672 nm）。

1.3.7 掃描電鏡分析

收集對數期的白假絲酵母菌，清洗、重懸，調整菌濃度為106CFU/mL，將等體積菌懸液與不同質量濃度植物乳桿菌上清液混合作用6 h。離心，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗菌體后，在4 ℃下用體積分數2.5%戊二醛溶液固定過夜。之后，樣品經0.1 mol/L PBS清洗除去戊二醛，然后用乙醇（30%、50%、70%、85%、90%、100%）進行逐級梯度脫水，每次15 min，無水乙醇脫水2 次。最后用乙酸異戊酯將乙醇置換2 次，每次20 min，干燥后通過掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.8 細胞內ROS的測定

DCFH-DA用于測定白假絲酵母菌中細胞內ROS水平[18]。將培養(yǎng)至對數期的白假絲酵母菌用0.1 mol/L PBS清洗3 次，重懸在PBS中并將菌懸液濃度調節(jié)為106CFU/mL，將植物乳桿菌上清液與菌懸液等體積混合，使終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC、2 MIC以及4 MIC，以不加上清液組為對照組，于37 ℃孵育6 h。然后，用PBS清洗細胞3 次以除去上清液，再重懸在1 mL的PBS中，加入DCFH-DA使其終濃度為10 μmol/L，避光孵育30 min。再次用PBS清洗探針3 次，以PBS為空白對照組并通過熒光分光光度計測定熒光強度（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm）。

1.3.9 線粒體膜電位

采用羅丹明-123考察菌體線粒體膜電位的變化[19]。將培養(yǎng)至對數期的白假絲酵母菌用0.1 mol/L PBS清洗3 次，重懸在PBS中并將菌懸液濃度調節(jié)為106CFU/mL，用PBS配制植物乳桿菌上清液與菌懸液等體積混合，使終質量濃度分別為1/2 MIC、MIC、2 MIC以及4 MIC，以不加上清液組為對照組，于37 ℃孵育6 h。用PBS清洗菌體以除去上清液，加入羅丹明-123，于37 ℃避光染色30 min。再次清洗探針3 次，以PBS為空白對照組，通過熒光分光光度計測定熒光強度（激發(fā)波長486 nm，發(fā)射波長525 nm）。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3 次取其平均值。采用Origin 9.0軟件通過單因素方差分析法對實驗結果進行統(tǒng)計分析并作圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌的抑菌活性

MIC可以反映植物乳桿菌HB13-2上清液對浮游白假絲酵母菌的抑制活性，測定得到其MIC值為50 mg/mL。進一步進行時間-抑菌曲線的測定，以考察植物乳桿菌HB13-2上清液對白假絲酵母菌生長和繁殖的抑制情況。如圖1所示，與沒有加入植物乳桿菌上清液的細胞相比，1/2 MIC、MIC、2 MIC處理對白假絲酵母菌均有抑制作用，且呈質量濃度依賴性。在1/2 MIC處理組中植物乳桿菌HB13-2上清液延緩了白假絲酵母菌的生長速度，MIC處理組完全抑制了白假絲酵母菌的生長繁殖，在作用24 h后白假絲酵母菌處于生長停滯狀態(tài)，數量與0 h相比基本保持不變，2 MIC處理組則在作用2 h后無活菌檢出，表明在此質量濃度下植物乳桿菌HB13-2上清液對白假絲酵母菌顯示出致死作用。

圖1 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌的抑菌曲線Fig.1 Inhibitory curves of L.plantarum HB13-2 against C.albicans

2.2 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌細胞壁完整性的影響

白假絲酵母菌的細胞壁起到滲透屏障、維持細胞完整性并賦予結構剛性的作用，主要是由幾丁質和β-1,3-葡聚糖組成[20]。熒光染料CFW與組成細胞壁的成分幾丁質具有親和力，兩者結合可發(fā)出藍光，藍光強度越強則證明幾丁質越密集，結合的越緊密，因此采用熒光染料CFW對白假絲酵母進行染色，考察了植物乳桿菌上清液對白假絲酵母菌細胞壁的作用[21]。圖2熒光顯微鏡觀察結果顯示，未經上清液處理過的細胞與經上清液處理后的細胞均呈藍色熒光，但未經上清液處理過的細胞熒光強度較弱，1/2 MIC與MIC處理組僅觀察到熒光強度的增強，而2 MIC處理組可以觀察到部分菌體的端部出現亮熒光，這種現象在4 MIC處理組中明顯增多，大部分菌體都帶有明顯的亮點。Rueda等[22]研究證明，利用能有效殺滅念珠菌的藥物——卡泊芬凈處理白假絲酵母后，發(fā)現細胞壁中的幾丁質積累，并使其他細胞壁成分重排，這可能是藥物引起細胞壁修復機制的信號通路的激活，但并不足以使細胞免受藥物的攻擊。Da Silva等[21]發(fā)現，從石榴果皮中提取的凝集素PgTeL經熒光染料CFW染色后酵母壁中CFW熒光強度增強，并且出現在細胞質中擴散的現象，表明細胞壁完整性喪失。因此，在本研究中上清液處理后觀察到熒光強度增強可能是由于幾丁質的積累造成，而細胞中出現熒光斑點可能是由于細胞壁成分的重排導致熒光沾染率的差異，這表明上清液使細胞壁產生了損傷，從而導致幾丁質的補償性增加。

圖2 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌細胞壁完整性的影響Fig.2 Effect of L.plantarum HB13-2 on the cell wall integrity of C.albicans

2.3 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌細胞膜完整性的影響

采用PI和SYTO-9對白假絲酵母菌進行染色，并通過熒光顯微鏡觀察植物乳桿菌HB13-2上清液對其細胞膜完整性的影響。PI不能通過完整的細胞膜對DNA進行染色，但當細胞膜破損使可以進入胞內對DNA染色并發(fā)出紅色熒光[23]，而SYTO-9能夠通過細胞膜對DNA進行染色發(fā)出綠色熒光[24]，因此對細胞進行雙染后從熒光顯微鏡觀察菌體的顏色呈現綠色、黃色、橙色、紅色，紅色熒光強度越強則表明菌體細胞膜受損越嚴重。如圖3所示，未經上清液處理過的細胞呈現綠色表明菌體細胞膜完整未出現破損，1/2 MIC處理組菌體仍以綠色為主，少數菌體呈現黃色，表明在此質量濃度處理下對大部分白假絲酵母菌細胞膜損傷不大；MIC處理組少部分菌體呈現黃色熒光強度較弱；2 MIC處理組中呈現黃色的菌體數量增加，少數菌體呈現橙色；4 MIC處理組紅色熒光強度明顯增加，菌體呈現紅色表明菌體細胞膜損傷嚴重。

圖3 植物乳桿菌HB13-2上清液對白假絲酵母菌細胞膜完整性的影響Fig.3 Effect of the culture supernatant of L.plantarum HB13-2 on the cell membrane integrity of C.albicans

為了進一步考察上清液對細胞膜的破壞，采用流式細胞術對破損程度進行定量分析。如圖4所示，未經處理的白假絲酵母菌膜受損率為0.2%，1/2 MIC處理組膜受損率為2.3%，MIC處理組膜受損率為13.9%，2 MIC處理組膜受損率為56.8%，4 MIC處理組膜受損率為84.3%。因此，流式細胞儀結果表明1/2 MIC和MIC處理組對細胞膜的破壞作用均不明顯，2 MIC與4 MIC處理組則顯示出顯著的破壞作用。熒光顯微鏡觀察結果與流式細胞儀檢測結果一致，均表明上清液處理可以破壞細胞膜完整性。

圖4 流式細胞術分析植物乳桿菌HB13-2上清液對白假絲酵母菌細胞膜完整性的影響Fig.4 Flow cytometry analysis of the effect of the culture supernatant of L.plantarum HB13-2 on the cell membrane integrity of C.albicans

2.4 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌細胞膜跨膜電勢的影響

DiSC3(5)是一種親脂性的熒光探針，由于其疏水性和陽離子性質可以穿透脂質雙層并在極化細胞中積累到高水平[25]。膜去極化后，染料迅速從細胞中釋放，隨后可通過熒光分光光度計檢測其熒光強度從而判斷細胞膜膜電勢水平[26]。如圖5所示，未經上清液處理的細胞熒光強度為28.97，經Nigericin處理過的陰性對照組熒光強度為26.325，而經1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC處理后的細胞最終熒光強度分別達到54.57、66.12、86.305、100.48，隨著上清液質量濃度的增加，DiSC3(5)熒光強度增大，呈現質量濃度依賴性。細胞內電化學梯度的破壞與質膜通透性的增加相關[27]，上清液可能通過導致白假絲酵母菌細胞膜的去極化及通透性增加，從而起到抗真菌作用，這一結果與杜仲抗菌肽EuCHIT1對白假絲酵母菌的抑菌機制類似均可破壞膜電勢[28]。

圖5 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌跨膜電勢的影響Fig.5 Effect of L.plantarum HB13-2 on the transmembrane potential of C.albicans

2.5 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌超微結構的影響

如圖6所示，未經上清液處理的白假絲酵母菌菌體完整、飽滿、邊緣清晰，且表面光滑呈球狀，而用不同質量濃度植物乳桿菌HB13-2上清液處理6 h后白假絲酵母菌的形態(tài)發(fā)生了不同程度改變。經MIC處理后，白假絲酵母菌菌體表面變的粗糙，并出現皺縮，部分菌體表面出現凹陷，并伴有少量附著在菌體上的泄漏內容物。經2 MIC處理后，白假絲酵母菌菌體表面皺縮，出現嚴重凹陷并產生空洞，大量泄漏的內容物與溶解的細胞以及細胞碎片出現，并出現附著團聚的現象。

圖6 掃描電鏡觀察植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌形態(tài)結構的影響Fig.6 Effect of L.plantarum HB13-2 on the morphological structure of C.albicans observed by SEM

2.6 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌ROS的影響

ROS是在細胞氧化呼吸過程中產生，還原酶可以消除產生的ROS，以達到細胞內氧化還原的平衡，當ROS水平較高時可能會擾亂細胞正常代謝，破壞細胞器和細胞膜，從而進一步導致細胞的死亡[29]。DCFH-DA能夠進入細胞，并通過酯酶脫乙酰化為2′,7′-二氯二氫熒光素（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein，DCFH），DCFH不能通過細胞因此留存在細胞內部，DCFH無熒光但當ROS存在時能夠被氧化為有熒光的2′,7′-二氯熒光素，因此通過測定熒光強度可以測定細胞內ROS的積累水平[30]。如圖7所示，未經處理的細胞熒光強度為9.41，而經1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC處理后的細胞最終熒光強度分別達到15.78、30.86、56.68、83.995，熒光強度的增強表明植物乳桿菌HB13-2上清液能顯著增加白假絲酵母菌細胞內ROS水平，并呈現質量濃度依賴性。ROS積累是許多抗真菌藥物以及化學物質發(fā)揮抑制和致死作用的機制之一，伊曲康唑是對白假絲酵母十分有效的殺菌劑，其主要殺菌機制是引起白假絲酵母菌ROS的積累誘導細胞的凋亡[31]。經香芹酚處理后的白假絲酵母，ROS水平增加并且改變了線粒體膜電位，并影響了線粒體形態(tài)[32]。因此ROS的積累可能是上清液的抑菌機制之一，并有可能對白假絲酵母菌的線粒體產生影響。

圖7 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌ROS的影響Fig.7 Effect of L.plantarum HB13-2 on intracellular ROS levels in C.albicans

2.7 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位作為細胞能量狀態(tài)的指標，可以反映線粒體中的質子負荷、電子轉運蛋白的活性和線粒體膜的通透性[33]，因此膜電位的改變也是抗真菌的重要機制。羅丹明-123是一種陽離子親脂性染料，滲透到帶負電荷的線粒體中，并反映線粒體膜電位[19]。如圖8所示，植物乳桿菌HB13-2以質量濃度依賴的方式顯著增強了羅丹明-123熒光強度，未經處理過的細胞熒光強度為9.26，而經1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC處理后終熒光強度分別達到13.36、15.495、25.57、45.96，顯著增加了白假絲酵母菌線粒體膜電位水平。線粒體膜電位的增加表明上清液可以誘導白假絲酵母菌線粒體膜電位的超極化，并誘導線粒體損傷，使線粒體功能出現障礙。線粒體是細胞凋亡過程中最常見的ROS來源，ROS積累會導致線粒體膜性能改變，最終改變膜電位[34]。ROS研究結果表明上清液處理會導致細胞內ROS的積累，因此推測這是導致白假絲酵母菌線粒體膜電位改變的原因之一。

圖8 植物乳桿菌HB13-2對白假絲酵母菌線粒體膜電位的影響Fig.8 Effect of L.plantarum HB13-2 on mitochondrial membrane potential of C.albicans

3 結論

植物乳桿菌HB13-2上清液能夠抑制白假絲酵母菌的生長，并能破壞細胞壁的完整性，改變細胞膜通透性并導致跨膜電勢消散。從微觀結構觀察也發(fā)現經上清液處理后菌體產生明顯的皺縮、形變，引起內容物的泄漏。另外，上清液處理也會導致菌體內ROS積累以及線粒體膜電位的改變并出現超極化?？傊参锶闂U菌HB13-2上清液可通過破壞細胞壁和細胞膜完整性、影響膜電勢、改變菌體形態(tài)、導致ROS積累、損傷線粒體功能對白假絲酵母菌產生抑制效果。本研究可為植物乳桿菌HB13-2開發(fā)成為口腔益生菌提供科學依據。