栗 鑫，羅 磊，熊鎣姿，王 玲，李脈泉，劉 霞

（湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

食用植物油中由于含有大量不飽和脂肪酸，在生產(chǎn)、運輸、貯藏過程中易發(fā)生氧化，其氧化中間產(chǎn)物氫過氧化物易分解為4-羥基-反式-壬烯醛、巴豆醛、丙二醛等低分子的醛酮類化合物，不僅使油脂的感官品質受損，還具有一定的生理毒性，危害身體健康[1-4]。過氧化值（peroxide value，POV），可以有效反映油脂的氧化程度，即POV越大，表明油脂氧化生成的氫過氧化物的量越多[5]。我國在GB 5009.227—2016《食品中過氧化值測定》[6]中規(guī)定：食用植物油的POV應不高于0.25 g/100 g。

目前，國內(nèi)外檢測食用植物油POV的方法主要有碘量法[7]、光譜法[8]、色譜法[9]、電化學酶促分析法[10-11]等。碘量法雖簡單易行，但測定過程中易受人為因素的影響，如搖晃速率、滴定終點的確定等，導致檢測結果重復性差。光譜法主要有傅里葉變換紅外光譜和熒光光譜。傅里葉變換紅外光譜具有測試時間短、操作成本低、預處理簡單等明顯優(yōu)勢，但其模型可靠性和專一性還需進一步優(yōu)化[12]。熒光光譜法靈敏度高、樣品用量少，但容易受到干擾[13]。色譜法以高效液相色譜為主，簡單靈敏，選擇不同的色譜柱和檢測器，能分析具有不同特性、不同分子質量或極性的油脂[14]，但檢測時間長[15]。此外，光譜法與色譜法都需應用大型儀器，檢測成本高，且檢測方法不夠便捷。酶促分析法中，過氧化物酶傳感器應用居多[16]。Jia Jianbo等[17]研究了基于辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）制備的酶電極，將其應用于植物油POV的測定，取得了滿意的結果。但HRP存在著對環(huán)境敏感、成本高等問題。

納米酶是一種具有天然酶催化活性的納米材料，在生理條件下可有效催化底物的轉化，并遵循天然酶的酶促動力學[18]。Fe3O4納米酶是最早被發(fā)現(xiàn)具有類過氧化物酶（peroxidase，POD）催化活性的材料，具有容易制備、性質穩(wěn)定、超順磁性等特性。Fe3O4納米酶表面含有豐富的Fe2＋、Fe3＋，兩者間的相互轉換是其釋放催化活性的關鍵。如圖1所示，酸性條件下，F(xiàn)e3O4納米酶中的Fe3＋能與氫過氧化物（如H2O2）反應，生成不穩(wěn)定的FeOOH2＋離子基，該離子基進一步分解成Fe2＋，再與H2O2反應生成羥自由基[19]，羥自由基可氧化顯色底物，如3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）和2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)，ABTS）。TMB的氧化產(chǎn)物，即氧化態(tài)TMB（oxidation-TMB，ox-TMB）呈藍色，其最大吸收波長為652 nm。Ding Ning等[20]基于Fe3O4納米酶的類POD活性，以ABTS為顯色底物，建立了Fe3O4納米酶-H2O2-ABTS的比色傳感體系，用于檢測乳制品中的三聚氰胺。Re Hejun等[21]制備了一種表面修飾有VC的Fe3O4納米酶，并將其作為催化劑，構建了一種用于檢測H2O2和葡萄糖的比色傳感器。

圖1 Fe3O4納米酶催化反應機理Fig.1 Mechanism of reactions catalyzed by Fe3O4 nanozyme

本研究基于表面修飾羧基的Fe3O4納米酶（Fe3O4@COOH）的類POD活性，以TMB為顯色底物，構建一種用于檢測食用純植物油中POV的簡單快速、靈敏高效的新型比色方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用純植物油（壓榨、一級）：玉米油、花生油、葵花籽油、菜籽油、大豆油 長沙市步步高超市。

四水合氯化亞鐵（FeCl2·4H2O）、六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、一水檸檬酸（C6H10O8·H2O）、乙酸、乙醇、30%過氧化氫（H2O2）、三水合乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、三氯甲烷（CHCl3）、冰乙酸（CH3COOH）上海國藥集團化學試劑有限公司；TMB（純度≥99%）上海瑞永生物科技有限公司；HRP（活性＞300 U/mg）上海麥克林生化科技有限公司；Fe3O4@COOH納米酶由本實驗室自制；氮氣 長沙長鋼氣體廠；汝鐵硼強磁鐵 長沙南湖五金機電市場；實驗所用試劑均為分析純及以上，實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

Multiskan GO 1510多功能酶標儀 美國Thermo Scientific公司；KQ-250DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DZF-6030A真空干燥箱 上海恒一科學儀器有限公司；XMTD-702便攜式恒溫箱 常州市凱奧儀器有限公司；AUY 220分析天平 日本島津公司；移液槍 大龍興創(chuàng)實驗儀器公司；WGZ-9070B鼓風干燥箱 上?？坪銉x器有限公司；紫外燈箱為實驗室（2.0 A、30 W）均由本實驗室自制。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4@COOH納米酶類POD催化活性的驗證

Fe3O4@COOH納米酶的制備是在實驗室現(xiàn)有方法上稍加優(yōu)化[22]。過程如下：準確稱取5.0 g FeCl3?6H2O、2.0 g FeCl2?4H2O，超聲溶解在100 mL超純水中，通氮除氧，水浴加熱至80 ℃，加入40 mL NaOH溶液（2 mol/L）、1.1 g檸檬酸，在550 r/min反應1 h。待反應結束后，冷卻至室溫，在外部磁場作用下使用超純水洗滌至中性，于60 ℃條件下真空干燥24 h后備用。

H2O2存在下，研究Fe3O4@COOH納米酶對底物TMB的催化氧化能力。將800 μL乙酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 3.5）于離心管中，依次加入50 μL Fe3O4@COOH納米酶水溶液（1 mg/mL）、100 μL H2O2（0.08 mol/L）和50 μL TMB（0.008 mol/L），加入50 μL DMSO溶解，混合均勻，在室溫下反應5 min后，在外部磁力作用下分離Fe3O4@COOH納米酶，然后吸取100 μL上清液置于酶標板中，掃描其在550～750 nm范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.3.2 Fe3O4@COOH納米酶比色檢測POV條件優(yōu)化

反應條件優(yōu)化的參數(shù)如表1所示，方法與1.3.1節(jié)相同。每個實驗平行測定3 次。

表1 反應條件的優(yōu)化Table 1 Optimization of reaction conditions

1.3.3 Fe3O4@COOH納米酶的酶促動力學分析

首先，固定H2O2濃度（0.08 mol/L），改變TMB濃度。將反應總體積縮小為原來的1/5，依次往酶標板中加入160 μL乙酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 2）、20 μL Fe3O4@COOH納米酶（1 mg/mL）、40 μL H2O2以及20 μL TMB（不同濃度），混合均勻，在652 nm波長處進行吸光度的測定。每隔30 s測定一次，以吸光度隨時間變化曲線斜率的倒數(shù)為縱坐標，以TMB濃度倒數(shù)為橫坐標繪圖，得到Fe3O4@COOH納米酶對TMB的雙倒數(shù)圖，再根據(jù)公式：1/V=（Km/Vmax）（1/[S]）＋1/Vmax計算出米氏常數(shù)（Km）和最大反應速率（Vmax）[23]。

類似地，固定TMB濃度（0.8 mmol/L），改變H2O2濃度。檢測過程與數(shù)據(jù)處理方法同上。

1.3.4 Fe3O4@COOH納米酶的重用性及貯藏性

將制備好的Fe3O4@COOH納米酶置于4 ℃條件下冷藏保存，采用1.3.1節(jié)的方法，考察其重復使用性及貯藏性能。

1.3.5 基于Fe3O4@COOH納米酶比色測定食用純植物油POV的可行性

1.3.5.1 純植物油提取液

準確稱取3.0 g（精確到0.01 g）植物油，溶解于30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合溶液（4∶6，V/V）中，混合均勻后，加入100 mL超純水，靜置1 min，待溶液分層后，吸取下層溶液至離心管中，獲得食用純植物油提取液。

1.3.5.2 POV的檢測

采用GB 5009.227—2016對食用純植物油提取液，進行POV的測定，同時采用Fe3O4@COOH納米酶比色法檢測食用純植物油原液和食用純植物油提取液的POV，比較檢測結果。

1.3.6 基于Fe3O4@COOH納米酶比色檢測食用植物油POV的方法建立

取200 μL不同種類純植物油，分別采用國家標準方法與比色法進行POV檢測，以比色法測得的吸光度為橫坐標，POV為縱坐標，建立油樣吸光度與POV的關系曲線。

1.3.7 不同氧化方式對食用純植物油POV比色檢測的影響

紫外氧化：準確吸取100 mL食用純植物油（玉米油、花生油、葵花籽油、菜籽油、大豆油）倒入燒杯中，將燒杯放入紫外燈箱中，經(jīng)紫外燈照射進行氧化。

烘箱氧化：同上，試樣放入電熱高溫干燥箱中，80 ℃氧化。

自然氧化：同上，試樣于室溫下自然氧化。

其中，每間隔一定時間從燒杯的上、中、下三層共取出5 mL油樣，混勻后，分別應用1.3.6節(jié)建立的方法和國家標準方法，對其進行POV的檢測。

1.3.8 實際油樣的檢測

采用玉米、花生、葵花籽、菜籽、大豆油5 種純植物油作為實際樣品。分別應用所建的比色檢測方法和國家標準方法對其進行POV的檢測，并比對其檢測結果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理分析采用軟件OriginPro、Excel、SPSS和Photoshop，其中線性回歸方程、作圖使用OriginPro和Photoshop，重復性、偏差值、回收率采用SPSS、Excel處理數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 Fe3O4@COOH納米酶類POD催化活性的驗證

本實驗室合成的Fe3O4@COOH納米酶粒徑平均值約為6.6 nm，如圖2所示。

圖2 Fe3O4@COOH納米酶的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of Fe3O4@COOH

如圖3所示，當反應體系中同時存在Fe3O4@COOH納米酶、H2O2和TMB時，該體系在500～750 nm波長范圍內(nèi)出現(xiàn)了較強的吸收峰；當反應體系中不存在Fe3O4@COOH納米酶時，相同時間內(nèi)，并未出現(xiàn)明顯的吸收峰，這說明Fe3O4@COOH納米酶能夠催化H2O2氧化TMB。此外，當反應體系中存在TMB時，均會出現(xiàn)較弱的吸收峰，但吸光度顯著低于Fe3O4@COOH納米酶-H2O2-TMB反應體系，原因可能是TMB受到溶液及空氣中的氧氣影響，發(fā)生了微弱的氧化。但反應體系中不存在TMB時，則并未出現(xiàn)明顯的吸收峰。上述結果表明，本研究制備的Fe3O4@COOH納米酶具有類POD的催化活性，且以TMB作為顯色底物時，其最大吸收峰波長為652 nm。

圖3 不同反應體系的吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of different reaction systems

2.2 比色檢測條件的優(yōu)化

為獲得最佳比色檢測條件，研究乙酸鹽緩沖液體積、緩沖液pH值、TMB濃度、Fe3O4@COOH納米酶質量濃度、反應時間等因素對Fe3O4@COOH納米酶催化活性的影響。

首先，探究乙酸鹽緩沖液體積對顯色效果的影響（固定反應體系總體積）。如圖4A所示，反應溶液吸光度隨乙酸鹽緩沖液體積的增加而增加，當乙酸鹽緩沖液體積為800 μL時，其吸光度最大。之后，反應溶液吸光度沒有出現(xiàn)明顯變化，故選擇800 μL乙酸鹽緩沖液進行后續(xù)實驗。

圖4 乙酸鹽緩沖液體積（A）、pH值（B）、TMB濃度（C）、Fe3O4@COOH納米酶質量濃度（D）、反應時間（E）對顯色效果的影響Fig.4 Effects of acetate buffer volume (A),pH (B),TMB concentration (C),concentration of Fe3O4@COOH nanozyme (D) and reaction time (E) on coloration

從圖4B可以看出，隨pH值的升高，反應體系的吸光度也隨之增加，當pH 3時，反應體系顯示出最大吸光度。之后，反應體系的吸光度隨pH值的增加而降低。這是在酸性環(huán)境下時，F(xiàn)e3O4@COOH納米酶表現(xiàn)出類POD的催化活性[24-25]。故反應體系的最佳pH值為3。

顯色底物TMB濃度是影響比色反應的重要因素，結果如圖4C所示。當TMB濃度增加時，其吸光度隨之升高。當TMB濃度為0.08 mol/L時，其吸光度達到最大。之后，即使TMB濃度繼續(xù)增大，反應體系的吸光度并未出現(xiàn)明顯變化，原因可能是Fe3O4@COOH納米酶與H2O2反應釋放出羥自由基，后者與TMB發(fā)生氧化反應，當?shù)孜锪口呌陲柡蜁r，顏色變化趨于穩(wěn)定，其增長變化趨勢符合酶與底物結合反應過程曲線[26]。故選擇0.08 mol/L TMB進行后續(xù)實驗。

Fe3O4@COOH納米酶質量濃度直接影響反應體系的顯色效果，結果如圖4D所示。反應體系的吸光度隨Fe3O4@COOH納米酶質量濃度的增加而增加。當Fe3O4@COOH納米酶質量濃度為1 mg/mL時，吸光度達到較大水平，之后，吸光度的變化不明顯，可能原因是反應體系中酶與底物已結合完全，故選擇1 mg/mL Fe3O4@COOH納米酶進行后續(xù)實驗。

反應時間影響體系的顯色效果，結果如圖4E所示，隨著反應時間的延長，反應體系的吸光度也隨之增加。當反應時間為10 min時，反應體系的吸光度達到最大，之后，隨著反應時間的延長，反應體系的吸光度逐漸下降，超過10 min后，藍色氧化產(chǎn)物ox-TMB呈現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)，進一步分解為其他物質，使得反應體系的顏色逐漸變淺，其吸光度也隨之降低。考慮到檢測方法的適用性，以及連續(xù)大批量檢測的需要，故選擇5 min作為本方法的顯色反應時間。

2.3 Fe3O4@COOH納米酶的酶促動力學分析

通過酶促動力學實驗，進一步研究Fe3O4@COOH納米酶的類POD催化活性（圖5），獲得的米氏常數(shù)（Km）和最大反應速率（Vmax）見表2，其中，F(xiàn)e3O4@COOH納米酶對H2O2和TMB的Km值分別為0.315、0.702 mmol/L。Km值代表酶與底物的親和能力，Km值越小，表明酶與底物的親和能力越高。從表2得知，F(xiàn)e3O4@COOH納米酶對H2O2和TMB的Km值均低于HRP，說明Fe3O4@COOH納米酶相較于HRP而言，對H2O2和TMB的親和力更高，可能是由于所制備的Fe3O4@COOH納米酶粒徑小、比表面積大、表面帶有豐富的負電荷，能結合更多的H2O2和TMB。相較于HRP與底物具有更強的結合能力[27-28]。但其Vmax略低于HRP，表明其催化反應速率與天然酶相比存在一定差距。相較于Fe3O4納米酶和表面修飾其他物質的Fe3O4納米酶而言，F(xiàn)e3O4@COOH納米酶對H2O2和TMB的親和力較弱，表中表面不同修飾的Fe3O4納米酶對底物的親和力也有不同程度的降低，這是由于Fe3O4納米酶的催化活性位點主要分布在其表面，表面修飾后，其活性位點部分被覆蓋，導致該納米酶的催化活性有所降低。但修飾后的Fe3O4@COOH納米酶穩(wěn)定性與分散性更佳，不易發(fā)生聚集，這也從另一個方面提升了Fe3O4@COOH納米酶的催化穩(wěn)定性與活性[29]，且有利于實際應用。此外，雖然本研究所應用的Fe3O4@COOH納米酶對底物的反應速率，不及Au、MnO2、C修飾的Fe3O4，但是其制備簡單、成本低，能夠滿足比色檢測的需要。

圖5 Fe3O4@COOH納米酶酶促動力學分析Fig.5 Enzymatic kinetic analysis of Fe3O4@COOH nanozyme

表2 各種納米材料與HRP的Km和VmaxTable 2 Km and Vmax values of nanomaterials and HRP

2.4 Fe3O4@COOH納米酶的重復使用性及貯藏性

如圖6所示，該納米酶經(jīng)5 次顯色-干燥-再顯色的循環(huán)反應后，反應體系的吸光度未出現(xiàn)明顯變化，說明所制備的Fe3O4@COOH納米酶催化活性穩(wěn)定，具有可重復使用性，這是由于Fe3O4@COOH納米酶具有良好的超順磁性，能夠在每次顯色反應完成后，借助外部磁力作用回收，相較于HRP而言更加經(jīng)濟。

圖6 Fe3O4@COOH納米酶重復使用次數(shù)Fig.6 Reusability of Fe3O4@COOH nanozyme

使用冷藏（4 ℃）保存不同時間的Fe3O4@COOH納米酶進行比色反應（圖7），發(fā)現(xiàn)反應體系的吸光度無明顯變化，表明Fe3O4@COOH納米酶在冷藏條件下保存50 d后，仍表現(xiàn)出良好的類POD催化活性，即具有較好的穩(wěn)定性。

圖7 Fe3O4@COOH納米酶的保存時間Fig.7 Storage stability of Fe3O4@COOH nanozyme

2.5 Fe3O4@COOH納米酶比色檢測食用純植物油POV的可行性

如圖8所示，無論是食用純植物油提取液，還是食用純植物油原液，F(xiàn)e3O4@COOH納米酶均可催化油脂中過氧化物，并與TMB發(fā)生顯色反應。但食用純植物油原液的反應溶液顏色，明顯深于植物油提取液的反應溶液顏色，且反應溶液在500～750 nm波長范圍內(nèi)，均產(chǎn)生了明顯的吸收峰，且前者的吸收峰明顯強于后者的吸收峰（圖9）。這或許是食用純植物油經(jīng)有機溶劑提取后，其所含的過氧化物部分被分解所致。上述結果說明，采用食用純植物油原液＋Fe3O4@COOH納米酶＋TMB的反應體系，可實現(xiàn)食用植物油中POV的檢測，不僅省時且更加準確。

圖8 植物油和提取液與TMB反應前后的溶液顏色變化Fig.8 Color changes of vegetable oil and its extract before and after reaction with TMB

圖9 食用純植物油原液、植物油提取液的吸收光譜圖Fig.9 Absorption spectra of edible vegetable oil and its extract

2.6 Fe3O4@COOH納米酶比色法檢測食用純植物油的POV

2.6.1 比色法檢測食用純植物油POV方法的建立

以紫外照射不同時間的純植物油作為樣品，在最佳比色檢測條件下，采用食用純植物油原液＋Fe3O4@COOH納米酶＋TMB的反應體系，對其吸光度進行測定，同時采用國家標準方法對同一樣品進行POV的測定。如圖10所示，不同種類食用純植物油的POV在0～0.30 g/100 g范圍內(nèi)，與其吸光度之間均呈現(xiàn)出良好的線性關系。但斜率不同，這或許是由于不同種類的食用植物油成分差異，生成的過氧化物類型不同[35]。

圖10 比色法檢測玉米油（A）、花生油（B）、葵花籽油（C）、菜籽油（D）、大豆油（E）POV的線性關系及照片F(xiàn)ig.10 Linear relationships between POV and absorbance of corn oil (A),peanut oil (B),sunflower oil (C),rapeseed oil (D) and soybean oil (E)

2.6.2 Fe3O4@COOH納米酶比色檢測不同氧化方式油樣的POV

經(jīng)過3 種氧化方式（紫外燈照射、烘箱加熱、自然放置）的油樣的POV分別為0.32、0.28、0.29，吸光度分別為0.577 9、0.568 3、0.599 1（圖11）。在POV較為穩(wěn)定的情況下，經(jīng)過3 種不同氧化方式的油樣的吸光度穩(wěn)定在0.58左右，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為4.56%、6.14%、5.82%，表明所構建的基于Fe3O4@COOH納米酶的比色檢測方法，適用于不同方式氧化的食用純植物油POV檢測。

圖11 不同氧化方式下的植物油吸光度與POVFig.11 Absorbance and POV of vegetable oil oxidized by different methods

2.6.3 實際樣品的檢測

采用所構建的比色法和滴定法（國家標準方法），分別對5 種未知氧化程度的食用純植物油（玉米油、花生油、葵花籽油、菜籽油、大豆油）進行POV的測定。結果表明（表3），兩種方法的檢測結果接近，差值均在0.05以下，不影響最終結果的判定。此外，5 種油樣的POV，兩種測定方法的RSD分別為6.13%、5.84%、6.82%、3.62%、5.75%。這說明本研究構建的比色法具有良好的準確度，可用于純植物油中POV的定量檢測。

表3 不同方法測定食用油的POVTable 3 POV of oil samples measured by different methods

圖12為實際食用油樣品反應后的顏色（在國家標準中規(guī)定的食用植物油POV限定值（0.25 g/100 g）附近）。玉米油、花生油、葵花籽油、大豆油反應后色澤均為藍色，雖然菜籽油反應后見少許原油顏色，但并未影響其在652 nm波長處的吸光度。

圖12 食用油反應后顏色Fig.12 Color changes of edible oil after reaction

3 結論

本研究基于Fe3O4@COOH納米酶的類POD催化活性，建立了檢測食用純植物油POV的比色法。所制備的Fe3O4@COOH納米酶，對H2O2和TMB具有強親和力，在4 ℃冷藏保存50 d仍表現(xiàn)出較強的催化活性，可重復使用。在最佳檢測條件下，5 種食用純植物油的POV（0～0.3 g/100 g）與其比色方法的吸光度具有良好線性關系。無論對未知POV的食用純植物油，還是對不同氧化方式（紫外燈照射、烘箱加熱、自然放置）處理后的食用純植物油，比色法均給出了準確的檢測結果，表明本研究構建的比色法對食用植物油POV測定具有良好的實用性。

本方法操作簡單、反應現(xiàn)象明顯，且所使用的Fe3O4@COOH納米酶具有超順磁性，只需施加外部磁場即可分離重復使用，檢測成本低，具有較大的實用前景。但Fe3O4@COOH納米酶容易受溫度影響，因此需進一步拓寬其溫度適用范圍。此外，人們飲食中也常用到調(diào)和油，如何將所建立的方法應用在調(diào)和油的POV測定中，也是未來需要研究的方向。